還原型谷胱甘肽皮膚滲透性研究

本文以評估還原型谷胱甘肽（Reduced glutathione， GSH）在豬皮膚表面和真皮層的駐留量為目的，以巴馬小型豬離體皮膚作為皮膚模型材料，并應用Franz擴散池和HPLC法分別測定兩種制劑（QRMT和D-5X）中GSH在不同時間點的皮膚表面和真皮層中駐留量。結果顯示， QRMT中的GSH釋放到皮膚表面的速度更快。在1小時和2小時的時間點，QRMT中的GSH駐留量分別是D-5X中的5.5倍和3.4倍。同樣地，QRMT中的GSH也更快地滲透進入皮膚真皮層。在1小時和2小時的時間點，QRMT中的GSH在豬皮膚真皮層中的駐留量分別是D-5X中的25.1倍和21.8倍。這些研究結果為QRMT中的GSH在皮膚表面和真皮層中發揮功效提供了更充分的化學基礎。結論表明，QRMT中的GSH釋放和滲透進入真皮層的速度更快，且在皮膚表面和皮膚真皮層中的駐留量都顯著高于D-5X中的GSH駐留量。

關鍵詞：還原型谷胱甘肽；巴馬小型豬皮膚模型; 皮膚表面駐留量；皮膚真皮層中駐留量

近年來，隨著人們對健康和美麗的追求，皮膚護理研究越來越受到關注。在眾多的皮膚護理成分中，還原型谷胱甘肽（Reduced glutathione，GSH）因其獨特的抗氧化、抗衰老和皮膚修復功效而備受關注。GSH是一種天然存在于人體內的三肽，由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸組成[1]。GSH具有較強的抗氧化作用，能夠清除體內的自由基，防止自由基對皮膚細胞的損傷。此外，還原型谷胱甘肽還具有抗衰老、抗炎和促進皮膚修復的作用。研究表明，還原型谷胱甘肽能夠抑制膠原蛋白的降解，促進膠原蛋白的合成，從而延緩皮膚老化[1-3]。

功效成分在產品中的釋放量，及其在皮膚的駐留劑量是其發揮功效作用的關鍵[4，5]。保濕和美白等化妝品功效成分的開發與應用，需要建立在透皮吸收的基礎上。例如，防曬產品中的紫外線吸收劑的更多劑量應能駐留在皮膚表面，以執行吸收和反射紫外線的功能；美白產品中的活性美白成分應能靶向皮膚的基底層，以干預和阻斷黑色素的形成過程；而抗衰老產品的有效成分通常應作用于真皮層的成纖維細胞，從而促進皮膚彈性和緊致度的提升。因此，化妝品活性成分是否能在皮膚的不同部位達到足夠的駐留量對其能否發揮功效是有顯著影響的。

本研究建立了測定GSH含量測定分析方法，并采用巴馬小型豬皮膚模型，測定不同時間點的GSH在單位皮膚表面駐留量和皮膚真皮層中駐留量，并且比較了兩個含有GSH供試樣品在不同時間點單位皮膚表面和皮膚真皮層中駐留量。此研究所建立的豬皮膚模型能為評估皮膚美容功效產品提供重要的實驗方法。

Part 1

儀器與材料

1.儀器

BSA323S電子天平（精度0.001g，德國賽多利斯公司）；PR224ZHE型電子天平（精度0.0001g，沙鷹科學儀器有限公司）；LC-2030C型高效液相色譜儀（日本島津公司）；UV-2600型紫外檢測器（日本島津公司）；TT-B（D）型Franz透皮試驗儀（天津市正通科技有限公司）；800D-1型離心機（常州天瑞儀器有限公司）；F6/10型電動均漿機（上海凈信實業發展有限公司）。

2.材料

谷胱甘肽閃釋膜片（QRMT， 規格130mg，批號HLG2405，常州偉博海泰化妝品有限公司研制）；LYUH ESTHER SALMON DNA DIRECT 5X （D-5X，規格326mg， 批號YGY 13028， 韓國BIO 360生產）；谷胱甘肽標準品（純度：98%，阿拉丁生化科技股份有限公司）; Luna C18色譜柱（Phenomenex公司）；FiveEasy Plus型pH計（梅特勒—托利多儀器有限公司）；BIO-DL型移液槍（賽多利斯公司）；濾膜（0.22 μm，天津津騰公4579da2f0b67ce21d849af674d7e19fd司）；色譜純乙腈（Fisher 公司）；5，5′—二硫雙-2—硝基苯甲酸（DTNB，批號 E1922062，阿拉丁生化科技股份有限公司）；試劑實驗用水為超純水（杭州娃哈哈集團有限公司）；生理鹽水，磷酸二氫鉀，磷酸為分析純（北京化工集團股份有限公司）。

