腦多肽對PCPA誘導的睡眠障礙小鼠5-羥色胺系統和腸道菌群的影響

摘" 要：為探究腦多肽對昆明小鼠睡眠和腸道菌群的影響，通過小鼠神經遞質含量和氧化應激水平的變化，分析腸道菌群與睡眠之間的聯系.腹腔注射對氯苯丙氨酸（PCPA）建立睡眠障礙模型，連續灌胃給藥7 d，通過戊巴比妥鈉睡眠協同實驗、懸尾和明暗箱實驗以及小鼠神經遞質和氧化應激水平的變化，分析腦多肽對睡眠障礙小鼠鎮靜催眠功能的影響；蘇木精-伊紅染色法（Hamp;E）和糖原染色法（AB-PAS）觀察小鼠海馬及結腸組織病理變化；收集糞便，進行16S rRNA基因測序，分析小鼠腸道菌群豐度的變化.結果表明：腦多肽高、低劑量組小鼠睡眠時間顯著增加，睡眠潛伏期顯著縮短，MDA含量顯著降低，5-HT、GABA、MT含量、GSH-Px和SOD酶活均顯著升高（Plt;0.05）；小鼠海馬CA1區神經元細胞排列整齊，胞核固縮深染現象改善，結腸組織中炎癥細胞浸潤減少；腦多肽高劑量組擬桿菌門豐度顯著升高，乳桿菌屬、雙歧桿菌屬豐度顯著升高（Plt;0.05），擬桿菌屬豐度與GSH-Px的變化趨勢呈顯著正相關，乳桿菌屬豐度與5-HT、MT、SOD的變化趨勢呈顯著正相關（Plt;0.05）.腦多肽通過調節腸道菌群正向調節血清內神經遞質和腦組織氧化應激水平，有效治療PCPA誘導的小鼠睡眠障礙癥狀，隨著劑量增加治療效果明顯提高.

關鍵詞：腦多肽；5-羥色胺；腸道菌群；氧化應激；睡眠障礙

中圖分類號：R917""" 文獻標志碼：A""" 文章編號：10001565（2024）05048312

DOI：10.3969/j.issn.10001565.2024.05.005

Effects of brain peptides on 5-hydroxytryptamine system and intestinal flora in PCPA induced sleep disorder mice

HUANG Xinran， WANG Linna， DAI Jiaqi， SONG Nannan， ZHOU Chengyan

（Key Laboratory of Pharmaceutical Quality Control of Hebei Province， College of Pharmacy Sciences， Hebei University， Baoding 071002， China）

Abstract： This work studied the impact of brain peptide （BP） on sleep and intestinal microbiota in mice， and analyzed the relationship between intestinal microbiota and sleep through changes in neurotransmitter content and oxidative stress levels in mice. The insomnia model was established by peritoneal injection of p-chlorophenylalanine （PCPA）， which was administered via continuous gavage for 7 days. The sedative and hypnotic effects of brain peptides on insomniac mice were analyzed by using a pentobarbital sodium sleep coordination test， tail suspension test（TST），light and dark box test （LDB）， along with measurements of

收稿日期：20240404;修回日期：20240518

基金項目：

河北省自然科學基金資助項目（H2020201291）；貴州醫科大學省部共建藥用植物功效與利用國家重點實驗室資助項目（FAMP202006K）

第一作者：黃欣然（2003—），女，河北大學在讀碩士研究生，主要從事睡眠疾病菌群相關研究以及藥物分析方向研究.E-mail：huang18132083386@163.com

