生物炭輸入對臍橙園酸性土壤固氮細菌群落結構的影響

摘 要：廣西柑橘園酸性土壤分布廣泛、氮轉化具有特殊性，生物炭常用于該區土壤改良，然而生物炭輸入對該土壤固氮微生物群落的影響尚不清楚。該研究以廣西臍橙園酸性土壤固氮細菌群落為研究對象，通過高通量測序及生信分析發現該土壤中的固氮菌群落覆蓋8門15綱28目39科50屬的微生物。變形菌門在生物炭處理后相對豐度增加，OTU數目、Ace指數、Chao指數在生物炭輸入量5%的組最高，但各組間差異不顯著。PcoA分析顯示生物炭輸入顯著改變土壤固氮細菌群落結構，且變化程度與生物炭輸入量有關。土壤pH、NH4+-N含量、礦化率是影響臍橙園酸性土壤固氮細菌群落結構的主要環境因子，固氮細菌不同種群對環境因子的響應并不一致。

關鍵詞：臍橙；生物炭；nifH；固氮菌群落；多樣性

中圖分類號：S666 文獻標志碼：A 文章編號：2096-9902（2024）19-0018-04

Abstract： Biochar is commonly used for soil amendment in citrus orchards across Guangxi， where acidic soils are prevalent and nitrogen transformation is characterized by its specificity. However， the impact of biochar application on the microbial communities involved in nitrogen fixation remains unclear. This study focused on the microbial communities of nitrogen-fixing bacteria in the acidic soils of navel orange orchards in Guangxi. Through high-throughput sequencing and bioinformatics analysis， it was found that the nitrogen-fixing microbial community in these soils encompasses 50 genera within 39 families， 28 orders， 15 classes， and 8 phyla. The relative abundance of Proteobacteria increased following biochar treatment， and the highest OTU numbers， Ace index， and Chao index were observed in the group with a 5% biochar input， although differences in diversity indices among groups were not significant. PcoA and NMDS analyses demonstrated that biochar application significantly altered the structure of the soil nitrogen-fixing bacterial community， with the degree of change being related to the amount of biochar added. Soil pH， NH4+-N content， and mineralization rate were identified as the main environmental factors influencing the structure of the nitrogen-fixing bacterial community in the acidic soils of navel orange orchards， with different populations of nitrogen-fixing bacteria responding differently to environmental factors.

Keywords： navel orange; biochar; nifH; nitrogen-fixing microbial community; diversity

臍橙在我國種植面積大，存在氮肥用量大和土壤酸化問題。生物炭可以通過改變參與氮轉化過程的土壤微生物的數量和結構來改變土壤氮循環[1]。在酸性土壤中，生物炭能提升土壤肥力、臍橙產量和品質[2]。固氮菌是可以將空氣中的氮氣（N2）轉化為活性氮的土壤微生物，其固氮作用是土壤氮循環的重要組成部分，有助于土壤中植物有效氮的積累，最大程度地減少農業無機氮肥的使用[3]。然而，生物炭輸入對臍橙園土壤微生物固氮過程的影響目前仍不清楚。本研究以廣西臍橙園酸性土壤為研究對象，系統研究不同量生物炭輸入條件下土壤固氮菌群落結構和多樣性的差異特征及與環境因子的關系。為臍橙園酸化土壤改良及驅動機制提供參考，為深入了解和調控臍橙園酸性土壤固氮菌群落提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 土壤與生物炭準備

試驗用土壤采集于廣西壯族自治區賀州市富川縣。在臍橙樹滴水線4個方向分別采集0～20 cm 土壤并混勻。去除樹根和石頭后過2 mm土壤篩，用于土壤培育。生物炭購自河南弘之源凈水材料有限公司。該生物炭為黑色粉末狀，pH約8.35，有機碳771.90 g·kg-1，全氮1.50 g·kg-1。