3.動物

巴馬小型豬【合格證號：SCXK （蘇） 2022-0013，泰州泰和生物科技有限公司，雄性，日齡30，體重2.5-3.5 kg】。

Part 2

方法與結果

1.GSH含量測定與方法學驗證

（1）柱前衍生化：GSH化學結構中的巰基與DTNB試劑化學反應，生成的衍生物在pH值偏酸性流動相中，有明顯的紫外線吸收。

（2）色譜條件：色譜柱為C18 （4.6 mm150 mm，3.0 μm）；流動相A為乙腈， 流動相B為0.025%磷酸水（pH3.8），梯度洗脫程序：0～3 min， 12% A; 3～4.5 min， 12%～18% A;4.5～15 min， 18%～40%A；流速 0.8 mL/min；柱溫 40℃，檢測波長 330 nm；進樣量 20 μL。

（3）對照品溶液制備：精密稱取GSH對照品約10 mg，加入生理鹽水溶液溶解并定容于10 ml量瓶中，搖勻，即得濃度約為1.0 mg·mL-1的混合對照品儲備溶液，備用。

（4）線性關系考察：用移液槍分別量取對照品溶液不同體積，再加入生理鹽水溶液進行稀釋，搖勻，配制成質量濃度分別為100、50、10、5、1.0、0.10 μg·mL-1的系列對照品溶液。分別吸取上述各濃度對照品溶液各1mL，加入100 g·mL-1 DTNB 溶液1 mL，渦旋3 min，取20 L依次注入液相色譜儀，按上述色譜條件測定，以對照品濃度為橫坐標（X），峰面積為縱坐標（Y），繪制標準曲線，得GSH回歸方程為Y＝1.66E+04X+7.57E+03，r＝0.9998。結果表明，GSH的線性濃度分別為0.103—102.68 μg·mL-1。

（5）精密度試驗：取對照品（約1.0 μg·mL-1）溶液 20 μL，分別于同1 d之內連續進樣測定6次，并在6 d 之內連續進樣測定，記錄峰面積。結果顯示3個對照品溶液日內精密度RSD分別為2.68%、1.93%、1.31%，日間精密度RSD分別為2.12%、2.38%、18.7%。

（6）穩定性試驗：精密量取供試品溶液（QRMT離體豬皮膚透皮試驗中制備的豬皮膚表面和真皮層樣品） 0.5 mL，各加入100 g·mL-1 DTNB 溶液0.5 mL，渦旋反應3 min，0.22 m微孔濾膜過濾，續濾液分別于0h、1h、2h、4h、8h、24h測定峰面積，結果顯示峰面積RSD分別為1.38%和1.62%，表明供試品溶液在室溫條件下24 h內穩定性良好。

（7）回收率試驗：將剪碎的豬皮膚中加入GSH對照品溶液（100 μg·mL-1） 1.0 mL，再加入生理鹽水超聲，提取2次，每次5.0 mL水，合并提取液。取0.25 mL，按1：1比例分別加入對照品溶液0.25 mL，加入100 g·mL-1 DTNB 溶液0.5 mL，渦旋反應3 min，12000轉離心10 min， 上清液0.22 μm濾膜過濾。每個樣品平行制備3份供試品，按“2.1.2”項下色譜條件測定，計算回收率。GSH平均回收率范圍為97.2%—103.6%，平均RSD值為2.81%。

（8）專屬性試驗：取供試品溶液，對照品溶液、陰性樣品（豬皮提取液），按“2.1.2”項下色譜條件檢測，記錄色譜圖。對照品峰形良好，供試品與對照品在相應位置上存在相同峰，且陰性樣品溶液對測定結果不產生干擾。

2.離體豬皮透皮試驗

（1）離體豬皮制備：巴馬小型豬處死后立即剪取腹部皮膚，剝離皮下脂肪和結締組織，用95%酒精棉球反復擦試皮膚表面，再用生理鹽水沖冼干凈，濾紙吸干水分，備用。

（2）透皮試驗：參考文獻方法[6，7]，應用Franz透皮試驗儀進行透皮試驗，將豬皮膚置于接收池頂面，皮膚角質層向上與供給池接觸，真皮層與透皮接受液接觸。透皮接收液為生理鹽水5 mL。樣品（約含谷胱甘肽10 mg）直接加入至透皮供給池內（生理鹽水溶液）。擴散池水浴溫度37±0.5°C，攪拌速度450 r·min-1，取樣時間點1 h、2 h、4 h、6 h、8 h、12 h。皮膚表面樣品：用3只棉球分別擦試干凈皮膚表面殘留物，再用生理鹽水溶液沖洗皮膚表面3次，每次1 mL，然后將這些棉球放在生理鹽水中超聲提取，冷卻置室溫，定容置5 mL。為了減少實驗誤差對結果的影響，每個時間點平行6份。真皮層樣品制備：用棉球擦試干凈皮膚表面的殘留物，然后膠帶粘貼法粘貼表皮20次，將皮膚角質層粘下。然后將處理后剩余皮膚剪碎，在勻漿機內加入5 mL生理鹽水溶液進行勻漿處理，離心，取上清液，0.22 m微孔濾膜過濾。所有樣品均取 0.5 mL， 加入100 g·mL-1 DTNB 溶液0.5 mL，渦旋反應3 min，0.22 μm微孔濾膜過濾后進針HPLC分析。