通信作者：周程艷（1976—），女，河北大學副教授，主要從事代謝組學、菌群、脂質組學以及相關藥理作用機制研究.E-mail：xuefanone@163.com

neurotransmitter levels and oxidative stress markers. Hematoxylin-eosin staining （Hamp;E） and glycogen staining （AB-PAS） were used to observe histopathological changes in the hippocampus and colon of mice. The stool was collected and 16S rRNA gene was sequenced to analyze the changes of intestinal flora abundance in mice. Compared with the model group， the sleep latency of mice in the high-dose and low-dose brain polypeptide groups was significantly shortened， and the sleep time was significantly increased. MDA content decreased significantly， 5-HT， GABA and MT content， the enzyme activity of GSH-Px and SOD increased significantly in high-dose brain polypeptide group（Plt;0.05）. The neuronal cells in CA1 region of hippocampus of mice were arranged neatly， the phenomenon of nuclear shrinkage and deep staining was improved， and the infiltration of inflammatory cells in colon tissue was reduced. 16S rRNA results showed that compared with the model group， the abundance of Bacteroidetes was significantly increased in the high-dose BP group at the phylum level， and the abundance of Lactobacillus and Bifidobacterium at the genus level was significantly increased （Plt;0.05）. Pearson correlation analysis showed that the abundances of Bacteroides was positively correlated with the trends of GSH-Px， and the abundances of Lactobacillus was positively correlated with the trend of 5-HT， MT and SOD （Plt;0.05）. Brain polypeptide can effectively treat PCPA induced insomnia in mice by regulating intestinal flora and positively regulating serum neurotransmitter and brain tissue oxidative stress level， and the therapeutic effect is better with the increase of dose.

Key words： brain polypeptide；5-hydroxytryptamine；intestinal flora；oxidative stress；somnipathy

睡眠是中樞神經系統調節下機體周期性、反復性的生理活動，在恢復體力、維持身體生存、保護腦功能以及正常生理活動方面發揮重要作用［1］.當睡眠-覺醒機制出現異常時，機體就會發生睡眠障礙，發生一系列睡眠和覺醒狀態相關的以睡眠過多或不足為主要表現的疾病.睡眠障礙已成為中國社會公共衛生問題，中國有近4億人患有睡眠障礙，睡眠障礙機制問題亟待解決［2］.研究表明，睡眠-覺醒周期主要受中樞神經系統調控，而這一過程涉及中樞神經系統與腸道菌群等微生物的復雜相互作用.機體中通過腦-腸軸的免疫、神經調節和內分泌，達到調控睡眠的目的.研究證實機體發生睡眠障礙時會出現晝夜節律紊亂和睡眠不足，進而產生生理壓力并且能夠改變腸道菌群豐度和腸道通透性［3］，提示中樞神經系統與睡眠之間存在復雜聯系，這種聯系在入睡前后腸道微生物的活動、腸道菌群的變化之中可以顯現［4-5］.

動物大腦中含有多種具有神經調節功能的腦多肽（BP），它們在調節神經網絡和促進神經信息傳遞中發揮著極為重要的作用.從豬中提取的腦組織勻漿制備的腦多肽注射液具有保護中樞神經系統免受侵害、改善記憶系統、促進大腦成熟、提高腦組織抗缺氧能力等作用［6］.本實驗主要以豬源腦多肽為研究對象，探究是否能夠通過調節腦-腸軸改善睡眠.

為進一步探究腦多肽能否通過腦-腸軸機制調控腸道菌群改善相關神經遞質調節睡眠，本研究通過分析腦多肽營養液對睡眠障礙小鼠睡眠相關生理指標的影響，采用16S rRNA基因測序技術分析正常組（NC），模型組（INS），腦多肽高、低劑量組（BP、BP-L）小鼠腸道菌群的變化，探究睡眠障礙的發生與腸道菌群之間的聯系.

1" 材料

1.1" 實驗動物

18～22 g的雄性SPF級KM小鼠購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，實驗動物許可證編號：SCXK（京）2021-0011.

1.2" 藥品與儀器

腦多肽營養液（河北智同生物制藥有限公司，批號20220601）；艾司唑侖（規格：1 mg/片，上海信誼藥廠有限公司，生產批號20200619）；對氯苯丙氨酸（PCPA，上海麥克林生化科技有限公司，批號C14214611）；谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px） 測定試劑盒、總超氧化物歧化酶（SOD）測定試劑盒、丙二醛（MDA）測定試劑盒（南京生物建成工程研究所）；小鼠5-羥色胺（5-HT）和褪黑素（MT）和γ-氨基丁酸（GABA）的酶聯免疫吸附測定試劑盒（武漢酶免生物科技有限公司，批號均為202307）.

高速冷凍離心機（上海盧湘儀離心機儀器有限公司）；高速低溫組織研磨儀（武漢賽維爾生物科技有限公司）；YD-A2生物組織攤片機、YD-B生物組織烤片機、YD-6L生物組織包埋機、YD-335石蠟切片機（金華市益迪醫療設備有限公司）.

