柳樹叢枝病感病植株內源激素含量變化研究

摘 要：為探究植原體誘發的柳樹叢枝病病株內源激素含量的變化，為柳樹叢枝病的致病機理及防治提供理論依據。本研究以垂柳和旱柳為試驗材料，采用LC-MS/MS法檢測叢枝病病株和健株葉片中四大類13種植物激素的含量變化情況。結果表明，兩種柳樹病株與健株相比，ABA和CTK類激素DZ、6-BA顯著增加，生長素類激素NAA、IPA和GA類激素GA-3、GA-4、GA-7顯著減少。柳樹被植原體侵染后其內源激素含量劇烈變化，從而導致柳樹出現叢枝、腋芽叢生等癥狀。

關鍵詞：柳樹 叢枝病 內源激素 液相色譜串聯質譜法

中圖分類號：S763.7" 文獻標識碼：A" 文章編號：0488-5368（2024）08-0109-04

Changes in Endogenous Hormones in Willows Infected with Witches’Broom Disease

HA Qiqi， SUN Yujie， XU Yilin， LI Xianhua

（College of Life Science， Yulin University， Yulin， Shaanxi 719000， China）

Abstract：" To investigate changes in endogenous hormone levels in susceptible willows infected with witches' broom disease induced by phytoplasma， and to provide a theoretical basis for understanding the pathogenesis and control of willow witches' broom， the contents of 13 endogenous hormones were determined in the susceptible and healthy leaves of weeping willow and dryland willow by the LC-MS/MS method. The results showed a significant increase in ABA and cytokinins （including DZ and 6-BA）， while auxin （including NAA and IPA） and GA （including GA-3， GA-4， and GA-7） decreased markedly in both weeping willow and dryland willow. The infection by phytoplasma led to significant changes in endogenous hormones in willows and resulted in witches' broom symptoms such as axillary bud sprouting.

Key words： Willow Witches' broom disease Endogenous hormones Liquid chromatography tandem mass spectrometry

柳樹屬楊柳科，是柳屬和鉆天柳屬植物的統稱，種植種類多達250多種[1]。柳樹生長迅速、樹形優美、耐旱性強、扦插易成活，是我國重要的園林綠化樹種和防風固沙樹種，在城市景觀建設和生態環境改善方面發揮著重要作用[2]。叢枝病是由植原體引起的一種病害，在我國西北地區，尤其是寧夏、內蒙、陜北等地區的發生日趨嚴重，受害柳樹枝條頂芽生長受到抑制，側芽提前萌發，形成叢生小枝，叢生小枝因過渡消耗營養使柳條無法正常木質化，冬季易發生枯枝現象，嚴重時整株樹木枯死[3]。20世紀40年代以來，眾多學者先后研究確定了叢枝病的病原[4]及其所在部位[5]、傳播途徑[3]、傳播昆蟲[6] 及檢測方法[7]，在柳樹叢枝病的防治方面，分別從物理防治和化學防治方面進行了探索[8]。目前，對柳樹叢枝病病株的內源激素變化研究鮮見報道，為揭示叢枝病植原體對柳樹內源激素的影響，本試驗分別對感病和健康柳樹的四大類（脫落酸、細胞分裂素、生長素和赤霉素）共13種激素進行了檢測，研究柳樹叢枝病的發病機制，以期為該病害的防治提供理論指導。

1 材料與方法

1.1 供試材料

于2023年4月對柳樹葉片進行采樣。垂柳的采樣地點為榆林學院校園內，分別在垂柳的3棵健康株和3棵感病株上進行采樣（采集健康垂柳時，周圍不能存在感病垂柳），采集時挑選同一方向和同一位置的葉片作為實驗材料，采集好的葉片立即用液氮冷凍保存，防止激素被葉片中的氧化酶氧化。旱柳樣本采集于榆林市河濱公園，采樣方法同垂柳。

1.2 內源激素的測定

利用液相色譜串聯質譜（LC-MS/MS）進行內源激素的測定。測定激素包括脫落酸（ABA）、細胞分裂素類CTK（DZ、tZ、tZR、6-BA等）、生長素類（IAA、、NAA、IBA、IPA等）和赤霉素（GA1、GA3、GA4、GA7等）。

1.2.1 樣品預處理 取液氮保存的感病樣品和對照樣品，研磨至粉末狀。稱取樣品0.25 g，置于10 mL的離心管，加5 mL提取液（V甲醇∶[KG-*2]V水∶[KG-*2]V甲酸=15∶[KG-*2]4∶[KG-*2]1），漩渦混合1 min，研磨5 min，超聲振蕩30 min，-4℃靜置60 min，12 000 rpm離心10 min，取出上清液備用。

1.2.2 固相萃取 用3 mL水/3 mL甲醇活化上清液，再將上清液注入SPE固相萃取柱（流速≤1 mL/min）進行吸附，然后用3 mL水10%甲醇水淋洗，再用3 mL甲醇進行洗脫。提取赤霉素時在活化部分使用的是70%乙腈溶液，其余過程同上。將上述洗脫液放于濃縮機內濃縮至干，用0.20 mL 80%甲醇水復溶，漩渦混合5 min，12 000 rpm離心10 min，吸取上清液上機進樣作 LC-MS/MS（AB SCIEX 5500 QQQQ）分析。