1.2 土壤培育試驗

土壤培育設5個處理，生物炭添加量分別為0（CK），1%（B1），2%（B2），5%（B3），10%（B4）。各處理3次重復。稱取相當于25 g干土的土壤/土壤-生物炭混合物置于培養瓶中，用去離子水調整培養土含水量為80%WHC。每瓶用帶6針孔封口膜封口靜置，于27 ℃生化培養箱中黑暗培養28 d，每2 d稱重法補充水分。

1.3 測定方法

1.3.1 土壤參數的測定

在0、7、14、28 d取土樣置于-80 ℃保存，用于測定土壤理化參數及nifH基因多樣性。其中，土壤和生物炭的pH、有機碳、全氮、銨態氮（NH4+-N）和硝態氮（NO3--N）委托廣西西大檢測有限公司測定。通過 DNeasy Power Soil 土壤DNA提取試劑盒（QIAGEN，美國）、提取土壤DNA。氣相色譜儀（Agilent7890B，美國）測定培養瓶中N2O的濃度計算N2O排放速率。

1.3.2 nifH基因高通量測序

土壤微生物總DNA提取后，使用nifH基因引物（nifH-F：5′-AAAGGYGGWATCGGYAARTCCACCAC-3′和nifH-R：5′-TTGTTSGCSGCRTACATSGCCATCAT-3′）進行PCR 擴增，NEXTFLEX Rapid DNA-Seq Kit建庫，MiseqPE300平臺測序。測序得到的PE reads首先根據overlap關系進行拼接，同時對序列質量進行質控和過濾，區分樣本后進行OTU聚類分析和物種分類學注釋，在各個分類水平上采用Shannon、Chao、Coverage和Ace指數對固氮菌群落結構多樣性進行分析。

1.4 數據處理

高通量測序結果通過上海美吉生物醫藥科技有限公司生信云平臺提供的軟件完成。

2 結果

2.1 生物炭輸入對固氮菌群落組成的影響

nifH基因高通量測序所得有效序列按最小樣本序列抽平后共劃分OTU 2 425條，注釋結果顯示該臍橙園酸性土壤含有nifH基因的固氮菌群落共有8門15綱28目39科50屬（圖1）。在門水平上，norank_d__Bacteria在生物炭輸入組中高于對照組，unclassified_d__Unclassified和Firmicutes在生物炭輸入量為1%、2%、5%的組中高于對照組。屬水平TOP5的優勢屬包括細菌門未分類屬（unclassified_k__norank_d__Bacteria）、α-變形菌綱未分類屬（unclassified_c__Alphaproteobacteria）、根瘤菌目未分類屬（unclassified_o__Rhizobiales）、變形菌門未分類屬（unclassified_p__Proteobacteria）和γ-變形菌綱未分類屬（unclassified_c__Gammaproteobacteria）。其中，unclassified_p__Proteobacteria和unclassified_c__Gammaproteobacteria隨著生物炭輸入量增加呈雙峰增長趨勢，生物炭輸入量為5%時相對豐度最低，各組間差異顯著。

2.2 生物炭輸入對固氮菌群落α多樣性的影響

生物炭輸入土壤并培育28 d后，對照組（afterCK）土壤固氮細菌OTU數量最低，生物炭輸入量為2%（afterB2）時OTU數量最高。生物炭處理前后共有固氮細菌OUT數量為277條，生物炭輸入不同處理組特有的固氮細菌OTU數量由多到少排序為B2（207）、B4（167）、B1（157）、B3（153）、CK（101）。生物炭輸入后引起了不同種類土壤固氮細菌相對豐度的變化。生物炭輸入不同處理組間土壤固氮細菌α多樣性指數反應了各組間OTU的豐富度和均勻度（圖2）。培育后輸入量為2%的afterB2組固氮細菌OTU豐富度和均勻度都較高，α多樣性最大，但組間差異不顯著。

2.3 生物炭輸入對固氮細菌群落β多樣性的影響

主坐標分析（PCoA）表明生物炭輸入量超過5%后，固氮細菌群落結構變化較大，土壤培育前后固氮細菌群落發生了一定的變化，組間差異均極顯著，表明生物炭輸入改變了臍橙園酸性土壤固氮細菌群落結構，且變化程度與生物炭輸入量有關（圖3（a））。

