發酵石榴酒中非釀酒酵母菌的篩選及風味分析

摘 要：石榴果酒是石榴精深加工的一種產品，兼具石榴果實的清甜及酒的醇香，營養豐富，發展前景廣闊。參與發酵石榴果酒的酵母菌株與果酒風味物質的產生密切相關，良好的發酵菌株有助于石榴果酒形成穩定的色澤，豐富的風味層次。本研究以發酵石榴果酒為研究對象，采用培養基培養并富集目的菌株;通過GC-MS對發酵風味物質進行測定分析，并通過產物檢測篩選出一株具有優良發酵風味的法爾皮有孢漢生酵母（Hanseniaspora valbyensis），可用于石榴果酒的釀造生產，通過與商業釀酒酵母組合發酵生產的石榴果酒風味對比分析，前者風味物質含量明顯增多，香氣的復雜性和多樣性更為顯著。

關鍵詞：石榴酒;非釀酒酵母;菌株選育;風味

中圖分類號：TS262.7 文獻標志碼：A 文章編號：1008-1038（2024）03-0064-06

DOI：10.19590/j.cnki.1008-1038.2024.03.010

Screening and Flavor Analysis of Non-Saccharomyces Yeasts"in Fermented Pomegranate Wine

FAN Xiaoyu， LI Xiaomeng， ZHANG Luyuan， CHENG Yixin， HU Zhenchao， XU Na，"CHEN Yenan， WANG Xueshan*

（College of Food Science and Pharmaceutical Engineering， Zaozhuang University， Zaozhuang 271600， China）

Abstract： Pomegranate fruit wine is a product of deep processing of pomegranate， which combines the sweetness of pomegranate fruit and the mellow aroma of wine. It is nutritious and has broad development prospects. The yeast strains involved in the fermentation of pomegranate wine are closely related to the production of flavor compounds in the wine. Good fermentation strains help pomegranate wine form stable colors and rich flavor levels. This study focused on the fermentation of pomegranate fruit wine， using culture medium to cultivate and enrich the target strain. The fermentation flavor substances were determined and analyzed by GC-MS， and a strain of Hanseniaspora valbyensis with excellent fermentation flavor was screened through product detection. It could be used for the production of pomegranate wine. By comparing the flavor of pomegranate wine produced by combining commercial brewing yeast， the content of flavor substances in the former significantly increased， and the complexity and diversity of aroma were more significant.

Keywords： Pomegranate wine; non-Saccharomyces yeast; strain selection; flavor

石榴是一種兼具食用價值與藥用價值的經濟水果，屬于千屈菜科（Lythraceae）石榴屬（Punica L.）落葉喬木[1]，主要分布于熱帶和亞熱帶地區。其果肉晶瑩剔透，酸甜爽口，鮮美多汁，果肉中的多酚類物質具有延緩衰老、保護肝臟、預防癌癥等作用[2-4] ，且石榴中的抗氧化物質如花青素、鞣花酸等成分，可降低骨關節炎等慢性疾病的發病率[5]，這些藥理作用均在《本草綱目》和《圖經本草》等古代藥學著作中有所記載[6]。經大力種植和擇優培育，現今世界石榴種質資源已達上千種[7]。中國是世界上石榴種質資源最多，產量最大的地區之一，在山東棗莊、安徽懷遠和陜西臨潼等地區均有大規模種植[8]。雖然石榴具有豐富的營養成分和清爽的口感風味，但近年來，我國石榴精深加工技術卻沒有得到進一步發展，仍有大量鮮果在采收后出現機械損傷，導致果實軟化腐爛等問題從而造成大量浪費。石榴不易長期貯存，且運輸成本較大，導致石榴在主產區價格相對低廉，而在低溫非產區（如東北地區）價格較高，因此研發耐貯存、易運輸的石榴產品具有一定的現實意義。目前，對石榴資源的開發利用主要是石榴果酒、石榴汁和石榴糕點等，其中石榴酒不僅保留了石榴鮮果的原有營養物質[9]，而且還豐富了色氨酸等生物活性成分和醇類、酸類、醛類等風味物質，提高了石榴的附加值[10]。

