逍遙散及其拆方對Erastin誘導的LO-2肝細胞系鐵死亡的影響

〔摘要〕 目的 探討逍遙散及其拆方對Erastin誘導肝細胞鐵死亡的影響及機制。方法 使用鐵死亡誘導劑Erastin誘導肝細胞LO-2鐵死亡，用逍遙散及各功效拆方（逍遙散去疏肝藥組、逍遙散去健脾藥組、逍遙散去養血藥組）的含藥血清進行干預，陽性對照藥使用鐵死亡抑制劑Ferrostatin-1。通過CCK-8檢測細胞活力，ELISA法檢測細胞上清液中谷丙轉氨酶（alanine aminotransferase，ALT）、谷草轉氨酶（aspartate aminotransferase， AST）水平，比色法檢測細胞中丙二醛（malondialdehyde， MDA）、還原型谷胱甘肽（reduced glutathione， GSH）、Fe2+等含量，熒光酶標儀檢測脂質過氧化活性氧（reactive oxygen species， ROS），RT-PCR檢測細胞中谷胱甘肽過氧化物酶4（glutathione peroxidase 4， GPX4）、前列腺素內過氧化物合酶2（prostaglandin-endoperoxide synthase 2， PTGS2）、鐵調素（hepcidin）、膜鐵轉運蛋白（ferroportin， FPN1）mRNA表達，Western blot檢測細胞中骨形態發生蛋白6（bone morphogenetic protein 6， BMP6）、鐵調素調節蛋白（hemojuvelin， HJV）、Smad同源物4（mothers against decapentaplegic homolog 4， SMAD4）蛋白表達。結果 erastin誘導肝細胞鐵死亡后，細胞活力較對照組顯著下降（P<0.05），細胞外上清液中ALT、AST含量顯著上升（P<0.05），細胞中MDA、ROS、Fe2+、PTGS2與hepcidin mRNA表達及BMP6/HJV/Smad4信號通路蛋白顯著上升（P<0.05），GSH含量及GPX4、FPN1 mRNA表達顯著下降（P<0.05）。除逍遙散去養血藥組在Smad4蛋白表達方面與模型組無顯著差異（P>0.05），逍遙散及各功效拆方及陽性對照藥Ferrostatin-1均能顯著逆轉上述指標的變化（P<0.05）。與整方組療效比較，逍遙散去疏肝藥組AST、MDA、GSH、ROS、Fe2+、BMP6、hepcidin、FPN1指標具有顯著差異（P<0.05）；除逍遙散去健脾藥組在Smad4蛋白表達方面與整方組無顯著差異（P>0.05），逍遙散去健脾藥組及逍遙散去養血藥組對所檢測指標均有顯著改善（P<0.05）。結論 逍遙散可抑制Erastin誘導的肝細胞鐵死亡，其機制可能與調控 BMP6/HJV/SMAD4 信號通路及其下游 hepcidin-ferroportin 軸有關，而逍遙散各功效拆方均在一定程度上參與了逍遙散抑制肝細胞鐵死亡的過程。

〔關鍵詞〕 逍遙散；鐵死亡；Erastin；hepcidin-ferroportin軸；BMP6/HJV/Smad4信號通路；丙二醛；過氧化活性氧

〔中圖分類號〕R285.5 〔文獻標志碼〕A 〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674－070X.２０24.09.007

Effects of Xiaoyao Powder and its disassembled formulas on Erastin-induced ferroptosis in hepatocyte LO-2 cell line

CAO Mengxing1， LI Yong2， QUE Renye1

1. Department of Spleen and Stomach Diseases， Shanghai Hospital of Integrated Chinese and Western Medicines of Shanghai University of Chinese Medicine， Shanghai 200082， China; 2. Department of Spleen and Stomach Diseases， Shanghai Hospital of Chinese Medicine of Shanghai University of Chinese Medicine， Shanghai 200071， China

