一種溶瘤腺病毒抑制腫瘤細(xì)胞的作用機(jī)制及特異性研究

摘 要 研究重組人5型腺病毒（H101）抑制腫瘤細(xì)胞增殖的作用機(jī)制及特異性。采用體外細(xì)胞培養(yǎng)方法及TCID50檢測(cè)病毒滴度法，發(fā)現(xiàn)H101對(duì)p53？的腫瘤細(xì)胞有顯著的選擇性復(fù)制作用，其活性可以對(duì)p53突變的腫瘤組織產(chǎn)生溶瘤作用從而達(dá)到治療效果；采用體外藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)H101對(duì)10種腫瘤細(xì)胞株的抑增殖作用，通過(guò)計(jì)算IC50、IC90進(jìn)一步得出小鼠肝癌細(xì)胞Hepa1-6、小鼠胰腺癌細(xì)胞Pan02、小鼠神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞GL261對(duì)H101較為敏感。研究結(jié)果表明H101對(duì)已獲批的適應(yīng)證之外的其他腫瘤細(xì)胞也有溶瘤作用，具有適應(yīng)證擴(kuò)展的潛力。本研究可為后續(xù)開(kāi)展動(dòng)物模型的體內(nèi)藥效實(shí)驗(yàn)和使用劑量的選擇提供參考。

關(guān)鍵詞 溶瘤腺病毒 腫瘤治療 體外藥效學(xué) 增殖抑制

中圖分類號(hào)：R979.19； R730.54 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1006-1533（2024）15-0065-04

引用本文 琚姝， 王愛(ài)霞. 一種溶瘤腺病毒抑制腫瘤細(xì)胞的作用機(jī)制及特異性研究[J]. 上海醫(yī)藥， 2024， 45（15）： 65-68.

Study on the mechanism and specificity of an oncolytic adenovirus （recombinant human adenovirus type 5） inhibiting the proliferation of tumor cells

JU Shu， WANG Aixia

（Shanghai Sunway Biotech Co.， Ltd.， Shanghai 201206， China）

ABSTRACT The mechanism and specificity of human adenovirus type 5 （H101） in inhibiting tumor cells were studied. By in vitro cell culturation and TCID50 virus titer test， it was found that the oncolytic adenovirus had a significant selective replication effect on p53- tumor cells and its replication ability could produce oncolytic effect on p53 mutated tumor tissue and achieved therapeutic effect. In vitro pharmacodynamic experiment was used to detect the inhibitory effect of H101 on ten tumor cell lines. By calculating IC50 and IC90， it was further concluded that H101 was sensitive to the mouse hepatoma cell Hepa1-6， the mouse pancreatic cancer cell Pan02 and the mouse glioma cell GL261. These results showed that H101 had oncolytic effects on other tumor cells beyond the approved indications and a potential for expanding indications. This study can also provide reference for the selection of animal models and dosage for subsequent in vivo pharmacological experiments.

KEY WORDS oncolytic adenovirus； tumor treatment； pharmacodynamic experiments in vitro； proliferation inhibition

溶瘤病毒（oncolytic virus）是一類重要的基因治療藥物，作為攜帶外源基因的載體，在感染細(xì)胞的同時(shí)，也能起到破壞腫瘤組織的作用，具有多重治療功能。作為一類新型的具有生命體特征的藥物，溶瘤病毒在世界范圍內(nèi)獲批的藥物還很少。目前已經(jīng)獲批上市的溶瘤病毒主要有4種，分別是重組人5型腺病毒（H101，中國(guó)，2006）、溶瘤單純皰疹病毒藥物talimogene laherparepvec（T-VEC，美國(guó)，2015）、teserpaturev（G47？，日本，2023）及溶瘤腺病毒藥物nadofaragene firadenovec（rAdIFN-a2b-Syn3，美國(guó)，2024）。它們的獲批標(biāo)志著溶瘤病毒已成功進(jìn)入主流臨床。

