蛋白提取工藝過程評價方法的研究

摘 要 目的：建立一種快速、便捷、低成本的生物酶制劑生產工藝過程評價方法。方法：聯用凝膠電泳法和BCA蛋白定量法進行計算，得到較為準確的目標蛋白定量數量數據。結果：以胰蛋白酶生產工藝為例，對不同工段樣品進行SDS-PAGE和BCA測試，并計算得到對應的蛋白定量數據，其中組內樣品數據RSD≤5%，說明了該方法的可重復性。結論：該方法可準確分析不同工段的蛋白濃度變化，并進行快速、靈敏地定量；同時發現原胰蛋白酶生產工藝中存在蛋白泄漏的缺陷，可為后續工藝改進提供理論依據。

關鍵詞 SDS-PAGE BCA 標準曲線法 蛋白提取 中間體評價

中圖分類號：TQ460.63； TQ464.8 文獻標志碼：A 文章編號：1006-1533（2024）15-0069-04

引用本文 梁吉， 汪晨曦. 蛋白提取工藝過程評價方法的研究[J]. 上海醫藥， 2024， 45（15）： 69-72.

Study on the evaluation method for protein extraction process

LIANG Ji1， WANG Chenxi2

（1. Shanghai Pharmaceutical School， Shanghai 200135， China； 2. SPH NO.1 Biochemical & Pharmaceutical Co.， Ltd.， Shanghai 200240， China）

ABSTRACT Objective： To establish a rapid， convenient and low-cost evaluation method for the production process of biological enzyme preparations. Methods： Combined with gel electrophoresis and BCA protein quantitative method， more accurate quantitative data of target protein were obtained. Results： Taking the trypsin production process as an example， SDSPAGE and BCA tests were performed on samples from different sections， and the corresponding protein quantitative data were obtained by calculation. The RSD≤5 % of the sample data in the group indicated the repeatability of the method. Conclusion： This method can accurately analyze the changes of protein concentration in different sections and quickly and sensitively quantify the protein. It is found that there is a defect of protein leakage in original production process of trypsin， which provides a theoretical basis for subsequent process improvement.

KEY WORDS SDS-PAGE； BCA； standard curve method； protein extraction； intermediate evaluation

生物提取是酶制品工業化生產中重要的技術方法，具有產量大、成本低等優勢。在化學制藥中，酶制品原料藥如胰蛋白酶、糜蛋白酶、玻璃酸酶和凝血酶等的生產，都廣泛采用生物提取法[1-3]。該方法的起始原料往往是生物組織、酶原等，其純度、質量會影響酶制品的產品收率、質量等工藝指標。同時各工段產物組份較為復雜，所以通常采用的性狀判斷等方法，不能進行有效的定性定量分析。這使得整個提取工藝處于不穩定、不可控的狀態，影響生產工藝的穩定性，也掣肘了工藝優化的進行。

針對以上問題，本研究以生產中的胰蛋白酶產品為例[4-7]，通過聯合蛋白含量測定法與凝膠電泳技術，開發了一種便于操作、成本低廉的檢測方法，用于監控、評估工藝過程。為后續的工藝技術改進、持續工藝驗證和數據采集分析提供了數據支撐。

1 材料和方法

1.1 試劑和儀器

實驗所用試劑、原料藥品均購于商業公司，未經說明使用前均不需要二次純化；胰蛋白酶工段產物、原料和成品均由上藥第一生化藥業有限公司提供；凝膠電泳試劑盒、BCA試劑盒均購于上海生物工程公司；配制溶液所需的原料試劑均購于國藥試劑公司；Tanon model EPS300電泳儀購于上海天能科技有限公司；Mapada UV-3100紫外分光光度計購于上海美譜達儀器有限公司。

1.2 樣品制備

1）工段產物1～5取樣胰蛋白酶工藝過程中的工段產物（工段1～5），同時計量該工段產物的質量（液體樣品計量體積）。將其溶于水后（樣品為液體則稀釋）用透析袋（截留Mr為3 500）在水中透析除鹽，溫度為0～8 ℃，透析時間為24 h。用凍干機凍干樣品，計量備用。