〔Ａｂｓｔｒａｃｔ〕 Objective To explore the effects of Xiaoyao Powder and its disassembled formulas on Erastin-induced ferroptosis in hepatocytes and the related mechanism. Methods Ferroptosis of hepatocyte LO-2 was induced by Erastin and intervened by the medicated serum of Xiaoyao Powder and its disassembled formulas （Xiaoyao Powder without liver-soothing medicines， Xiaoyao Powder without spleen-strengthening medicines， Xiaoyao Powder without blood-nourishing medicines）. Ferroptosis inhibitor Ferrostatin-1 was used as the positive control drug. The cell viability was evaluated by CCK-8. The levels of alanine aminotransferase （ALT） and aspartate aminotransferase （AST） in the cell supernatant were examined by ELISA， and the content of malondialdehyde （MDA）， reduced glutathione （GSH）， and Fe2+ in the cells were determined by colorimetry. Fluorescence enzyme-linked immunosorbent assay was used to check lipid peroxidation-related reactive oxygen species （ROS）， RT-PCR was used to examine the mRNA expressions of glutathione peroxidase 4 （GPX4）， prostaglandin-endoperoxide synthase 2 （PTGS2）， hepcidin， and ferroportin （FPN1） in the cells， and Western blot was used to check the expressions of bone morphogenetic protein 6 （BMP6）， hemojuvelin （HJV）， and mothers against decapentaplegic homolog 4 （Smad4） protein in the cells. Results After ferroptosis induced by Erastin， the viability of hepatocytes decreased significantly compared with the control group （P<0.05）; the content of ALT and AST in the extracellular supernatant increased significantly （P<0.05）; the contents of MDA， ROS， and Fe2+， the mRNA expressions of PTGS2 and hepcidin， and the protein level of BMP6/HJV/Smad4 signaling pathway in the cells increased significantly （P<0.05）， while the content of GSH and the mRNA expressions of GPX4 and FPN1 decreased significantly （P<0.05）. Except for the group of Xiaoyao Powder without blood-nourishing medicines showing no significant difference in Smad4 protein expression compared with the model group （P>0.05）， groups of Xiaoyao Powder and its disassembled formulas， as well as the positive control drug Ferrostatin-1 showed significant reversed changes in the aforementioned indicators （P<0.05）. There were significant differences in AST， MDA， GSH， ROS， Fe2+， BMP6， hepcidin and FPN1 between Xiaoyao Powder without liver-soothing medicines group and Xiaoyao Powder group （P<0.05）. Compared with Xiaoyao Powder， the group of Xiaoyao Powder without spleen-strengthening medicines showed no significant difference in Smad4 protein expression （P>0.05）， while both groups of Xiaoyao Powder without spleen-strengthening medicines and Xiaoyao Powder without blood-nourishing medicines showed significant differences in the detected indicators （P<0.05）. Conclusion Xiaoyao Powder can inhibit Erastin-induced ferroptosis in hepatocytes， and its mechanism may be related to the regulation of BMP6/HJV/Smad4 signal pathway and its downstream hepcidin-ferroportin axis. To some extent， each disassembled formula of it involves in the process of inhibiting ferroptosis in hepatocytes.

〔Ｋｅｙｗｏｒｄｓ〕 Xiaoyao Powder; ferroptosis; Erastin; hepcidin-ferroportin axis; BMP6/HJV/Smad4 signaling pathway; malondialdehyde; reactive oxygen species

鐵在機體內參與細胞增殖、氧氣運輸和儲存、DNA修復、維持造血功能、增強免疫等生理功能[1-2]，是構成血紅蛋白、肌紅蛋白等許多蛋白質的主要成分，是人體不可缺少的微量元素之一。機體具有嚴格的鐵調控機制來維持鐵穩態，一般是通過食物吸收及循環鐵來保證足量的鐵發揮其生理效應，又能防止鐵過量產生毒性[3]。肝臟是鐵貯存主要場所之一，鐵過載時會使細胞發生ATP水平降低、氧化應激損傷、溶酶體功能減退、細胞內鈣穩態的破壞、DNA的損傷，最終導致肝細胞壞死。庫普弗細胞可被肝臟過多的鐵激活，將其內吞至細胞中，分泌細胞因子、ROS等活化肝星狀細胞[4]，導致細胞外基質的沉積，促使肝纖維化發生。