溶瘤腺病毒既可作為抗癌制劑單獨(dú)使用，同時(shí)又可以作為攜帶外源基因的載體，使外源基因隨病毒復(fù)制而長(zhǎng)效表達(dá)，因此，可發(fā)揮病毒和基因的雙重療效，并廣泛應(yīng)用于癌癥的靶向基因-病毒治療[1]。目前溶瘤病毒治療常用的載體為人5型腺病毒（adenovirus type 5，Ad5），具有體積小、彌散能力強(qiáng)、致病力低的優(yōu)點(diǎn)[2]，所以腺病毒是目前研究進(jìn)展最快的溶瘤病毒之一[3-7]。野生型腺病毒（WT Ad5）的基因改造以敲除與病毒在正常細(xì)胞中復(fù)制感染相關(guān)的基因?yàn)橹鳎饕康氖菫榱税踩院驮谀[瘤細(xì)胞中的條件性復(fù)制。在目前的臨床腺病毒載體中，有4種實(shí)現(xiàn)條件復(fù)制的一般策略：一種是用癌細(xì)胞特異性啟動(dòng)子替換或覆蓋WT Ad5 E1啟動(dòng)子，其他3種涉及早期轉(zhuǎn)錄單元E1A和E1B的修飾。在許多構(gòu)建體中，E1A修飾與腫瘤特異性啟動(dòng)子替換通常結(jié)合起來(lái)使用[8-9]。

H101的重組腺病毒改造主要涉及E1B缺失，在正常的體細(xì)胞內(nèi)不能復(fù)制，并且病毒基因組存在于細(xì)胞染色體外，不整合到細(xì)胞染色體中，避免了因整合引起的基因突變及激活致癌基因，對(duì)人體生物安全性高。然而，有文獻(xiàn)稱同類Ad5-E1B刪除的重組腺病毒藥物（如Dl1520、ONYX-015）對(duì)腫瘤的選擇性有限[10]，因此需要對(duì)H101的作用機(jī)制和對(duì)腫瘤的選擇性抑制進(jìn)行研究。本研究采用體外細(xì)胞培養(yǎng)方法及TCID50檢測(cè)病毒滴度法，研究了重組人5型腺病毒對(duì)p53-的腫瘤細(xì)胞的選擇性復(fù)制作用，并采用體外藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)（MTS方法）檢測(cè)了重組人5型腺病毒對(duì)10種腫瘤細(xì)胞系的增殖抑制作用，以期為后續(xù)開(kāi)展動(dòng)物模型的體內(nèi)藥效實(shí)驗(yàn)（如動(dòng)物模型的選擇和用藥劑量），以及該溶瘤病毒藥物在臨床上更廣泛的應(yīng)用提供參考。

1 材料和方法

1.1 試劑

RPMI 1640培養(yǎng)基、DMEM高糖培養(yǎng)基（美國(guó)Corning公司）；胎牛血清（美國(guó)Gibco公司）；025%胰蛋白酶-EDTA消化液（北京Solarbio公司）；CellTiter 96 AQueous One Solution（美國(guó)Promega公司）。

1.2 儀器

LD5-2B離心機(jī)（日本京立公司）；3111 CO2培養(yǎng)箱、Varioskan Flash全波長(zhǎng)掃描式多功能酶標(biāo)儀（美國(guó)Thermo公司）；QB-9001微孔板振蕩器（海門市Qilinbeier公司）；IX53倒置顯微鏡（日本Olympus公司）；HR1500-Ⅱa2超凈臺(tái)（青島海爾公司）。

1.3 細(xì)胞株及毒種

正常細(xì)胞：人成纖維細(xì)胞FC，人微血管內(nèi)皮細(xì)胞MVEC；p53+腫瘤細(xì)胞株：舌癌TCA-8113，肺癌A549；p53-腫瘤細(xì)胞株：鼻咽癌CNE，子宮頸癌 C33A，結(jié)腸癌DLD-1，結(jié)腸癌HT-29。小鼠結(jié)直腸癌CT26.wt，小鼠結(jié)直腸癌MC38，小鼠黑色素瘤B16F10，小鼠肝癌Hepa1-6，小鼠肝癌H22，小鼠胰腺癌Pan02，人源胰腺癌MIApaca-2，人源肝癌MHCC97H，人源結(jié)直腸癌HT-29，小鼠神經(jīng)膠質(zhì)瘤GL261。上述細(xì)胞株均來(lái)源于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心（CCTCC）。

重組人5型腺病毒（安柯瑞，H101）來(lái)源于上海三維生物技術(shù)有限公司，是通過(guò)對(duì)野生型腺病毒基因序列的E1B區(qū)進(jìn)行55 kD的刪除和密碼子的點(diǎn)突變，并刪除E3區(qū)得到的重組腺病毒；野生型5型腺病毒（WT Ad5）來(lái)源于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心（CCTCC）。

1.4 方法

1.4.1 p53-、p53+腫瘤細(xì)胞株及正常細(xì)胞培養(yǎng)