2）待測樣品 將上述樣品用磷酸鹽緩沖液（0.1 mol/L，pH 7.0）配制濃度為1 mg/mL的樣品。

1.3 凝膠電泳SDS-PAGE檢測

按試劑盒說明書制備濃度為15%的分離凝膠，組裝凝膠電泳裝置。在待測樣品中加入非還原性上樣緩沖液（保留蛋白二硫鍵），95 ℃煮沸變性后加樣進行凝膠電泳分析，單孔泳道上樣量約為20 mg。獲取的膠條采用考馬斯亮藍染色1 h（搖床37 ℃、180 r/min），然后，用脫色液脫色2 h。膠條置于白背景、明亮白光下拍照，圖片運用Image J軟件處理為灰度圖。最后，分別計算目標泳道區域總灰度、目標條帶灰度及占比。

1.4 BCA蛋白含量測定法

1.4.1 采用牛血清蛋白（BSA）做BCA測定標準曲線

按試劑盒說明書配制BCA工作液，按照V工作液-VBSA=39∶1的比例加入不同濃度的BSA溶液，混合均勻后于37 ℃孵育30 min，測試在562 nm處的紫外吸收值。做吸光度-BSA濃度曲線，經過線性擬合得標準曲線回歸方程。

1.4.2 待測樣品測試

將待測樣品和BCA工作液混合，37 ℃孵育30 min，測試在562 nm處的紫外吸收值。通過標準曲線測定待測樣品的濃度x（mg/mL），如果樣品對應工段產物為固體，則通過式1計算工段產物蛋白量；如果樣品對應工段產物為液體，則通過式2計算工段產物蛋白量。

其中y固體為固體樣品蛋白量（g），y液體為液體樣品蛋白量（g）。x為待測樣品實際蛋白濃度（mg/mL），m1為樣品凍干后質量（g）；M為工段產物質量（g），m為取樣質量（g）；V為工段產物體積（mL），v為取樣體積（mL）。

1.5 樣品中目標蛋白量的計算

以胰蛋白酶為例，其Mr為25 kDa蛋白，按照1.3計算電泳圖像灰度值。按照1.4計算其樣品蛋白量，即樣品目標蛋白量=目標蛋白灰度占比×樣品蛋白量；并按此計算各個待測樣品中的目標蛋白量。

1.6 方法學評價

重復取樣，按1.5計算同樣品的目標蛋白量，考察同樣品數據平行樣品間的RSD。

2 結果與分析

由于胰蛋白酶生產工藝的中間工段取樣處于不可控狀態，不宜定量分析，因此我們設計了兩種技術聯用的方法對中間體進行評估。其中SDS-PAGE分析蛋白樣品組成是一種快速且易于操作的方法，常用來分析樣品的組成、純度。通過Image J處理為灰度圖后，可以通過灰度粗略判斷目標條帶的占比[8-12]。而BCA蛋白含量測定法是經典的藥典方法，通過肽鍵還原Cu2+為Cu+，與BCA分子結合產生在562 nm處有紫外吸收的物質，其吸光度與蛋白濃度成線性關系[13]。BCA方法測定的結果是樣品中總蛋白量，并不能區分雜蛋白與目標蛋白。分析以上數據，我們認為總蛋白量結合凝膠電泳的灰度占比結果，兩者乘積可用來代表目標蛋白的實際量。