2.4 固氮細菌群落結構與環境因子的關系

固氮細菌群落結構與土壤環境因子的冗余分析（RDA）結果（圖3（b））表明，RDA1和RDA2分別解釋固氮菌群落變異的49.58%和11.18%，共解釋總變異的60.76%。土壤pH、NH4+-N含量、礦化率與土壤固氮菌群落排列正相關，NO3--N含量、N2O排放速率、硝化率與土壤固氮菌群落結構負相關。其中，pH是影響臍橙園酸性土壤固氮細菌群落結構的最主要環境因子（pH=0.016）。固氮細菌不同種群對環境因子的響應并不一致，具有各自的生態位。

3 討論

變形菌門的相對豐度在一定程度上反映土壤有機質等養分含量的多少，且在pH較高的土壤中生長較好[4]。本研究中變形菌門相對豐度以生物炭輸入量為5%的處理最高，可能與土壤有機碳含量及pH較高有關。固氮細菌不同分類水平對環境因子的響應并不一致，同門不同屬細菌具有各自的生態位。本研究發現2%生物炭處理時，土壤培育后固氮細菌的OTU數量和多樣性指數最高。這可能表明存在一個最優的生物炭輸入量，能夠最大化促進固氮細菌的多樣性。本結果表明冗余分析能夠有效地解釋臍橙園酸性土壤固氮細菌群落大部分的變異（60.76%），揭示了土壤環境因子對固氮菌群落結構的影響，并發現土壤pH是影響固氮細菌群落結構的最主要環境因子之一，是微生物活性和多樣性的關鍵調控因素。生物炭輸入提高了臍橙園酸性土壤pH，增加了屬水平根瘤菌、α-變形菌、慢生根瘤菌相對豐度。

氮素形態也是影響固氮細菌群落結構的重要因素，研究發現NH4+-N與固氮細菌群落結構正相關，而NO3--N與之負相關，這種情況可能是因為高濃度的NO3--N對某些固氮細菌具有毒性，或者是因為硝化過程增加了土壤中的氧氣濃度，從而抑制了厭氧或微氧環境中某些固氮細菌的活性。

總之，生物炭輸入顯著改變了臍橙園酸性土壤固氮細菌群落結構，且變化程度與生物炭輸入量有關。土壤固氮細菌群落的結構和功能受到多種土壤環境因子的綜合影響，不同種群對環境因子的響應各不相同[5]。這種多樣性和復雜性是固氮細菌群落適應環境變化、維持生態系統功能的關鍵因素。了解這種復雜的相互作用對于預測和調控環境變化對固氮過程的影響、制定有效的土壤管理策略以促進固氮和提高農業生產力至關重要。

4 結論

該土壤中的固氮菌群落覆蓋了8門15綱28目39科50屬的微生物。變形菌門在生物炭處理后相對豐度增加，但各組間差異不顯著。生物炭輸入顯著改變了土壤固氮細菌群落結構，土壤pH、NH4+-N含量、礦化率是影響臍橙園酸性土壤固氮細菌群落結構的主要環境因子。

參考文獻：

[1] XIAO Z， RASMANN S， YUE L， et al. The effect of biochar amendment on N-cycling genes in soils： A meta-analysis[J].The Science of the total environment，2019（696）：133984.

[2] 蔣惠，郭雁君，張小鳳，等.生物炭對砂糖桔葉果和土壤理化性狀的影響[J].生態環境學報，2017，26（12）：2057-2063.

[3] 謝祖彬，張燕輝，王慧.稻田生物固氮研究進展及方向[J].土壤學報，2020，57（3）：540-546.

[4] ZHANG Y， CONG J， LU H， et al. An integrated study to analyze soil microbial community structure and metabolic potential in two forest types[J]. PloS one，2014，9（4）：e93773.

[5] SEPP S K， VASAR M， DAVISON J， et al. Global diversity and distribution of nitrogen-fixing bacteria in the soil[J]. Frontiers in plant science，2023（14）：1100235.