2" 方法

2.1" 動物分組、造模及給藥

適應性喂養7 d后，將50只雄性昆明小鼠隨機分為5組，為正常組（NC）、模型組（INS）、艾司唑侖組（SA）、腦多肽高劑量組（BP）、腦多肽低劑量組（BP-L），每組10只.除正常組外其余小鼠建立睡眠障礙模型，于每日早晨8—9點連續3 d腹腔注射PCPA混懸液（300 mg/kg，10 mg/mL）.當小鼠出現坐立不安、躁動、日間活動增加等現象，表明造模成功［7］.對造模成功的小鼠于次日上午開始給藥，連續7 d，劑量設計與分組見表1.實驗過程觀察記錄小鼠每日攝食量、攝水量、體質量的變化、外貌及精神狀態等.實驗結束后，小鼠脫頸處死，眼眶取血，離心收集血清，低溫儲存備用，取出腦、肝、脾、腎、結腸，濾紙擦拭并稱量，根據公式計算相應臟器系數.臟器系數=臟器質量/小鼠體質量×100%.

2.2" 腦多肽對睡眠障礙小鼠行為學影響

2.2.1" 明暗穿梭箱實驗（LDB）

攝像記錄小鼠從箱體正中格開始5 min 內的行為，以及小鼠進入明箱次數、明箱停留時間；更換小鼠時，應提前清洗箱體地面及內壁，減少余留信息，減小實驗誤差［8］.

2.2.2" 懸尾實驗（TST）

用醫用膠帶將小鼠尾巴（距尾尖約1 cm）固定在掛鉤上，使小鼠頭自然垂下，頭距離地面約30 cm，用攝像設備正對小鼠，記錄5 min內小鼠的狀態.本實驗主要通過小鼠在懸掛狀態下不斷掙扎以及累計出現的間斷性相對靜止時間來評價小鼠的絕望狀態.實驗記錄了首次達到靜止狀態的時間，以及相對靜止期（特指四肢僅有小幅度抖動或完全靜止的狀態）的持續時間和占總觀察時間的百分比.

2.2.3" 腦多肽對睡眠障礙小鼠睡眠協同實驗的影響

末次給藥之后，進行戊巴比妥鈉睡眠協同實驗，同時評估造模和藥物干預效果.腹腔注射0.01 mL/g戊巴比妥鈉（55 mg/kg），通過翻正反射實驗，觀察并記錄小鼠睡眠潛伏期和睡眠持續時間［9］.

2.3" 腦多肽對睡眠障礙小鼠神經遞質含量及氧化應激水平的影響

采用 ELISA 試劑盒檢測血清中的GABA、5-HT、MT水平，檢測腦組織勻漿中MDA的含量和 SOD、GSH-px的酶活性.

2.4" 腦多肽對PCPA睡眠障礙小鼠組織病理學變化的影響

每組隨機抽取3只小鼠的結腸組織和腦組織，施行梯度脫水、常規石蠟包埋、切片，進行蘇木精和伊紅染色（H＆E），光學顯微鏡下觀察染色切片并拍照［10］.另外取結腸組織進行 AB-PAS 染色，進行組織病理學分析.

2.5" 腦多肽對睡眠障礙小鼠糞便16S rRNA基因測序的分析

采用隨機數字表法在3組中隨機挑選6只小鼠的糞便標本進行16S rRNA基因測序分析.設計16S rDNA V3-V4區域的引物，在Illumina平臺對群落DNA片段進行雙端測序，進一步對高質量測序數據解析生物信息［11］.

主要采用Chao1指數和Shannon指數進行Alpha多樣性分析，分析不同組別小鼠菌群均勻度和豐富度的變化；采用主坐標分析（principal coordinates analysis，PCoA）闡述Beta多樣性分析，評估不同組別菌群組成和分布的相似性與差異性；繪制門、屬水平群落結構堆疊圖，比較各組腸道菌群種類與豐度，進行LEfSe分析尋找差異菌群；采用冗余分析法，闡述血清中神經遞質、腦組織中氧化應激水平與腸道菌群的關系，進一步采用Spearman相關系數繪制關聯網絡分析圖及關聯熱圖，精確呈現菌群與睡眠相關因子的關系.