細胞內過多的鐵可引起細胞損傷，在很長的一段時間內研究者們將鐵過載引起的細胞死亡歸因于氧化應激誘導的細胞壞死，而DIXON等[5]首次發現并報道了一種新型細胞死亡方式鐵死亡（ferroptosis）后，為鐵代謝紊亂疾病研究領域指引了新的方向。鐵死亡是一種依賴于脂質過氧化反應驅動的非凋亡性細胞死亡方式，其發生過程需要細胞內富含可利用的鐵。鐵死亡是一個全新的細胞死亡模式，它在形態學、生物化學及遺傳學方面與凋亡、焦亡、自噬等有著明顯的不同。在形態學方面，發生鐵死亡的細胞主要表現為線粒體體積縮小，雙層膜密度增加，線粒體嵴減少或消失[5-6]。在生化方面，谷胱甘肽（reduced glutathione， GSH）耗竭，GPX4活性下降，脂質氧化物不能經GPX4催化的GSH還原反應代謝，繼而二價鐵離子以類似芬頜反應的方式氧化脂質產生大量過氧化活性氧（reactive oxygen species， ROS），促使細胞發生鐵死亡[5-6]。

逍遙散出自《太平惠民和劑局方·卷九·治婦人諸疾》，具有疏肝、健脾、養血作用[7-8]，臨床上多用于治療慢性肝臟疾病。方中柴胡順肝之性，使之不郁[9]，為君藥。因肝藏血，肝血不足導致肝之疏泄功能失常，白芍收斂肝陰并養血柔肝體，柴胡配白芍而無傷陰之弊；當歸能夠養血和血，與白芍并用，可以增強補養陰血的功效，白芍、當歸為臣藥。柴胡、白芍、當歸三藥并用，達到補肝體而助肝用之效。方中薄荷可疏散肝經郁遏之氣，透達肝經之郁熱[10]；茯苓及白術二味藥均可健脾祛濕，恢復脾的運化功能，從而使氣血生化有源；炙甘草益氣和中，緩肝之急；煨生姜能辛散達3osNKEC6+2kflIroybfTBw==郁，五味藥共為佐藥。八藥合用，相輔相成，使肝郁可舒，血虛可養，脾虛可復，神明可安[11]，共奏疏肝解郁、健脾和營之效。鐵代謝與血液形成有關，如《靈樞·決氣》云：“中焦受氣取汁，變化而赤，是謂血也。”《素問·六節臟象論篇》載：“肝……其充在筋，以生血氣。”這些描述充分說明了脾胃主運化及肝主疏泄的作用在人體化生血液過程中的重要作用。肝主疏泄藏血，脾胃收納水谷，賴肝氣疏泄得以輸布精微。脾胃與肝臟在鐵的吸收轉運及參與血液生成中都發揮極重要的作用，臨床上一些患者因肝失疏泄，脾失運化，不能將鐵通過血液循環轉運至造血器官，沉積于肝臟導致纖維化的發生。故認為鐵代謝紊亂原因之一是肝失疏泄、脾失運化，治療上應著重“疏肝健脾”[12]。

逍遙散是臨床上多用于治療慢性肝臟疾病，具有疏肝健脾養血功效的方劑[12]。本課題組前期研究發現，恩替卡韋聯合逍遙散治療肝郁脾虛型乙型肝炎肝硬化患者的鐵過載優于單用恩替卡韋[12]。本實驗研究擬構建肝細胞鐵死亡模型，觀察逍遙散抑制鐵死亡的效果及機制，以及逍遙散疏肝、健脾、養血3個功效發揮的作用。

1 材料與方法

1.1 細胞來源和試劑

LO-2細胞系購買于復旦大學IBS細胞庫。丙二醛（malondialdehyde， MDA）（批號：A003-1-2）、還原型谷胱甘肽（reduced glutathione， GSH）比色法試劑盒（批號：A006-2-1）購自南京建成生物科技有限公司；辣根酶標記山羊抗鼠IgG（批號：GB23301）、辣根酶標記山羊抗兔IgG（批號：GB23303）購自賽維爾生物公司；β-actin抗體（Cell Signaling Technology公司，批號：4970S）；RIPA裂解液（批號：P0013B）、PMSF蛋白酶抑制劑（批號：ST506）、1.5M Tris-HCl（pH8.8）（批號：ST789）、1.0M Tris-HCl（pH6.8）（批號：ST768）、10%SDS（批號：ST628）、四甲基乙二胺（批號：ST728）、Western blot一抗二抗稀釋液（批號：P0023）、BCA蛋白濃度測定試劑盒（批號：P0009）、SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液（5×）（批號：P0015）、脫脂奶粉（批號：P0216）、超敏ECL化學發光試劑盒（批號：P0018S）均購自上海碧云天生物技術有限公司；PVDF膜（美國Millipore公司，批號：IPFL07810）；DMEM培養基（江蘇凱基生物科技有限公司，批號：KGM12800-500）；逆轉錄試劑盒（日本Takara公司，批號：RR047A）；去鐵胺（上海源葉生物科技有限公司，批號：B70140）。

