甲狀腺球蛋白檢測技術的研究進展

摘要 甲狀腺球蛋白（Thyroglobulin， Tg）是一種由甲狀腺濾泡細胞合成并分泌到血液中的大分子糖蛋白。血液中Tg 的濃度水平是判定分化型甲狀腺癌和亞急性甲狀腺炎等甲狀腺疾病的重要指標之一。放射免疫分析法、免疫放射分析法和免疫化學發光分析法是臨床檢測Tg 的主要方法。近年來，為了滿足甲狀腺清除術后對較低濃度血液Tg 的檢測需求，研究者開發了多種高性能分析方法用于血液樣本中Tg 濃度的檢測，為甲狀腺疾病篩查和療效評估提供了新的技術手段。本文綜述了Tg 的分析方法，尤其是近五年來用于血液中低濃度Tg 監測的生物傳感器研究的新進展，探討了其在實際臨床應用中面臨的技術挑戰，為開發分化型甲狀腺癌液體活檢新方法提供了參考。

關鍵詞 甲狀腺球蛋白；生物傳感器；甲狀腺疾病；液體活檢；評述

近年來，受環境污染和生活方式改變等因素影響，全球人群范圍內的甲狀腺疾病發病率均呈上升趨勢[1-7]。據統計，甲狀腺結節（Thyroid nodule， TN）的成人發病率約為50%～60%。其中，甲狀腺癌（Thyroidcarcinoma， TC）約占5%～15%，并呈逐年上升趨勢。包括甲狀腺乳頭狀癌（Papillary thyroid carcinoma，PTC）和甲狀腺濾泡狀癌（Follicular thyroid cancer， FTC）在內的分化型甲狀腺癌（Differentiated thyroidcancer， DTC）約占TC 的90%[5-6]。盡管DTC 通常預后良好，但是早發現和嚴格的術后健康管理等措施有助于進一步提高DTC 患者的生活質量。目前，超聲引導下細針穿刺（Fine needle aspiration， FNA）技術是術前診斷DTC 最有效的方法[7]。然而，受結節大小、形貌特征及臨床醫生的經驗等影響， FNA 技術存在15%～20%的誤診率。為進一步提高TN 診斷的準確性，包括甲狀腺球蛋白（Thyroglobulin， Tg）和TC 相關突變基因（如BRAFV600E）等在內的生物標志物檢測已逐漸成為TC 診斷的輔助手段[8-15]。

Tg 是由甲狀腺濾泡上皮細胞分泌的由兩個亞基組成的一種大分子糖蛋白（分子量約為660 kDa），是合成甲狀腺素和三碘甲狀腺原氨酸以及儲存非活性甲狀腺激素和碘的重要物質[13]。健康人群血液中Tg濃度的參考區間為3.0～40 ng/mL，甲狀腺腫、TC、甲狀腺毒癥和甲狀腺炎中毒期等甲狀腺疾病患者通常伴隨血液Tg 濃度顯著升高[7，16]。此外，血液Tg 濃度水平不僅能夠用于評估TN 的良惡性，而且能夠用于DTC 的預后評估和療效評價[7，16-17]。例如， DTC 患者血液Tg 濃度通常高于良性TN 患者；術前或未全切患者術后血液Tg 水平持續性升高，應警惕腫瘤的持續生長或復發。特別是對于已清除全部甲狀腺（手術切除和碘清甲后）的DTC 患者而言，體內已無Tg 的分泌來源，當在血液中檢測到Tg 時，則提示轉移性病灶的存在。因此，血液中Tg 濃度的高靈敏監測對于甲狀腺疾病的診療具有重要意義。

目前，臨床用于檢測血液中Tg濃度的方法包括放射免疫分析法（Radioimmunoassay， RIA）、免疫放射分析法（Immunoradiometric assay， IRMA）和免疫化學發光（Immunochemiluminometric assay， ICMA）（圖1）[18-24]。盡管這些方法具有較高的檢測特異性和準確性，但也存在放射性同位素危害、操作繁瑣、檢測時間較長、檢測成本較高和檢出限（Limit of detection， LOD）較高（≥1 ng/mL）等不足。持續、高靈敏檢測血液中Tg濃度（LOD≤0.04 ng/mL）對監測DTC復發具有重要意義，因此有必要研發低成本、高靈敏度的血液中Tg檢測方法用于DTC 術后監測和療效評估。近年來，一些基于納米材料的電化學、光學生物傳感器等新方法和新技術在臨床樣本檢測中的應用為血液中Tg 濃度監測提供了新的選擇（圖1）[25-35]。這些新技術能夠實現較低濃度Tg （pg/mL級）的檢測，有望彌補現有血液中Tg濃度臨床檢測技術的缺陷，進一步助力提升DTC的診療水平。本文綜述了Tg檢測技術的研究進展，以近五年來該領域的代表性文獻為例，討論了用于檢測Tg的多種新型生物傳感技術和分析方法的技術優勢，分析了其在實際臨床檢測中面臨的挑戰和機遇，希望不同領域的研究者協同合作，建立基于血液中Tg濃度水平檢測的DTC等甲狀腺疾病液體活檢（Liquid biopsy）新方法。