石榴酒是以新鮮石榴為原料，由釀酒酵母發酵而成的低酒精度飲料酒。酵母菌將石榴本身的糖分分解為酒精，其風味物質主要來源于果實本身含有的和發酵過程中微生物代謝產生的物質[11]，因而選育優良的釀造石榴酒酵母菌尤為重要。近幾年對石榴酒的釀造研究主要集中在工藝方面的優化[12-13]，發酵過程的呈香成分分析[14]和石榴酒的口感、滋味[15]等方面多為早期研究成果，如李蘭等[10]篩選了石榴酒酵母;劉玉瓊等[16]對新疆石榴酒的專用酵母進行了選育。國內關于石榴酒釀酒酵母的篩選有多方面的研究，如朱玉章等[12]篩選發現WY-T21酵母發酵生成的石榴酒中高級醇含量最低;Berenguer等[17]發現Viniferm PDM酵母在發酵溫度較低時可以有效抑制石榴酒中花色素的降解。非釀酒酵母富產酯類和多種酶類，對石榴酒風味影響較大，但是關于石榴酒非釀酒酵母篩選聯合風味分析的研究卻相對匱乏。因此，本試驗以棗莊‘大紅袍石榴’為材料，分離篩選出適合作為石榴酒發酵劑的酵母菌，并對分離菌株的生物學特性及其發酵的石榴酒風味進行評價，以期為實現定向接種、人工控制發酵生產提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

石榴為棗莊冠世榴園的新鮮、成熟度一致、無機械損傷的‘大紅袍石榴’。

75%乙醇、葡萄糖（無水），分析純;瓊脂糖凝膠、酵母浸出粉蛋白胨葡萄糖（YPD）培養基（添加0.15‰氯霉素）、馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養基，均購自國藥集團化學試劑有限公司。

高壓滅菌鍋，DGL-50B，江蘇登冠醫療器械有限公司;生化培養箱，LRH-250F，上海一恒科學儀器有限公司;恒溫培養振蕩器，BSD-WX2200，上海博迅醫療生物儀器股份有限公司;凝膠成像系統，Gel Doc XR System，美國伯樂生命醫學產品（上海）有限公司;氣相色譜-質譜聯用儀，GC-MS 6890-5975，美國Agilent科技公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 發酵菌株的初篩

用無菌水沖洗掉石榴皮表面的雜質，瀝干水后，稱取25 g加到無菌均質袋中，再加入225 mL滅菌PBS溶液（pH 7.2）中，均質30 s后，把10 μL PBS溶液接種到500 mL YPD液體培養基中，放入恒溫培養振蕩器里，將接種后的培養液在200 r/min、30 ℃的條件下震蕩培養24～30 h。待菌株活化完成后，吸取10 μL均勻涂布于PDA固體培養基中，30 ℃培養48～72 h。培養結束后挑取生長狀況良好、菌落形態不一的單菌落，將其接種到PDA培養基上進一步劃線培養，反復純化，在同一PDA固體培養基平板內，觀察菌落的大小、形狀、顏色、隆起、表面狀況、質地、光澤一致，即可確定為純菌[18]。

1.2.2 發酵菌株的復篩

將石榴洗凈去皮后榨汁，調節石榴汁總糖含量為14 g/L，總酸含量為3.4 g/L。石榴汁先加0.1%維生素C護色，再加0.2%果膠酶、60 mg/L焦亞硫酸鉀10 μL，然后降酸。用試管分裝石榴汁，每支10 mL。

每支試管中接種0.3 mL待測菌液，接種后的石榴汁在26 ℃下進行發酵實驗，發酵到沒有氣泡后停止。進行感官評定[19]，篩選出石榴果香氣息突出且風味層次豐富的風味活性菌株作為潛在發酵菌株。

1.2.3 菌株形態學觀察

對完成分離純化后在PDA培養基上得到的菌株進行菌落特征觀察，將研究的6株菌株依次命名為PG1～PG6，通過觀察菌落各種特征來對菌株進行區分，并明確菌株所屬的大類[20]，如觀察菌落大小、顏色、邊緣規則程度和挑起性、細胞形態等。

