AEX-HPLC法測定單純皰疹病毒注射液中病毒顆粒數

摘 要 目的：建立檢測單純皰疹病毒注射液病毒顆粒數（VP）的陰離子交換色譜法（AEX-HPLC）。方法：采用Resource Q分析柱和Agilent 1260Ⅱ高效液相色譜系統，以Tris緩沖溶液（20 mmol/L，pH 7.0）為流動相A和以含2.5 mol/L氯化鈉的Tris緩沖溶液為流動相B進行梯度洗脫，并對方法進行驗證。結果：空白溶劑無干擾峰出現；未經純化的單純皰疹病毒溶液中的皰疹病毒峰與其他雜質峰分離度大于1.5；該方法的定量限和檢測限為5.0×107 VP/mL和2.0×107 VP/mL；皰疹病毒的進樣量在5×107～1×109病毒顆粒范圍內，濃度與吸收峰的線性關系良好（R2=0.998 2）；整個精密度實驗的RSD%為0.9%；回收率70%～130%之間。結論：AEX-HPLC法可用于檢測單純皰疹病毒注射液的病毒顆粒數。

關鍵詞 單純皰疹病毒 病毒顆粒 分析方法驗證

中圖分類號：O657.75； R927.2 文獻標志碼：A 文章編號：1006-1533（2024）15-0083-04

引用本文 孫名皓，雷雨， 胡國棟. AEX-HPLC法測定單純皰疹病毒注射液的病毒顆粒數[J]. 上海醫藥， 2024， 45（15）： 83-86.

Determination of viral particle in herpes simplex virus injection by AEX-HPLC

SUN Minghao， LEI Yu， HU Guodong

（Shanghai Pharma Sunway Biotech Co.， Ltd.， Shanghai 201206， China）

ABSTRACT Objective： To establish an assay method for the determination of viral particle （VP） in herpes simplex virus injection by AEX-HPLC. Methods： The HPLC was run on Resource Q column with gradient elution using Tris buffer （20 mmol/L， pH 7.0） as mobile phase A and Tris buffer containing 2.5 mol/L NaCl as mobile phase B. The assay method was subsequently validated. Results： There was no interference peak in the blank solvent and the resolution between peaks for herpes simplex virus and other impurities in the unpurified herpes simplex virus solution was greater than 1.5. The LOQ and the LOD of this assay were 5.0×107 and 2.0×107 VP/mL. The linearity relationship between the concentration and the absorption peak was good in the range of 5×107-1×109 VP/ mL with R2 0.998 2. RSD% in precision assay was 0.9% and recovery in accuracy assay was between 70%-130%. Conclusion： The AEX-HPLC assay can be applied to determine the viral particle in herpes simplex virus injection.

KEY WORDS herpes simplex virus； viral particle； analysis method validation

單純皰疹病毒（herpes simplex virus，HSV）[1-2]是皰疹病毒的典型代表，由于感染急性期發生水皰性皮炎即單純皰疹而得名。能引起人類多種疾病，如齦口炎、角膜結膜炎、腦炎以及生殖系統感染和新生兒的感染。HSV呈球形，有包膜，包膜表面有11種包膜糖蛋白；有明顯的四層結構組成：一個雙鏈DNA核心、核衣殼、間層和囊膜。單純皰疹病毒治療是當前腫瘤治療技術的研究熱點[2-3]，在作為藥品進行研發和生產的過程中，需要采用滴度測定的方法進行分析和控制。目前針對單純皰疹病毒的滴度測定主流的方法是使用空斑法檢測生物學滴度[4-6]，不僅檢測周期長（需要1周），對人員及環境的要求較高（須保持無菌），而且成本較高。此外還有熒光定量PCR法[7-8]、化學發光免疫法[9]、酶聯免疫法[9]等檢測病毒顆粒數，雖然這些方法靈敏度高，檢測周期短，但是成本很高，須購買相對應的價格昂貴的檢測試劑盒，且無法做到高通量的檢測，滿足不了在工藝純化過程中實時監控。本研究建立了一種AEX-HPLC方法來檢測單純皰疹病毒注射液中的病毒顆粒數，具有高效、快速、低成本優勢。