2.1 凝膠電泳法分析各工段蛋白量

結果顯示，隨著工段推進，樣品中胰蛋白酶量占比逐漸增加，純度逐步提升（圖1）。在25 kDa附近的條帶歸屬于胰蛋白酶，其中工段1產物中大Mr雜蛋白的占比達到了77%；而隨著工序推進到工段產物2時，目標胰蛋白酶的占比提升到54%。工段3、4的結果相近，說明在這兩步生產中主要目的是除鹽而非目標蛋白的提純。經過工段5的操作，胰蛋白酶獲得進一步提純，電泳條帶的灰度分數占比達到了100%（圖1），表明其可在一定程度上監測胰蛋白酶生產過程。為進一步評價該方法的重復性，我們重復采樣4次分析樣品間RSD。結果顯示，不同工段樣品間重復采樣各RSD均小于5%（表1），說明采用凝膠電泳法檢測胰蛋白酶樣品的重復性良好，可滿足對胰蛋白酶生產過程的分析需求。

2.2 BCA法分析各工段蛋白量

根據吸光度-BSA濃度曲線，經過線性擬合得標準曲線回歸方程y=0.523x+0.148 1，進一步通過1.4.2計算得到各工段中的蛋白量（表2）。結果顯示，工段1到工段2過程中蛋白量大幅度下降，工段4和5樣品中的蛋白降低比例超過50%，從中可以監測胰蛋白酶生 產工藝中蛋白質量的變化。同時各工段重復采樣樣品的RSD均小于5%（表2），說明BCA方法測定胰蛋白酶工段產物的重復性良好。

2.3 聯合凝膠電泳和BCA法分析各工段蛋白量

結果顯示，各工段樣品及重復樣數據RSD均小于 5%（表3），說明本研究方法的重復性良好。通過兩步工藝間胰蛋白酶量的差值與前一步量的比值計算胰蛋白酶的損耗率（圖2）。

結合胰蛋白酶純化的生產工藝流程，工段1處理后，雜蛋白被大量除去；工段2、3、4獲取產物后，目標胰蛋白酶存在大量損失。其中，工段4采用了透析袋透析，經過進一步檢測其截留Mr約為40 kDa，大于胰蛋白酶的25 kDa，說明胰蛋白酶在透析過程中可能發生泄漏。工段5獲取的胰蛋白酶為480 g，與實際生產成品結果數據相近（470～510 g），說明本方法可以反應生產實際情況。從其中數據也可看出，工段4出現了更多的胰蛋白酶損失量，值得進一步分析。

工段4主要的生產操作是將工段產物3在透析袋內重結晶析出廢物，留下液體進入后續工段，為此產生了結晶廢物、透析廢液。為進一步研究工段4的損耗情況，利用凝膠電泳法分析在工段4取樣的起始物料（工段產物3）、廢液和廢物（圖3）。結果顯示，廢液（泳道3）中于25 kDa處可以看到清晰的胰蛋白酶條帶，灰度分數為30.5%，同時BCA測試顯示該廢液中總蛋白量為1 560 g，按本研究方法計算廢液中胰蛋白酶量為476 g。廢物（泳道2號）中灰度分數為95.6%，同時BCA法測得該廢物樣品中總蛋白量為680 g，計算得出廢固物樣品中胰蛋白酶量為650 g。按本方法計算，起始物料工段產物3（ 泳道1）胰蛋白酶量為2 175 g，廢液與廢物中損失的胰蛋白酶總和為1 126 g（占比51.8%）。其中廢物是重結晶必然產生的損耗無法避免，廢液則來源于透析袋的截留滲漏。因此，工段4中胰蛋白酶產生損失近500 g，是采用了截留Mr過大的透析袋所致。經過以上進一步的分析，我們可以判斷出該胰蛋白酶生產工藝過程中的工段4值得進一步優化改進。

3 討論

本研究將經典的凝膠電泳法和BCA蛋白定量法進行聯合，建立了一套適用于中間過程產物評價的方法，驗證了該方法的可重復性。以胰蛋白酶生產工藝為例研究，發現其可用于簡便、快速地監控生產過程，且技術門檻低，設備費用低廉，具有良好的應用前景。同時，在研究工作中發現，胰蛋白酶生產工段4存在嚴重的胰蛋白酶損耗，這為下一步該工藝改進提供一個方向。本方法也可以進一步用于其它蛋白質提取生產工藝的過程研究，對于優化生產工藝有較大的幫助。

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