2.6" 統計學分析

采用SPSS 26.0 統計軟件進行分析，計量資料以均數±標準差（x±s）表示.采用單因素方差分析法（One-way ANOVA）進行多組間分析、LSD法進行組間兩兩比較，P＜0. 05時具有統計學意義.

3" 結果

3.1" 腦多肽對睡眠障礙小鼠體質量、攝食量、攝水量及臟器的影響

實驗過程中NC組小鼠毛發、飲食、節律正常，具有良好精神狀態.腹腔注射PCPA 造模后，模型組小鼠白天活動減少，晝夜節律紊亂，毛發干枯，飲食減少.與造模前相比，除NC組外其余小鼠每日體質量顯著降低，各組小鼠攝水量、攝食量均顯著降低（Plt;0.05），造模成功.給藥最后1 d體質量與造模后體質量相比，BP組體質量為（20.15±2.13） g，SA組為（19.99±2.95） g，NC組為（20.56±1.48） g，均顯著增高，說明腦多肽給藥后，睡眠障礙小鼠體質量回升［6］.

與NC組相比，INS組小鼠腦和結腸臟器系數升高（P＞0.05）；與INS組相比，給藥后BP組小鼠腦組織和結腸組織系數均顯著降低（P＜0.05）（表2）.臟器外觀見圖1，INS組小鼠腸腔中有深紅色血便出現，同時伴有結腸腸壁變薄；BP組結腸炎癥稍微緩解，結腸顏色呈淡紅色，糞便基本成形，腸腔不再出血；腦多肽給藥在一定程度上可以有效緩解結腸炎癥，改善臟器狀態.

3.2" 腦多肽對睡眠障礙小鼠的行為及睡眠質量改善情況

實驗采用明暗箱實驗，評估藥物的抗焦慮和鎮靜作用［12］.腦多肽給藥后，BP、BP-L組明箱停留時間較模型組均顯著延長（Plt;0.05）（表3），表明腦多肽用藥后可以鎮靜催眠，減輕小鼠焦慮樣行為.懸尾實驗是最經典的評價藥物鎮靜催眠作用、抗抑郁作用、興奮性作用的動物行為學實驗方法之一，懸尾實驗不動時間延長也作為PCPA睡眠障礙小鼠模型評價標準之一［13］.與INS組相比，BP組的靜止狀態持續時間顯著縮短（Plt;0.05）（表3），隨著腦多肽給藥劑量增加，持續時間繼續縮短，說明腦多肽治療后，小鼠活動能力明顯改善，睡眠障礙絕望的行為減少［14］.

本研究根據《保健食品功能檢驗與評價方法》（2023版）中規定，睡眠協同實驗采用戊巴比妥鈉進行［15］.在戊巴比妥鈉（55 mg/kg）的誘導催眠下，與INS相比，BP組、BP-L組睡眠潛伏期均顯著降低（Plt;0.05），并且隨著腦多肽給藥量增加，睡眠動物數增加，小鼠睡眠潛伏期縮短，睡眠時間加長（表4），說明腦多肽（12 mg/kg）有改善睡眠的功能［5］.

3.3" 腦多肽對睡眠障礙小鼠血清內神經遞質、腦組織氧化應激水平的影響

與NC組相比，INS組小鼠血清內5-HT、MT、GABA的含量均顯著降低（Plt;0.05）（表5）.與INS組相比，BP組小鼠神經遞質中 5-HT、MT和GABA的含量顯著提升（Plt;0.05）.這與徐飛飛等［16］的研究結果一致，證明腦多肽有利于提高小鼠血清和神經遞質中5-HT、MT和GABA的含量.

與INS組相比（表5），BP、BP-L組小鼠腦組織中MDA的含量降低、GSH-Px、SOD 的酶活性升高（Plt;0.05）.這與李莉等［17］的研究結果一致，腦多肽能夠在改善睡眠相關神經遞質進而改善睡眠質量的同時降低腦組織中MDA含量、提高小鼠腦組織中GSH-Px、SOD 酶活性，改善小鼠氧化應激水平.提示腦多肽可調理睡眠障礙小鼠體內的氧化應激水平.

3.4" 腦多肽對睡眠障礙小鼠結腸及腦組織病理變化的影響

使用H＆E和AB-PAS 2種染色方法對小鼠結腸組織進行病理學觀察，和NC組相比，INS組小鼠結腸組織杯狀細胞減少，細胞炎癥浸潤明顯，炎癥癥狀明顯；和INS組相比，BP組結腸組織杯狀細胞排列較整齊，細胞炎癥浸潤減少，炎癥癥狀得到改善［18］.