1 材料和方法

1.1 儀器

Agilent 1260Ⅱ型高效液相色譜儀（紫外檢測器，OpenLab工作站軟件；安捷倫公司）；Resource Q色譜柱（6.4 × 30 mm，15 mm，Cytiva公司）；ME3002TE電子天平、S400-K 型pH計（Mettler Toledo公司）。

1.2 試劑和樣品

Tris-Base購自Promega公司；鹽酸和氫氧化鈉購自Merck公司；水為超純水；單純皰疹病毒注射液（通過qPCR對其進行標定，標定值2.1×10⁹ VP/mL，作為工作標準品）、中間樣品等均為上海三維生物技術有限公司研發平臺生產，保存條件為-80 ℃。

1.3 色譜條件

1）空白溶液 以流動相A作為空白溶劑進樣。

2）標準品溶液 從？80 ℃冰箱中取出單純皰疹病毒注射液，解凍、平衡至室溫后輕微渦旋后進樣。

3）供試品溶液 取單純皰疹病毒溶液中間樣品進樣。

4） 流動相 A：Tris溶液（20 mmol/L，pH 7.0，用0.45 mm的微孔濾膜抽濾）；B：Tris溶液+2.5 mol/L氯化鈉溶液。

流速1.0 mL/min，柱溫25 ℃，樣品池溫度10 ℃，檢測波長280 nm，進樣量100 mL；進行梯度洗脫（表1）。

2 結果

2.1 專屬性和系統適用性

空白溶液、標準品溶液、供試品溶液各100 mL進樣，記錄色譜圖，結果見圖1。標準品溶液中單純皰疹病毒峰的保留時間在4.09 min；在空白溶液的出峰位置無干擾；供試品溶液中，單純皰疹病毒峰與其他雜質峰的分離度大于1.5。結果表明，本方法的專屬性和系統適用性良好。

2.2 定量限

取標準品溶液適量，用流動相A逐步稀釋成不同濃度，在上述色譜條件下，基線噪音選擇6.00～7.00 min，直至信噪比接近10。結果單純皰疹病毒的定量限為5×10⁷ VP/mL，可以滿足測定要求。

2.3 檢測限

取標準品溶液適量，用流動相A逐步稀釋成不同濃度，在上述色譜條件下，基線噪音選擇6.00～7.00 min，直至信噪比接近3。結果單純皰疹病毒的檢測限為2×10⁷ VP/mL，可以滿足測定要求。2.4 線性和范圍

將定量限的濃度作為線性的最低濃度點，將高濃度的單純皰疹病毒液用流動相A稀釋至1×10⁹、5×10⁸、2×10⁸、1×10⁸及5×10⁷ VP/mL，分別進樣，測得各濃度相應的峰面積（表2），并對目標峰面積進行線性評估。以濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標作回歸分析，得回歸方程Y=947.38X-36.964，R2=0.998 2。結果表明，單純皰疹病毒的進樣濃度在（5×10⁷）～（1×10⁹）VP/mL之間，線性關系良好。

2.5 精密度

2.5.1 重復性

由分析員1取樣品溶液，連續進樣6次，測定單純皰疹病毒的峰面積，結果峰面積的RSD%為1.0%，表明本方法的重da0b196f05a0d0536ca0f9dd59419bf12ef2bb1f76cffe7264e19d3cee273579復性良好。

2.5.2 中間精密度

由分析員2在不同日期取樣品溶液，連續進樣6次，測定單純皰疹病毒峰面積，結果峰面積的RSD%為0.7%，表明本方法的中間精密度良好，綜合重復性和中間精密度的數據，12針進樣結果峰面積的RSD%為0.9%，表明本方法的精密度良好。

2.6 準確度

選取2×10⁸、5×10⁸、8×10⁸ VP/mL為低、中、高3個已知濃度的標準品，分別與未知濃度的中間樣品等體積混勻后進行檢測，回收率在70%～130%之間（表3）。