采用體外細(xì)胞培養(yǎng)方法及TCID50檢測(cè)病毒滴度法，測(cè)定H101在正常細(xì)胞、p53+和p53-腫瘤細(xì)胞中的復(fù)制活性。使用175 cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶分別制備A549、TCA-8113、MVEC、FC、HT-29、C33A、CNE、DLD-1細(xì)胞，當(dāng)每個(gè)培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)的細(xì)胞匯合率大于80%時(shí)，傾去培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)液；然后，在每個(gè)培養(yǎng)瓶中加入2 mL胰蛋白酶消化液，蓋好瓶蓋后輕輕晃動(dòng)培養(yǎng)瓶，使胰蛋白酶消化液完全覆蓋瓶底細(xì)胞，并平置于CO2培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行消化；靜置5 min后，取出培養(yǎng)瓶，晃動(dòng)并輕拍培養(yǎng)瓶使細(xì)胞完全脫離瓶底；用移液管重懸細(xì)胞，使細(xì)胞懸浮混勻并計(jì)數(shù)。根據(jù)計(jì)數(shù)后的細(xì)胞密度加入適量測(cè)活培養(yǎng)基（DMEM+7% FBS），使細(xì)胞終濃度達(dá)到2.0×10⁵個(gè)/mL。用移液器在96孔板中加入細(xì)胞懸液100 mL/孔，每個(gè)樣品平行3塊板。

1.4.2 腫瘤細(xì)胞株培養(yǎng)

使用96孔細(xì)胞培養(yǎng)板培養(yǎng)CT26.wt、MC38、B16F10、Hepa1-6、H22、Pan02、MIApaca-2、MHCC97H、HT-29和GL261。調(diào)整其生長(zhǎng)狀態(tài)，待處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)收獲細(xì)胞，取少量細(xì)胞用臺(tái)盼藍(lán)染色，保證細(xì)胞活力達(dá)98%以上。用生長(zhǎng)培養(yǎng)基將細(xì)胞密度稀釋到1.0×10⁵個(gè)/mL（H22細(xì)胞密度為1.5×10⁵個(gè)/mL），制備成細(xì)胞懸液。將上述細(xì)胞懸液接種到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，50 μL/孔，使得每孔細(xì)胞數(shù)量達(dá)到5×10³個(gè)（H22接種細(xì)胞數(shù)為7.5×10³個(gè)/mL）。將上述細(xì)胞板置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育2 h。

1.4.3 TCID50和IC50測(cè)定

1）TCID50測(cè)定 每塊板需做6個(gè)病毒稀釋度，稀釋度的選擇根據(jù)供試品實(shí)際情況確定。將供試品用測(cè)活培養(yǎng)液做10倍系列稀釋至所選擇的最低稀釋度（10？6），每個(gè)梯度終體積為2 700 mL。按照確定的感染梯度，在加好細(xì)胞懸液的96孔板上由低濃度到高濃度加入各梯度稀釋液100 mL/孔，每個(gè)梯度重復(fù)8孔，每個(gè)樣品平行加3塊板。每塊板上留8孔作為空白對(duì)照，即每孔加100 mL測(cè)活培養(yǎng)基和100 mL細(xì)胞懸液。將96孔板置于37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)14 d。當(dāng)細(xì)胞病變作用（cytopathic effect，CPE）終點(diǎn)穩(wěn)定時(shí)，將96孔板置于倒置顯微鏡下觀察，計(jì)數(shù)相應(yīng)稀釋梯度的CPE陽(yáng)性孔數(shù)，并按Karber公式計(jì)算lgTCID50。

Karber公式：lgTCID50=d（ΣS-0.5）-L。式中d=稀釋對(duì)數(shù)之間的差，ΣS=陽(yáng)性孔比率總和，L=最高稀釋度的對(duì)數(shù)。

2）IC50測(cè)定 用RPMI 1640培養(yǎng)基對(duì)待測(cè)物做9個(gè)濃度點(diǎn)的10倍梯度稀釋，取出細(xì)胞板，將2×濃度的病毒工作液加入，50 μL/孔，每個(gè)濃度做3個(gè)復(fù)孔，最終病毒濃度為0.5×（10²～10¹⁰）vp/mL，將細(xì)胞板置于37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育72 h。孵育結(jié)束后，將CellTiter 96 AQueous One Solution試劑置于室溫融化并平衡至室溫，向細(xì)胞培養(yǎng)板中加入20 mL/孔的CellTiter 96 AQueous One Solution試劑。將細(xì)胞板置于CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的培養(yǎng)箱中于37 ℃繼續(xù)孵育3 h。將酶標(biāo)儀調(diào)至490 nm波長(zhǎng)，放入細(xì)胞板，讀取吸光度（OD值），采用GraphPad Prism 5.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行圖形化處理計(jì)算IC50，匹配相適應(yīng)的劑量-效應(yīng)曲線。IC50可在GraphPad Prism 5.0中自動(dòng)計(jì)算得出。