睡眠障礙作為中樞神經系統疾病，與腦組織關系密切，其中，海馬體、大腦皮質、下丘腦作為中樞神經系統代表性腦區，與睡眠障礙相關性更強.海馬體是中樞神經系統的重要組成部分，在調節睡眠-覺醒過程中有十分重要的作用［19］，進行海馬區H＆E染色，觀察各組病理變化.NC組小鼠CA1區神經元細胞的排列規律整齊，未出現細胞核固縮現象；INS組海馬CA1區神經元排列十分不規則，并且伴隨出現嚴重的細胞核固縮現象；和INS組相比，BP組海馬區神經元細胞排列較為整齊規則，細胞核固縮現象減少（圖2），說明腦多肽在一定程度上改變小鼠結腸病理表征，有效改善了睡眠.

3.5" 腦多肽對睡眠障礙小鼠腸道菌群的影響

3.5.1" Alpha多樣性和Beta多樣性分析

平緩的 Alpha 多樣性稀釋曲線表明本實驗測序樣本足夠，測序結果能充分反映當前樣本所包含的微生物信息（圖3a）.Alpha多樣性是局部均勻生物環境下的物種在豐富度、多樣性和均勻度等方面的指標，本研究評估小鼠腸道菌群物種均勻、豐富度采用Shannon 和Simpson 指數，評估小鼠腸道菌群中包含物種的數目采用Chao1和Observed-species指數［5］.INS組的Chao1、Observed-species、Simpson 和Shannon指數顯現降低趨勢，BP組Observed-species、Simpson和Shannon指數呈現升高趨勢，但均無明顯差異（Pgt;0.05）（圖3b）.本實驗采用主坐標分析法反映Beta多樣性，睡眠障礙造模成功后，BP組小鼠腸道菌群的結構較正常組發生明顯變化，組間差異較大，說明腦多肽給藥后改變了睡眠障礙小鼠體內的腸道菌群，菌群多樣性發生變化（圖3c）.

3.5.2" 睡眠障礙小鼠腸道菌群分類學組成分析

16S rRNA 基因測序結果，3組小鼠腸道菌群共注釋到23個門，57個綱，91個目，150個科，244個屬，316個種［5］.在門水平上（圖4a），3組小鼠的優勢菌群為厚壁菌門（Firmicutes）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、放線菌門（Actinobacteria）和變形菌門（Proteobacteria）［5］.BP組的厚壁菌門相對豐度顯著降低，擬桿菌門相對豐度顯著升高（Plt;0.05）（表6）.屬水平上（圖4b），乳桿菌屬（Lactobacillus）、異桿菌屬（Allobaculum）、普雷沃氏菌屬（Prevotella）、雙歧桿菌屬（Bifidobacterium）、擬桿菌屬（Bacteroides）等占比較高［20］.INS組乳桿菌屬、異桿菌屬、雙歧桿菌屬相對豐度顯著性降低，BP組乳桿菌屬相對豐度顯著性升高（Plt;0.05）（表7）.

采用LEfSe（LDA Effect Size）分析尋找差異菌群，在屬水平上，BP組克雷伯氏菌屬（Klebsiella）、乳桿菌屬（Lactobacillus）、放線菌屬的Adlercreutzia菌群豐度具有顯著性差異變化，菌群豐度均表現升高（圖4c、4d）.

3.5.3" 血清中神經遞質、腦組織中氧化應激水平與腸道菌群的相關性分析

門水平上，擬桿菌門、放線菌門與5-HT、GABA、MT的含量及SOD、GSH-Px的酶活性呈正相關，與MDA的含量負相關［20］（圖5a）.屬水平上，乳桿菌屬、雙歧桿菌屬與5-HT、GABA、MT的含量及SOD、GSH-Px的酶活性呈正相關，與MDA呈負相關（圖5b）.相關性熱圖中，變形菌門與GABA、MT顯著正相關，乳桿菌屬與5-HT、MT、SOD、GSH-Px呈顯著正相關，擬桿菌屬與GSH-Px的變化趨勢呈顯著正相關，放線菌門與5-HT、MT、SOD、GSH-Px顯著正相關，雙歧桿菌屬與MDA、MT、GSH-Px顯著正相關（Plt;0.05）（圖5c、5d）.