1.2.4 菌株分子生物學鑒定

將菌株接種于YPD液體培養基中，在30 ℃、200 r/min的條件下放入恒溫培養振蕩器內搖瓶培養24 h，然后提取菌株DNA。

PCR引物：真菌通用引物ITS1（5'- TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'）和ITS2（5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'）。

PCR擴增：在50.0 μL聚合酶鏈式反應（poly-merase chain reaction，PCR）體系中，加上、下游引物ITS1和ITS2各2.0 μL，Taq酶25.0 μL，細菌DNA 1.0 μL，ddH2O 20.0 μL。

PCR反應條件：95 ℃預變性3 min，95 ℃變性15 s，56 ℃退火15 s，72 ℃延伸1 min，30個循環，最后72 ℃延伸10 min。

凝膠電泳：1%瓊脂糖凝膠，1×TAE電泳緩沖液，核酸染料（Gengreen）10 μL，PCR產物進樣量5 μL。

將條帶清晰的PCR擴增產物送至天津市武清開發區安升達金唯智測序部進行測序。通過美國國家生物信息技術中心（National Center of Biotechnology Information，NCBI），將測序結果在數據庫中進行同源性搜索，下載相似性高的模式菌株的相應基因序列[21]，用MEGA 5.1構建目標菌株的系統發育樹，獲得目標菌株的分類學地位或系統發育地位[22]。

1.2.5 揮發性化合物成分檢測

調節石榴汁總糖含量為14 g/L，總酸含量為 3.4 g/L，SO2含量60 mg/L，250 mL 三角瓶分裝石榴汁，每瓶200 mL，在115 ℃滅菌 15 min。石榴汁先加0.1%維生素C護色，再加0.2%果膠酶，利用輕質碳酸鈣降酸，調節pH為3.3～3.5。

商業釀酒酵母組SC：活化后按照說明書加入石榴汁中。PG1組：YPD培養基（加氯霉素）活化，按照石榴汁體積的3%接種。SC+PG1組：將SC與PG1按照1∶1比例接種入石榴汁中發酵。

接種后的石榴汁在26 ℃下進行主發酵，約7 d結束主發酵，直至無起泡現象。主發酵后，將酒腳分離，然后進行后發酵。將石榴酒轉入15 ℃培養箱進行后發酵，發酵20 d，后發酵結束。發酵后對發酵液的各個理化指標進行檢測，按照《GB/T 15038—2006葡萄酒、果酒通用分析方法》[23]進行。采集發酵過程中發酵1、3、7、10、15、27 d的石榴汁樣品，每次每個三角瓶取10 mL，存入離心管中。取完后立即離心，收集上清液單獨保存于-40 ℃冰箱中待測。

取8 mL發酵液加入頂空瓶（20 mL，預先加入3 g NaCl）中，加入20 μL L-薄荷醇（100 μg/mL）為內標，采用內標法檢測揮發性化合物的含量。采用氣相色譜-質譜法檢測揮發性物質成分[24]。

2 結果與分析

2.1 發酵菌株的確定

從石榴皮中分離純化到6株菌（見圖1），通過發酵菌株篩選實驗，菌株PG1與菌株PG6符合發酵菌株篩選標準[25-26]，確定為潛在發酵菌。

觀察菌落的顏色和邊緣的規則程度，參照GB 4789.15—2016《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗霉菌和酵母菌計數》[26]對菌株進行初步鑒定。由圖1可知，6株菌株菌落形態均呈乳白色，圓潤，凸起，但邊緣規則程度和挑起性有較大差別，再通過顯微鏡觀察其細胞形態為橢圓狀，綜合菌落特征和細胞形態可以初步判斷PG1、PG6為酵母菌。兩株潛在發酵菌株培養菌落形態特征見表1。

如表1所示，在PDA培養基上，PG1菌株呈圓形、白色、致密;PG6菌株在PDA培養基上的菌落為圓形、乳白色、凸起、邊緣整齊、不透明。

2.2 菌株分子生物學鑒定

以目標菌株的DNA為模板，經PCR擴增出的16S rDNA序列，PG1序列大小為671 bp;PG6序列大小為659 bp。利用MEGA 5.1軟件構建系統發育樹，從系統樹可知，菌株均與有孢漢生酵母菌親緣關系最近。然后將PG-1、PG-6的DNA序列與NCBI數據庫中的序列進行比對，通過序列比對發現菌株PG1與Hanseniaspora valbyensis（NR 111113.1）相似性最高，為100.00%;菌株PG6與Hanseniaspora mollemarum（NR168169.1）相似性為96.36%。由此可確定PG1菌為法爾皮有孢漢生酵母（Hanseniaspora valbyensis），命名編號為PG1，其系統發育樹如圖2所示。