存活率計(jì)算公式：存活率=（OD待測(cè)孔-OD空白對(duì)照）/（OD陰性對(duì)照-OD空白對(duì)照）×100%。

2 結(jié)果

2.1 H101對(duì)p53-的腫瘤細(xì)胞有顯著選擇性復(fù)制作用

H101對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制作用有顯著的選擇性，其在p53-細(xì)胞中的抑制活性是p53+細(xì)胞和正常細(xì)胞的100倍左右。與WT Ad5相比，H101感染p53-的腫瘤細(xì)胞72 h，細(xì)胞內(nèi)病毒滴度與WT Ad5相當(dāng)；而感染正常細(xì)胞和p53+的腫瘤細(xì)胞其病毒滴度明顯低于WT Ad5，表明H101能選擇性地在p53？的腫瘤細(xì)胞中復(fù)制，而在p53+的細(xì)胞和正常人體細(xì)胞中則不能有效地復(fù)制（圖1）。

2.2 H101對(duì)10種腫瘤細(xì)胞株的抑增殖作用

結(jié)果顯示，與陽(yáng)性細(xì)胞HT-29相比，小鼠肝癌細(xì)胞Hepa1-6、小鼠胰腺癌細(xì)胞Pan02、小鼠神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞GL261對(duì)H101更為敏感，IC50分別為7.61×10⁶、1.05×10⁷、3.13×10⁶ vp/mL（表1），IC90分別為8.30×10⁷、3.47×10⁷、1.46×10⁷ vp/mL；H101對(duì)陽(yáng)性細(xì)胞HT29的IC50為1.30×10⁷ vp/mL，IC90為3.34×10⁸ vp/mL（圖2）。據(jù)此，可選用上述3種小鼠模型開(kāi)展體內(nèi)藥效實(shí)驗(yàn)。此外，H101對(duì)小鼠結(jié)直腸癌MC38的IC50為4.155×10⁸ vp/mL，盡管較對(duì)陽(yáng)性細(xì)胞的IC50高10倍，但該細(xì)胞免疫原性強(qiáng)，是目前腫瘤免疫新藥研發(fā)應(yīng)用最多的模型，亦可選取該小鼠模型開(kāi)展體內(nèi)藥效實(shí)驗(yàn)。

3 討論

H101已被中國(guó)批準(zhǔn)用于常規(guī)放療或放療加化療治療無(wú)效的晚期鼻咽癌患者，臨床研究中H101對(duì)鼻咽癌患者的有效率可以達(dá)到75.6%。美國(guó)上市的溶瘤腺病毒藥物rAd-IFN-a2b-Syn3在臨床上對(duì)高危非肌層浸潤(rùn)性膀胱癌患者顯示出良好治療活性。這些臨床研究顯示溶瘤腺病毒藥物具有廣闊的臨床應(yīng)用前景。本研究所述的H101在體外細(xì)胞活性實(shí)驗(yàn)中對(duì)Hepa1-6、Pan02和GL261細(xì)胞有選擇性活性，提示H101可能對(duì)肝癌、胰腺癌和神經(jīng)膠質(zhì)瘤患者及肝癌/胰腺癌轉(zhuǎn)移患者有益。

本研究?jī)H對(duì)H101在細(xì)胞水平上的抑制活性進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)，在H101的體內(nèi)活性研究中，還應(yīng)考慮其對(duì)于腫瘤免疫的影響。有研究表明溶瘤病毒可以恢復(fù)腫瘤免疫逃逸[11]。H101在體內(nèi)是否可以選擇性抑制腫瘤生長(zhǎng)，具有改善腫瘤組織微環(huán)境作用及能夠產(chǎn)生腫瘤免疫治療效果，這些都需要通過(guò)進(jìn)行進(jìn)一步的體內(nèi)藥效實(shí)驗(yàn)和臨床試驗(yàn)來(lái)予以揭示。

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