1.2 實驗動物

清潔級雄性SD成年大鼠購于上海斯萊克實驗動物有限責任公司[SCXK（滬）2013-0016]，飼養于上海市中醫醫院動物房清潔級大鼠飼養室，飼養環境是恒溫（25±2） ℃、濕度50%～80%，自由攝食、飲水。本動物實驗遵循“實驗動物關愛和使用指南”，已通過上海市中醫醫院實驗中心動物實驗倫理與福利委員會審核，倫理號：2020333。

1.3 含藥血清制備

稱取逍遙散（柴胡15 g、白芍15 g、當歸15 g、白術15 g、茯苓15 g、甘草7.5 g），加水1 500 mL煮沸，保持沸騰20 min，加入薄荷和煨姜，繼續煎煮10 min，煎煮液過5層紗布，濾液濃縮至2 g/mL（按生藥量計），經冷凍干燥制成粉末，以蒸餾水配制成混懸液。逍遙散各拆方組按逍遙散去疏肝藥組（去柴胡、薄荷）、逍遙散去養血藥組（去當歸、白芍）、逍遙散去健脾藥組（去茯苓、白術、甘草） 混懸液制作方法同上。按大鼠體質量10 mL/kg灌胃給藥，鐵死亡抑制劑Ferrostatin-1用濃度為2.5 μmol/kg的水溶液（10 mL/kg）灌胃給藥，對照組予灌胃等量蒸餾水。每天給藥1次，連續7 d。實驗期間自由攝食、飲水。末次給藥24 h后，腹主動脈采血，以6 000 r/min×10 min冷凍離心，收集上清液，將收集好的血清于56 ℃水浴中滅活30 min，0.22 μm濾膜過濾滅菌，-80 ℃凍存備用。

1.4 細胞分組及干預

用含有10%熱滅活胎牛血清的DMEM完全培養基在37 ℃、5% CO2完全飽和濕度條件下常規培養，每48 h更換培養基，細胞生長鋪滿培養瓶底80%后，用0.25%胰蛋白酶聯合0.02% EDTA消化傳代，實驗選用對數生長期細胞。將LO-2細胞接種于細胞培養板中，分為對照組、模型組、逍遙散全方組、逍遙散去疏肝藥組、逍遙散去健脾藥組、逍遙散去養血藥組、Ferrostatin-1組。對照組加DMEM完全培養基，模型組采用鐵死亡誘導劑Erastin（5 μmol/L）進行造模，其他藥物組添加相應藥物進行干預，各組干預24 h后行相應指標檢測。

1.5 檢測指標及方法

1.5.1 肝細胞細胞活力、功能及鐵死亡指標檢測 使用CCK-8檢測各組細胞活力；采用ELISA法檢測各組細胞上清液中谷丙轉氨酶（alanine aminotransferase， ALT）、谷草轉氨酶（aspartate aminotransferase， AST）的含量，使用比色法檢測MDA、GSH含量，均按照試劑說明書操作進行。

1.5.2 脂質過氧化ROS檢測 PBS充分清洗藥物干預后的細胞，加入1 mL探針工作液充分覆蓋細胞，于37 ℃避光孵育10 min，再用預熱的PBS輕洗細胞3次；用10 μg/mL濃度的Hoechst 33342工作液1 mL充分覆蓋細胞，于37 ℃避光孵育30 min，用預熱的PBS輕洗細胞3次，加入2 mL/孔細胞培養液；置于熒光酶標儀或熒光顯微鏡，于激發波長為488～535 nm、發射波長610 nm檢測熒光強度，ROS結果以熒光度值表示。