3 討論

病毒顆粒數一定程度上能夠反映病毒滴度，在工藝開發過程中，需要對病毒顆粒數進行控制以確保工藝的穩定，和傳統的檢測方法相比較，通過高效液相色譜的方式，可以極大的縮短開發的進程，降低成本；同時在產品放行階段，也可以和空斑法滴度相輔相成，共同反映該產品的病毒顆粒數。本研究采用的AEX-HPLC法，在分析未純化的單純皰疹病毒液時，可將單純皰疹病毒峰和雜質峰實現很好的分離；此外單個樣的檢測時間為8 min，可以大通量地進行病毒檢測，非常利于前期的細胞培養、篩選和純化階段的工作。

但是由于使用的流動相B中含有2.5 mol/L的氯化鈉，鹽濃度很高，在檢測過程中須用10%的異丙醇進行泵頭密封墊的清洗，每5 min “seal wash” 0.2 min；同時針對未純化的樣品，為了充分洗脫柱子上的殘留樣品，特地在5～8 min的時間段將梯度放緩（表1）；為了能延長色譜柱的使用壽命，在每次檢測樣品后須對色譜柱進行較長時間的清洗、維護；如檢測完成后，切換成1 mol/L氫氧化鈉，以0.5 mL/min進行等度洗脫，之后再切換成超純水進行沖洗2 h以上，同時在下一次檢測前，需要對進樣針進行10次“needle wash”，來清洗進樣針中殘留的樣品，減小對下一次檢測的干擾。考慮到維護的操作時間較長，步驟較多，后續會進一步研究，嘗試在流動相中加入較少比例的有機相，在不改變原有檢測靈敏度的情況下盡可地將色譜柱上的樣品洗脫干凈來減少維護色譜柱所需的時間。就本分析方法而言，不應僅僅局限于單純皰疹病毒，在同一個液相條件下，對不同病毒的分離才是未來病毒顆粒數檢測的趨勢，這樣不僅可以在前期開發中進行高通量檢測，還可以在產品放行階段對關鍵質量參數尤其是雜質部分進行一定程度上的控制。

在方法學驗證方面，5×10⁷～1×10⁹ VP/mL的線性范圍可以很好地滿足工藝開發的需求，良好的精密度以及較高的回收率也是本方法的亮點之一。總之，本方法可以用于單純皰疹病毒注射液中病毒顆粒數檢測。

參考文獻

[1] Bradley H， Markowitz LE， Gibson T， et al. Seroprevalence of herpes simplex virus types 1 and 2—United States， 1999-2010[J]. J Infect Dis， 2014， 209（3）： 325-333.

[2] 田聆， 薛京倫， 賈韋國. 溶瘤單純皰疹病毒治療技術及其進展[J]. 生命科學， 2008（5）： 734-741.

[3] 李倩， 徐祎春， 歐瑩， 等. 溶瘤病毒在抗腫瘤臨床治療中的研究進展[J]. 腫瘤， 2022， 42（11）： 778-789.

[4] Roizman B， Whitley RJ. The nine ages of herpes simplex virus[J]. Herpes， 2001， 8（1）： 23-27.

[5] 蔣景儀， 劉玉珍. 單純皰疹病毒空斑篩選方法的建立及其初步應用[J]. 抗生素， 1984， 9（3）： 95-97.

[6] 何英， 殷啟凱， 付士紅， 等. 庫蚊黃病毒的病毒滴度測定方法建立[J]. 中國媒介生物學及控制雜志， 2021， 32（4）： 412-414.

[7] 王磊蘭， 陳瑩， 吳基良， 等. 重組溶瘤2型單純皰疹病毒熒光定量PCR檢測方法的建立與驗證[J]. 湖北科技學院學報（醫學版）， 2020， 34（2）： 102-104.

[8] 陳敬， 劉鈺， 湯重發， 等. 小鼠胃組織中幽門螺桿菌SYBR Green Ⅱ實時定量PCR檢測方法的建立及驗證[J].中國生物制品學雜志， 2016， 29（12）： 1308-1315.

[9] 展幫樂， 阮建波， 朱和玲， 等. 單純皰疹病毒IgM抗體檢測方法的比較[J]. 皮膚性病診療學雜志， 2019， 26（3）： 160-162.