1.2.3 定性與定量測定 基于植物標準品構建MWDB（Metware Database）植物激素數據庫，對質譜檢測的多反應檢測的數據進行分析。

1.3 數據分析

采用SPSS 23.0對實驗數據進行統計分析和顯著性檢驗。

2 結果與分析

2.1 脫落酸含量的變化

脫落酸（ABA）作為一種植物生長調節物質，其主要作用是促進果實和葉的脫落。在逆境脅迫下， ABA通過信號轉導、誘導逆境基因和蛋白表達以提高植物對干旱、低溫等逆境的抗性[9]。表1結果顯示，ABA含量在垂柳和旱柳的病株中顯著提高，較健株分別提高了6.4和10.5倍。

2.2 生長素含量的變化

生長素（IAA）是調控植物生長的主要激素之一，其主要作用是調節細胞的分裂、分化及細胞伸長[10]。表2為生長素類激素及其衍生物的含量，感病垂柳中NAA、IBA含量，與健株相比顯著下降，分別下降了36.5%和41.7%，IPA、IAA在感病垂柳和健康垂柳中無顯著差異旱柳中NAA、IPA、IBA、IAA四種激素的含量，與健株相比均有顯著下降，分別下降了92.6%、82.3%、25.7%和62.5%。四種生長素類激素及其衍生物中，IBA的含量顯著高于其它激素，在健康垂柳及旱柳中含量高達1 473.14 ng/g和968.19 ng/g。

2.3 細胞分裂素含量的變化

細胞分裂素（CTK）是一種能誘導芽的形成和生長的激素，物體內CTK含量較高時，會引起腋芽萌發和生長，從而形成叢枝[11]。表3結果顯示，垂柳病株中的DZ、tZ和6-BA與健株相比均有顯著提高，分別提高了7.9倍、1.1倍和7.3倍，tZR無顯著變化旱柳病株中的DZ、tZR和6-BA與健株相比顯著增加，分別增加了6.4倍、2.0倍和4.5倍，tZ含量在病株中顯著下降，下降了53.0%。

2.4 赤霉素含量的變化

赤霉素（GA）是調控植物生長的激素之一，它能促進植物發芽及花的形成，還可打破植物休眠。從GA的變化上看，垂柳和旱柳都表現出病株低于健株。由表4可知，除GA-7外，垂柳病株中GA-1、GA-3和GA-4均顯著低于健株，分別降低了50.4%、58.0%和65.7%旱柳病株中四種赤霉素的含量均顯著低于健株，分別降低了19.0%、82.2%、83.9%和87.4%。GA-1的含量在垂柳和旱柳中顯著高于其它三種赤霉素，在健康垂柳和旱柳中分別高達11 654.37 ng/g和1 923.87 ng/g。

2.5 柳樹健株和病株C/A值的變化

研究表明，不同激素間的比例在植物生長發育過程中有著重要作用。本試驗對垂柳健株和病株的總CTK含量、總生長素含量和C/A值進行了計算，感病垂柳的C/A值為0.011 4，明顯大于健康垂柳。C/A值在旱柳健株和病株間的變化趨勢同垂柳，病株的C/A值較大。

3 結論與討論

當病原物侵入植物時，植株體內ABA的含量發生變化，改變植物體內的某些生理生化反應，以此起到防御病原物的作用。本試驗中，垂柳和旱柳感病葉片的ABA的含量顯著上升，較健康葉分別提高了6.3倍和10.5倍。ABA作為一種抑制性激素，過高的ABA會導致植物的葉片變黃、卷曲和變小等癥狀。韓穎等[12]對云南核桃叢枝病感病植株的研究表明，當核桃感染叢枝病后ABA含量顯著上升，與本試驗研究結果基本一致。

柳樹感染叢枝病后，赤霉素的含量顯著下降。除GA-1外，垂柳的感病葉片中的GA-1、GA-3和GA-7均顯著低于健康葉，分別降低了50.0%、58.1%和65.7%旱柳感病葉中的四種赤霉素均顯著低于健康葉，分別降低了19.4%、82.1%、83.9%和86.8%。垂柳和旱柳在赤霉素上的變化存在一定的差異，這可能由于兩個柳樹品種抗病性及感染的植原體種類不同而引起的。

本試驗中，垂柳和旱柳病株中的總CTK含量顯著上升，總生長素含量顯著下降，使感病葉片C/A值均高于健康葉片。植物激素與植原體病害的發生可能是由于C/A值的變化而導致[13]。研究表明，植物被植原體侵染后，C/A值的變化主要有幾種情況：（1）生長素和細胞分裂素含量均增加，C/A值無顯著變化，如桑樹萎縮病[14]（2）生長素和細胞分裂素含量均減少，生長素降幅較大，C/A值增加，如山麻黃

叢枝病[15]（3）生長素含量不變，細胞分裂素含量增加，如甘薯叢枝病[16]（4）生長素含量降低，細胞分裂素含量增加，如核桃叢枝病[12]和棗瘋病[17]。后兩種情況使得C/A值增大，導致植株表現出叢枝現象。 本研究類似第三種情況，柳樹感病后，細胞分裂素含量增加，生長素含量降低，所以C/A值增大，這可能是柳樹叢枝病癥狀產生的原因之一。本研究表明，柳樹感染叢枝病后內源激素水平顯著變化，導致柳樹表現出叢枝癥狀，可為柳樹叢枝病的致病機理和防治提供理論依據。

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基金項目：國家自然科學基金項目（31760209）榆林市科技計劃項目（CXY202190）。

第一作者簡介：哈琦琦（1999-），男，在讀碩士研究生，主要從事旱作栽培與作物生理研究。

通信作者：李鮮花。