4" 討論

睡眠發生是中樞神經系統的一個主動過程，發生睡眠障礙的物質基礎可能與睡眠-覺醒機制有關神經遞質含量的變化相關［21］.腸道菌群同時能夠對睡眠障礙產生影響［4］，微生物的代謝產物可能在其中發揮重要作用，一些細菌能產生多巴胺、血清素、乙酰膽堿、γ-氨基丁酸及其他類似神經系統的神經調節物質［22］.這類神經遞質中5-HT對調節睡眠、痛覺等生理功能有一定影響，MT分泌量直接影響睡眠質量和節律，GABA 是腦內最重要的抑制性神經遞質，能夠促進覺醒向睡眠轉化，正向調節神經遞質就能夠正向調節睡眠［22］.提示大腦與腸道微生物之間存在雙向性的關系，本文用微生物群-腸-腦軸的機制來探究睡眠機制（圖6）.

實驗通過腹腔注射PCPA制備睡眠障礙小鼠模型，睡眠障礙小鼠體質量呈下降趨勢，懸尾不動時間顯著增加，明箱停留時間縮短，戊巴比妥鈉誘導的協同睡眠實驗小鼠的睡眠潛伏期延長，睡眠維持時間縮短，提示PCPA誘導的睡眠障礙小鼠模型復制成功.腦多肽高劑量治療小鼠的5-HT、GABA、MT含量以及SOD、GSH-Px酶活性顯著性升高，MDA含量顯著性降低，提示腦多肽可能通過正向調節睡眠-覺醒神經遞質改善睡眠［16-17］.此外，腸道菌群在睡眠剝奪誘導的神經系統疾病中起關鍵作用［20］.腦多肽治療睡眠障礙小鼠腸道菌群Shannon指數和Chao1指數無顯著性差異，菌群總體多樣性無顯著性變化，但3組小鼠菌群組成上存在顯著性差異，腦多肽可能改善特定菌的豐度，對優勢菌群進一步分析，將有助于理解腦多肽的作用機制.

擬桿菌門、雙歧桿菌屬、乳桿菌屬是睡眠菌群研究中的常用指標，有學者發現睡眠剝奪后小鼠出現腸道擬桿菌門豐度減少，體內丁酸鹽增多的現象，提示擬桿菌與神經發育正相關，是人體有益菌［23-24］.同時在腸道菌群中，乳桿菌屬是維持腸道穩態的有益菌，連續 24 h 剝奪睡眠可降低小鼠乳桿菌屬的相對豐度［19］.乳桿菌屬豐度的增加不僅能改善睡眠障礙，同時能提高 5-HT 水平，推測乳桿菌屬能夠正向調節神經遞質改善睡眠［20］.菌群分類學組成表明，腦多肽可以增加擬桿菌門、雙歧桿菌屬、乳桿菌屬這3類菌的豐度，同時本實驗擬桿菌門與5-HT的變化趨勢呈正相關，乳桿菌屬與5-HT顯著性正相關.推測腦多肽可能上調擬桿菌、乳桿菌屬豐度，通過腦-腸軸調節腦內神經遞質含量，改善睡眠障礙（圖6）.

文獻［25］研究顯示，羅漢果提取物能夠通過調節血清內MDA、SOD濃度使機體恢復正常氧化平衡狀態，從而改善睡眠，這與本實驗結果一致.提示腦多肽可能通過調節氧化應激水平進行神經保護，改善睡眠.在研究黃芩素對腸道影響的報道中發現擬桿菌科可以減輕炎癥，抑制有害菌和氧化應激［26］.任璐婷等［27］在研究結腸炎癥時發現乳桿菌屬可以抑制促炎因子分泌緩解腸道炎癥，提示擬桿菌和乳桿菌豐度的增加可以改善氧化應激.腦多肽高劑量治療小鼠的SOD、GSH-Px酶活性顯著性升高，MDA含量顯著性降低，擬桿菌屬與MDA的變化趨勢呈正相關，乳桿菌屬與SOD酶活性呈顯著正相關，推測腦多肽可以在一定程度上通過改善菌群豐度，激活體內抗氧化酶SOD的活性，清除細胞內增多的過氧化產物MDA，正向調節氧化應激水平，進行神經保護，改善睡眠障礙.