（3）數據分析：單位面積皮膚上GSH在皮膚表面駐留量和皮膚內駐留量，按如下公式（1）計算：

Qr = C1×V1／S（1）

式中Qr （μg·cm-2）代表GSH在某個時間點的單位面積皮膚內駐留量；Ci （μg·mL-1）代表在GSH濃度；Vi （mL）代表提取溶液體積（5.0 mL）；S （cm2）代表擴散池暴露離體皮面積（0.71 cm2）。

3. 豬皮膚模型中GSH在皮膚表面和真皮層中駐留量

圖1顯示了QRMT和D-5X中GSH在豬皮膚模型中皮膚表面駐留量—累積時間曲線。相比較于D-5X，QRMT中GSH釋放皮膚表面速度更快，尤其是在1 h和2 h，Qr分別為5.5 倍和3.4倍（如表1所示）。如圖1B所示，QRMT中GSH可以更容易和更快速滲透進入皮膚真皮層。相反，D-5X中GSH在豬皮膚真皮層中駐留量相對較低。尤其是在1 h，2 h和12 h，QRMT中GSH在豬皮膚真皮層中駐留量分別是D-5X中GSH的25.1， 21.8和 1.9倍（如表1所示）。此外，QRMT中GSH在皮膚真皮層中的駐留量顯著高于皮膚表面駐留量，2小時后，真皮層中的駐留量約是皮膚表面駐留量的6.7倍（如表1所示）。

Part 3

討論

本研究通過建立一種豬皮膚模型評估方法，對GSH在皮膚表面和皮膚真皮層中的駐留行為進行了研究。通過柱前衍生化方法[8]，我們成功測定了GSH在不同時間點單位皮膚表面駐留量和皮膚真皮層中駐留量，為理解GSH在發揮皮膚美容功效中的作用提供了重要的實驗數據。

研究發現，QRMT中GSH在豬皮膚模型中的釋放和駐留行為表現出了顯著的時間依賴性。在皮膚表面，GSH的釋放速度較快，8h內即可達到相對穩定的表面駐留量。這表明GSH成分可能迅速作用于皮膚表層，提供即時的抗氧化和護膚效果。此外，QRMT 中GSH 在皮膚真皮層中的駐留量顯著高于皮膚表面駐留量，2h 后，真皮層中的駐留量約是皮膚表面駐留量的21.8 倍，這表示GSH 在更深層皮膚中的滲透速率和美白功效將達到更好的效果。這些結果對于皮膚護理產品的開發具有重要意義。QRMT 中GSH 的快速表面和真皮層中駐留可能使其成為理想的即時護膚成分。此外，12h 后， QRMT 中GSH 在皮膚表面和真皮層中具有較大駐留量，這可以增強GSH 在皮膚表層和深層皮膚中的功效的持久性。此外，研究還揭示了GSH 在不同皮膚層中的不同駐留行為，這為設計針對不同皮膚問題的護膚產品提供了科學依據。

盡管本研究取得了重要發現，但仍有一些局限性需要考慮。首先，本研究使用的豬皮膚模型與人類皮膚存在一定差異，盡管在很多研究中公認豬皮膚是與人類的皮膚生理結構最為接近的[9，10]，但也不能完成等同。因此，研究結果向人類皮膚的推廣需要注意不同皮膚之間的差異性。其次，研究僅評估了GSH 在短期內的駐留行為，長期效果尚未明確。

GSH 對皮膚有多種攻效，為了實現這些功效，需要GSH 在皮膚表面和皮膚真皮層均有足夠的駐留量，并且要能在皮膚內部持續足夠長的時間。目前的多數文獻研究主要是測定藥物在皮下接收液中透過量[11-13]，較少的研究同時測定皮膚中皮膚表面和皮膚真皮層中駐留量[14，15]。本研究以巴馬小香豬皮膚作為皮膚模型，同時測定GSH 在皮膚表面和皮膚真皮層中駐留量。該研究為開發能充分利用GSH 護膚功效的化妝品提供了一種新的研究途徑。

作者介紹

李和偉：博士，高級工程師，主要研究方向：化妝品和生物醫藥研究，

供職于常州偉博海泰化妝品有限公司

代 穎、魏國志：供職于常州偉博海泰化妝品有限公司

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