1.5.3 LO-2肝細胞BMP6/HJV/Smad4信號通路蛋白表達檢測 使用PMSF的（強）RIPA裂解液提取細胞蛋白，BCA蛋白試劑盒檢測蛋白含量。以SDS-PAGE凝膠進行電泳分離蛋白，并轉移至0.45 μm孔徑的PVDF膜。用脫脂奶粉與含TBST配制5%脫脂奶粉封閉液，條帶浸沒在封閉液中室溫慢搖3 h。封閉完成后，用TBST漂洗3次，每次5 min，使用TBST配制適合濃度的一抗，將目標條帶浸沒于BMP6、HJV、Smad4、β-actin抗體中，4 ℃孵育過夜，用TBST漂洗。使用TBST配制適合濃度的HRP標記二抗，將目標條帶浸于二抗中，避光室溫慢搖孵育1 h。用TBST漂洗后，ECL顯色液覆蓋全膜，最后應用Bio-Rad ChemiDocTM XRS+系統與Image Lab軟件曝光。

1.6 LO-2肝細胞GPX4、PTGS2及hepcidin-ferroportin軸mRNA表達檢測

采用RT-PCR法檢測：按步驟提取各組細胞總RNA，測各樣本RNA濃度及純度。在無核酸酶的離心管中每個樣本加入1 μg RNA樣本，5×g DNA digester Mix 2 μL，gDNA Eraser 1 μL， RNase freeH2O補足至10 μL，42 ℃水浴加熱2 min；在上述10 μL體系中加入反轉錄試劑，反應條件：37 ℃，15 min，85 ℃，5 s，得到的 cDNA -20 ℃保存備用。然后進行熒光定量PCR實驗，引物見表1。在無核酸酶的離心管中加入TB Green Premix Ex Taq 10 μL，加上下游引物各0.4 μL，加入第1步得到的cDNA模板2 μL，ddH2O補足至20 μL，混勻，實時上機檢測。反應條件：95 ℃ 30 s預變性，95 ℃ 5 s變性，60 ℃ 30 s 退火，同時收集熒光，40個循環。用相對表達量=2-△△Ct公式分析計算各個組的表達情況。

1.7 統計學方法

采用Image J軟件、SPSS 24.0軟件進行統計學作圖、分析，數據采用“ｘ±s”表示，組間比較采用單因素方差分析，均采用雙側檢驗，P<0.05被認為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 逍遙散及其功效拆方對Erastin誘導的LO-2肝細胞細胞活力及功能的影響

與對照組比較，模型組細胞活力顯著下降，細胞外上清液中ALT、AST含量顯著上升（P<0.05）。逍遙散全方及各拆方組干預后細胞活力顯著上升，ALT、AST含量顯著下降，陽性對照藥物具有相似的作用（P<0.05）。與全方組比較，逍遙散去疏肝藥組細胞活力和ALT指標無顯著差異（P>0.05），AST顯著降低（P<0.05）；逍遙散去健脾藥組和逍遙散去養血藥組細胞活力、ALT、AST 3個指標療效均顯著降低（P<0.05）。詳見表2。

2.2 逍遙散及其功效拆方對Erastin誘導的LO-2肝細胞鐵死亡的影響

相較于對照組，模型組細胞中MDA及ROS顯著上升（P<0.05），GSH顯著下降（P<0.05）。逍遙散全方及各拆方組干預后可顯著降低細胞中MDA、ROS含量，提高GSH含量（P<0.05），陽性對照藥物具有相似的作用（P<0.05）。與全方組比較，3個拆方組在改善MDA、ROS、GSH三者方面療效均顯著降低（P<0.05）。詳見表3。

與對照組比較，模型組細胞中Fe2+含量及PTGS2 mRNA表達顯著上升，GPX4 mRNA表達顯著下降（P<0.05）。逍遙散全方及各拆方組干預后可顯著降低細胞中Fe2+含量及PTGS2 mRNA表達顯著下降，GPX4 mRNA表達顯著上升，陽性對照藥物具有相似的作用（P<0.05）。與全方組療效比較，逍遙散去疏肝藥組在改善Fe2+含量方面療效降低（P<0.05），在改善PTGS2、GPX4 mRNA表達方面無顯著差異（P>0.05）；逍遙散去健脾藥組與逍遙散去養血藥組在改善Fe2+、GPX4及PTGS2三者方面療效均顯著降低（P<0.05）。詳見表4。