5" 結論

本實驗通過腹腔注射PCPA造模，進行戊巴比妥鈉協同睡眠實驗證實造模成功.通過16Sr RNA基因測序以及相關神經遞質測定，推測腦多肽可能通過上調擬桿菌門、乳桿菌屬豐度，并利用腦-腸軸通路上調5-HT的含量、SOD活性，下調MDA含量改善小鼠睡眠.

參" 考" 文" 獻：

［1］" 郁阿翠，鐘云，阮曉東.腦腸肽在睡眠障礙中的作用研究進展［J］.新鄉醫學院學報， 2018， 35（3）： 248-251. DOI： 10.7683/xxyxyxb.2018.03.022.

［2］" KRAUS S S， RABIN L A. Sleep America： managing the crisis of adult chronic insomnia and associated conditions［J］. J Affect Disord， 2012， 138（3）： 192-212. DOI： 10.1016/j.jad.2011.05.014.

［3］" ISAIAH S， LOOTS D T， SOLOMONS R， et al. Overview of brain-to-gut axis exposed to chronic CNS bacterial infection（s） and a predictive urinary metabolic profile of a brain infected by Mycobacterium tuberculosis［J］. Front Neurosci， 2020， 14： 296. DOI： 10.3389/fnins.2020.00296.

［4］" REYNOLDS A C， PATERSON J L， FERGUSON S A， et al. The shift work and health research agenda： considering changes in gut microbiota as a pathway linking shift work， sleep loss and circadian misalignment， and metabolic disease［J］. Sleep Med Rev， 2017， 34： 3-9. DOI： 10.1016/j.smrv.2016.06.009.

［5］" 陳天賜，武少蘭，楊國輝，等.無柄靈芝醇提物對小鼠睡眠及腸道菌群的影響［J］.生物技術通報， 2022， 38（8）： 225-232. DOI： 10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2021-1470.

［6］" LIU Y T， CHENG F Y， TAKEDA S， et al. Effects of porcine brain hydrolysate on impairment of cognitive learning ability in amyloid β（1-40）-infused rats［J］. Anim Sci J， 2019， 90（2）： 271-279. DOI： 10.1111/asj.13054.

［7］" 龍盼，胡曉霞，胡琦蘭，等.天麻素對氯苯丙氨酸（PCPA）致失眠小鼠的鎮靜催眠作用研究［J］.中藥藥理與臨床， 2021， 37（5）： 33-38. DOI： 10.13412/j.cnki.zyyl.2021.05.007.

［8］" 謝懂君，吳旭玲，董楝，等.甘露特鈉對慢性癲癇大鼠認知功能障礙的影響［J］.中國神經精神疾病雜志， 2023， 49（6）： 351-356. DOI： 10.3969/j.issn.1002-0152.2023.06.006.

［9］" 姚玉靜，張書敏，任艷艷，等.酸棗仁提取物、龍眼肉提取物、γ-氨基丁酸和酪蛋白水解物復配制劑改善睡眠功能［J］.食品工業科技， 2023， 44（7）： 406-410. DOI： 10.13386/j.issn1002-0306.2022100103.

［10］" 劉玉鳳，黃枚，南麗紅，等.古方半夏秫米湯對正常小鼠最大給藥量及其對失眠模型大鼠作用的實驗研究［J］.中藥藥理與臨床， 2023， 39（8）： 12-18. DOI： 10.13412/j.cnki.zyyl.20230524.007.

［11］" 張振宇，米傳靚，李思迪，等.基于16S rRNA測序分析脂多糖結合蛋白基因敲除對小鼠腸道菌群的影響［J］.中國醫藥生物技術， 2023， 18（2）： 110-115. DOI： 10.3969/j.issn.1673-713X.2023.02.003.

［12］" 侯金良，張媛媛，張浩，等.沉香片劑小鼠口鼻吸入給藥抗焦慮和催眠功效實驗研究［J］.山東中醫藥大學學報， 2021， 45（1）： 113-119. DOI： 10.16294/j.cnki.1007-659x.2021.01.018.

［13］" 高榮靜，黃紅，姜寧，等.大豆異黃酮對脂多糖誘導小鼠抑郁樣行為的改善作用研究［J］.大豆科學， 2021， 40（4）： 539-545. DOI： 10.11861/j.issn.1000-9841.2021.04.0539.