2.3 揮發性化合物成分分析

酯類物質、醇類物質是石榴果酒中最主要的風味成分來源。發酵結束時，石榴酒中酯類物質的種類最多，其次是醇類物質[27-28]。其中，酯類物質是一類具有花香、果香和酒香等芳香性氣味的化合物，是果酒中重要的風味成分之一，其含量與比例影響酒體的風格[29];醇類物質主要由釀酒酵母在釀造的主發酵時間段生成，能夠增加酒的融洽度和豐滿度，賦予果酒特殊的香氣，并起到了襯托酯香的作用，令人產生愉悅感[13]。

由系統發育樹鑒定，菌株PG1可確定為法爾皮有孢漢生酵母，因此檢測接種PG1菌株和接種商業釀酒酵母中的發酵產物，并分別對發酵產物進一步分析，分析方法采用GC-MS技術檢測石榴酒中的風味物質，各成分含量如表2所示。由表可得出，與傳統商業酵母釀造出的石榴酒相比，經PG1酵母發酵的石榴酒中具有明顯的花果香（蘋果香、菠蘿香）的乙酸乙酯（CH3COOC2H5）[30]，可以提高煙氣柔和度、細膩度，增加果香和酒香香韻的3-甲基丁酸乙酯（C7H14O2），能增加果酒的甜度，回味和豐滿度的2，3-丁二醇（C4H10O2）、具有玫瑰花香和桂花香的2-苯乙酸乙酯（C10H12O2）、具有玫瑰香和愉悅氣味的苯乙醇（C6H5-CH2CH2OH）[31]、具有蘋果香和玫瑰香的壬酸乙酯（C11H22O2）[32]和具有新鮮水果青香香氣的乙酸-2-苯乙酯（C10H12O2）的含量明顯增多;具有花香、果香、甜味、蜂蜜香氣的庚酸乙酯（CH3COO（CH2）6CH3）[33]的含量略有增多。其中乙酸乙酯含量提高了2.3倍，3-甲基丁酸乙酯含量提高了1.8倍，2，3-丁二醇含量提高了2倍，尤其是乙酸-2-苯乙酯含量增加17倍。上述物質都可以增加石榴酒中的風味物質，改善石榴酒品質。

經PG1酵母發酵的石榴酒中2-甲基丙醇（CH3CH（CH3）CH2OH）、3-甲基丁醇（C5H12O）、1-己醇（C6H14O）等高級醇含量相比于用傳統商業酵母釀造的酒中含量明顯減少。它可以有效地防止石榴酒中高含量的高級醇產生難聞的氣味。同時，也可以防止由于高級醇在人體內的新陳代謝速度慢，停留時間長而造成的引用者易“上頭”等對人體健康造成損害的現象[34]。

因此酵母篩選試驗對生產出更高品質、更具芳香性的石榴果酒具有重要意義[35]。

3 結論

本研究以產生的風味物質含量作為評價指標，從棗莊‘大紅袍石榴’表皮中分離篩選出一株潛在發酵菌株（PG1），經分子生物學鑒定為法爾皮有孢漢生酵母。采用GC-MS技術檢測石榴酒中的風味物質后發現，經PG1釀造后產生的醇類物質、醛類物質、酚類物質和芳香族化合物高于商業釀酒酵母組，而且經PG1釀造后產生的風味層次、水果香味也高于商業釀酒酵母組。PG1具有良好的產香性能，而且有效避免了因酒中高級醇含量過高而導致的不良后果，為生產更高品質的果酒提供一種新思路。

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基金項目：山東省自然科學基金青年項目（ZR2020QC229）

第一作者簡介：范曉宇（2001—），女，在讀本科，專業為食品科學與工程

*通信作者簡介：王雪山（1987—），男，副教授，博士，主要從事發酵工程方面的教學與研究工作