2.3 逍遙散及其功效拆方對Erastin誘導的LO-2肝細胞BMP6/HJV/Smad4信號通路的影響

相較于對照組，模型組細胞中BMP6/HJV/Smad4信號通路蛋白表達顯著上升（P<0.05）。逍遙散全方組、逍遙散去疏肝藥組、逍遙散去健脾藥組及陽性對照藥物干預后均可顯著降低細胞中BMP6/HJV/Smad4信號通路蛋白表達（P<0.05），逍遙散去養血藥組可顯著減低細胞中BMP6、HJV蛋白表達（P<0.05），但對Smad4蛋白表達無顯著影響（P>0.05）。與全方組比較，逍遙散去疏肝藥組BMP6蛋白表達水平降低（P<0.05），對HJV及Smad4蛋白表達無顯著差異（P>0.05）；逍遙散去健脾藥組BMP6、HJV蛋白表達水平降低（P<0.05），Smad4蛋白表達水平無顯著性差異（P>0.05）。逍遙散去養血藥組在改善BMP6/HJV/Smad4信號通路蛋白表達方面療效均顯著降低（P<0.05）。詳見圖1、表5。

2.4 逍遙散及其功效拆方對Erastin誘導的LO-2肝細胞hepcidin-ferroportin軸的影響

與對照組比較，模型組細胞中hepcidin mRNA表達顯著上升，FPN1 mRNA表達顯著下降（P<0.05）。逍遙散全方組及各拆方組干預后可顯著降低細胞中hepcidin mRNA表達，提高FPN1 mRNA表達，陽性對照藥物具有相似的作用（P<0.05）。與全方比較，3個拆方組在改善hepcidin-ferroportin mRNA表達方面療效均顯著降低（P<0.05）。詳見表6。

3 討論

在遺傳學方面，對于鐵死亡的發生及調控機制的研究尚處于起始階段，鐵死亡是多基因調控的。目前認為，細胞內Fe2+的蓄積及GPX4活性抑制是Lipid-ROS生成并誘導鐵死亡發生的兩個關鍵因素。HSC能攝取膜鐵轉運蛋白從庫普弗細胞轉運到細胞外的鐵。通過細胞的轉鐵蛋白受體1（TfR1）連接含三價鐵的轉鐵蛋白，將三價鐵轉化為HSC可儲存的鐵[13]。研究發現，大量的鐵沉積于肝組織可形成HSC活化的外環境，會促進肝纖維化的發展，甚至導致肝硬化的發生[14]。Ferrostatin-1作為一種特異性鐵死亡抑制劑，可通過抑制ROS蓄積降低脂質過氧化作用，保護Erastin誘導的鐵死亡[15]。有研究發現，利用高鐵蓄積的血色病小鼠模型發現高鐵蓄積小鼠肝臟可發生顯著的肝細胞鐵死亡，而通過缺鐵飼料或Ferrostatin-1清除鐵死亡能明顯改善肝纖維化等鐵過載引發的病理損傷，提示鐵過載可能是通過誘導肝細胞發生鐵死亡進而活化肝星狀細胞引起肝纖維化的發生[16]，而抑制肝細胞鐵死亡可逆轉肝纖維化的進展[17]。

鐵調素是肝細胞分泌的HAMP基因編碼的肽類物質，鐵調素在缺氧、炎癥、鐵過載等情況下可通過調節小腸對鐵的吸收、巨噬細胞對鐵的回收以及肝細胞對鐵的儲存來調節機體鐵水平[18-19]。hepcidin與鐵輸出蛋白FPN1結合，誘導FPN1內化及降解作用，抑制FPN1向外轉運細胞內鐵，導致細胞內鐵過載，并調節十二指腸對鐵的吸收以及巨噬細胞對鐵的循環再利用[12，20]。近年研究發現，hepcidin受很多因素的調節，如機體鐵的營養狀況、炎癥、貧血和缺氧均可影響hepcidin的表達變化。其中研究最多且與肝臟關系較密切的有兩條：即貧血，缺氧，鐵過載通過BMP6/HJV/Smad4信號通路在肝臟實現調節hepcidin的表達；炎癥通過IL-6/JAK2/STAT3信號通路在肝臟、巨噬細胞促進hepcidin的表達，同時BMP6/HJV/Smad4信號通路可以協同增強IL-6/JAK2/STAT3信號通路。