［14］" 王瑞英，蘇丹，李惠珍，等.生、酒五味子對失眠小鼠神經-內分泌-免疫網絡的影響及機制［J］.中國藥房， 2023， 34（5）： 525-530. DOI： 10.6039/j.issn.1001-0408.2023.05.03.

［15］" 范恩宇，魏振華，范秋領，等.黑柄炭角菌（烏靈菌）粉改善睡眠作用以及對小鼠大腦神經遞質及其受體的影響［J］.菌物學報， 2022， 41（9）： 1498-1505. DOI： 10.13346/j.mycosystema.210491.

［16］" 徐飛飛，田雅娟，李欽青，等.酸棗仁-茯苓-黨參水提物對小鼠睡眠的改善作用及機制研究［J］.食品工業科技， 2021， 42（11）： 300-308. DOI： 10.13386/j.issn1002-0306.2020070005.

［17］" 李莉，劉茹，何晶，等.溫膽湯方劑對睡眠剝奪小鼠氧化應激及炎癥反應的影響［J］.中國免疫學雜志， 2022， 38（3）： 308-312. DOI： 10.3969/j.issn.1000-484X.2022.03.009.

［18］" 李欣益，劉春妍，黃建，等.益生菌V9對高脂飲食誘導的NAFLD大鼠肝功能、氧化應激及脂代謝的影響及作用機制［J］.中國免疫學雜志， 2019， 35（23）： 2822-2826. DOI： 10.3969/j.issn.1000-484X.2019.23.002.

［19］" 郭鵬.左旋丁基苯酞對血管性癡呆大鼠神經功能、線粒體氧化應激及海馬組織膠質細胞源性神經營養因子表達的影響［J］.中國老年學雜志， 2019， 39（6）： 1444-1447. DOI： 10.3969/j.issn.1005-9202.2019.06.052.

［20］" 刁華瓊，魏丹，丁海月，等.黃連阿膠湯對睡眠剝奪大鼠5-羥色胺系統和腸道菌群的影響［J］.中國實驗方劑學雜志， 2023， 29（21）： 49-58. DOI： 10.13422/j.cnki.syfjx.20231043.

［21］" 萬葉敏.基于腸-腦軸PI3K/AKT/mTOR自噬通路探討加味通便湯改善STC的臨床療效及作用機制［D］.南京：南京中醫藥大學， 2022. DOI：10.27253/d.cnki.gnjzu.2022.000029.

［22］" BEAR T L K， DALZIEL J E， COAD J， et al. The role of the gut microbiota in dietary interventions for depression and anxiety［J］. Adv Nutr， 2020， 11（4）： 890-907. DOI： 10.1093/advances/nmaa016.

［23］" 陳抒鵬，唐娜娜，王思夢，等.肝郁脾虛方對抑郁失眠模型大鼠結腸組織GABA能信號系統及腸道菌群的影響［J］.中醫雜志， 2023， 64（12）： 1273-1281. DOI： 10.13288/j.11-2166/r.2023.12.014.

［24］" 屈婉，劉碩，朱華偉，等.酸棗仁水提物對焦慮大鼠癥狀的改善及其對腸道菌群的影響［J］.現代食品科技， 2019， 35（11）： 30-36. DOI： 10.13982/j.mfst.1673-9078.2019.11.005.

［25］" 楊燁，徐興軍，李浩雨，等.羅漢果山柰苷對慢性睡眠剝奪小鼠抗氧化能力的影響［J］.動物營養學報， 2023， 35（12）： 8083-8096. DOI： 10.12418/CJAN2023.732.

［26］" 陳雪梅，胡博，唐曉姝，等.紫蘇籽油對小鼠腸道微生物及抗氧化能力的影響［J］.食品與發酵工業，2024，50（16）：271-277.DOI： 10.13995/j.cnki.11-1802/ts.037422.

［27］" 任璐婷，夏滿盈，羅瑞琳，等.蘋果發酵物對潰瘍性結腸炎小鼠腸道菌群的調節作用［J］.食品與發酵工業，2024，50（15）：33-40.DOI： 10.13995/j.cnki.11-1802/ts.039431.

（責任編輯：梁俊紅）