本研究提出假說逍遙散通過疏肝健脾功效抑制肝細胞鐵死亡，機制可能與調控BMP6/HJV/Smad4及其下游hepcidin-ferroportin軸有關。因此，設置鐵死亡抑制劑Ferrostatin-1為陽性對照藥物，觀察逍遙散及其拆方對肝細胞LO-2鐵死亡的影響。實驗結果表明，逍遙散可抑制LO-2肝細胞系的鐵死亡，主要表現在降低Fe2+與鐵死亡標志物MDA、ROS、PTGS2的含量，上調GSH含量及GPX4的表達，降低細胞脂質過氧化作用，緩解細胞鐵死亡的發生。通過進一步檢測鐵過載通路BMP6/HJV/Smad4及hepcidin-ferroportin軸，發現逍遙散可以降低鐵調素hepcidin及其上游通路BMP6/HJV/Smad4的表達，上調膜鐵轉運蛋白ferroportin的含量，從而促進機體對鐵的回收與儲存來減輕鐵過載。通過拆方實驗，將逍遙散拆分為逍遙散去疏肝藥、逍遙散去養血藥以及逍遙散去健脾藥3組，發現與逍遙散全方療效相比，逍遙散去疏肝藥、逍遙散去健脾藥及逍遙散去養血藥在改善肝細胞活力、功能及鐵死亡方面均有明顯差異，如逍遙散去健脾藥在改善Erastin誘導的肝細胞細胞活力及功能下降的療效，低于逍遙散全方；逍遙散去養血藥在改善鐵死亡標志物MDA、ROS、GSH、PTGS2、GPX4及Fe2+含量的療效，低于逍遙散全方；逍遙散去疏肝藥在改善鐵死亡通路蛋白BMP6及hepcidin-ferroportin的表達，低于逍遙散全方。說明逍遙散全方無論去除疏肝藥、養血藥或健脾藥均對其抑制肝細胞鐵死亡的療效有影響，提示逍遙散疏肝、養血以及健脾的功效都參與了機體鐵代謝的平衡。

逍遙散調控鐵過載通路BMP6/HJV/Smad4及其下游hepcidin-ferroportin軸，抑制肝細胞鐵死亡，其疏肝、養血、健脾功效均參與了這個過程，為探索逍遙散治療肝病提供了新的靶點和思路。課題組前期研究發現，在改善肝郁脾虛型乙肝肝硬化患者肝纖維化方面，逍遙散聯合恩替卡韋療效優于單用恩替卡韋，聯合用藥改善患者鐵過載水平[12]。逍遙散可改善慢性鐵過載誘導的大鼠肝纖維化，方中疏肝藥、健脾藥、養血藥均對改善鐵過載及肝纖維化有一定作用[21]。但逍遙散治療肝纖維化的分子機制仍需進一步研究。本次研究結果不僅完善了逍遙散組方功效的理論認知，更為逍遙散調節機體鐵代謝提供了實驗基礎，為中藥復方的臨床使用提供了基礎醫學的理論依據。

綜上所述，逍遙散可抑制Erastin誘導的肝細胞鐵死亡，其機制可能與調控BMP6/HJV/Smad4信號通路及其下游hepcidin-ferroportin軸有關，而逍遙散各功效拆方均在一定程度上參與了逍遙散抑制肝細胞鐵死亡的過程。

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本文引用： 曹夢醒， 李 勇， 闕任燁. 逍遙散及其拆方對Erastin誘導的LO-2肝細胞系鐵死亡的影響[J]. 湖南中醫藥大學學報， 2024， 44（9）： 1601-1607.

〔收稿日期〕2023-07-10

〔基金項目〕國家自然科學基金項目（81873157，81573775）；上海市科學技術委員會科研計劃項目（19YF1445200）；上海市虹口區衛生健康委員會中醫藥科研基金項目（HKQGYQY-ZYY-2022-08）。

〔通信作者〕*闕任燁，男，博士，主治醫師，E-mail：824492@qq.com。