1 傳統臨床檢測方法

自20 世紀70 年代RIA 率先被用于臨床血液樣本中的Tg 檢測以來， RIA、IRMA 和ICMA 這3 種Tg檢測方法逐漸成為DTC 診斷和療效評估的輔助手段[18-24]。RIA 是通過放射性核素標記的Tg 與待測樣本中Tg 競爭結合特異性Tg 抗體，測定待檢樣品中Tg 的含量。IRMA 是采用過量的放射性核素標記的特異性Tg 抗體與待檢樣品中Tg 直接結合，采用固相免疫吸附載體分離結合與游離標記抗體的非競爭性分析方法。RIA 的信號強度與Tg 濃度呈負相關， IRMA 與Tg 濃度呈正相關。IRMA 的檢測速率、靈敏度、特異性和線性范圍優于RIA。由于IRMA 的抗體用量大于RIA，其檢測成本相對較高。當RIA/IRMA 用于臨床檢測時，為了減小因使用不同方法所導致的Tg 檢測結果的差異，必須使用CRM-457 作為標準參照品[22]。此外，由于RIA/IRMA 的LOD 值難以滿足DTC 復發監測的需求，因此需使用重組人促甲狀腺激素（Recombinant human thyrotropin， rhTSH）刺激DTC 術后患者，提升其血液中Tg 的濃度[23]。進入本世紀后，基于ICMA 的第一代超敏Tg 檢測方法逐漸用于臨床檢測。ICMA方法的靈敏度優于RIA，其LOD 可低至0.1 ng/mL[13，24]。因此，無需rhTSH 刺激， ICMA 即可實現DTC 術后患者的復發監測。但是，受DTC患者血液中高濃度Tg 抗體的干擾， ICMA 對低濃度Tg 測量的準確度仍需進一步提高。

2 傳感分析方法

2.1 電化學免疫傳感器

由于電化學檢測具有儀器簡單、快速和高靈敏度等優點，因此電化學生物傳感器被廣泛用于不同樣本中疾病生物標志物的檢測[36-38]。低成本、微型化的電化學生物傳感系統易集成到即時檢測（Point-ofcaretesting， POCT）設備中，其便攜性在疾病診斷中展現出巨大優勢。近年來，科研工作者研發了系列電化學免疫傳感器用于檢測血清中的Tg 濃度[29，39-42]。在電化學免疫傳感器中， Tg 抗體通常固定于工作電極表面， Tg 與Tg 抗體結合使工作電極電阻增大并導致電流下降。電阻或電流變化量的絕對值與待測樣品中的Tg 濃度成正比。Brito 等[40]將生物素標記的抗Tg 單克隆抗體（Biotin-labeled anti-Tg monoclonalantibodies）通過生物素與鏈霉親和素的特異性結合固定于鏈霉親和素-金納米粒子（Gold nanoparticles，AuNPs）-聚偏二氟乙烯（Polyvinylidene fluoride， PVDF）納米復合物修飾的金電極表面，制備了Tg 電化學免疫傳感器。AuNPs-PVDF 具有較高的比表面積，有助于提高鏈霉親和素在電極表面的固定量，改善傳感器的檢測靈敏度。該電化學免疫傳感器的線性范圍為2.0～10.0 ng/mL， LOD 為0.015 ng/mL， 加標回收率為95.4%。Wang 等[42]采用一步法將（3-氨基丙基）三乙氧基硅烷（（3-Aminopropyl）triethoxysilane，APTES）修飾的Tg 抗體通過Si?O 鍵固定于KOH 處理的硅基叉指電極（Interdigitated electrode， IDE）表面，構建Tg 電化學免疫傳感器。以APTES 為交聯劑能夠顯著提高Tg 抗體在IDE 上的固定量，從而改善對Tg 的捕獲能力。APTES-Tg 抗體修飾的IDE 對Tg 的檢出限低至1 pmol/L（66 pg/mL）。電化學Tg 免疫傳感器的LOD 能夠滿足清除全部甲狀腺的DTC 患者的血液Tg 濃度水平實時監測的需求，具有潛在的POCT 應用前景。

2.2 電化學發光免疫傳感器

電化學發光（Electrochemiluminescence， ECL）分析法綜合了電化學分析和化學發光技術的優勢[43-45]，而且ECL 的發光不需要使用外部光源，避免了激發光源的干擾，因此， ECL 測定具有低背景噪聲、高靈敏度和良好的可控性等優點，在疾病診斷、環境監測和食品安全等領域均具有良好的應用前景[43-45]。近年來， ECL免疫分析已逐漸成為Tg超靈敏測定的重要方法并成功實現了臨床應用[30，46-51]。特別是2013 年瑞士羅氏公司（Roche Co.）生產的含有鏈霉親和素的磁珠微粒、生物素化的抗Tg 抗體和Tris（2，2′-bipyridine）ruthenium（Ⅱ）（Ru（bpy）32+）標記的抗Tg抗體的ECL試劑盒（Elecsys? Tg Ⅱ），因具有低至40 pg/mL的LOD而被作為第二代超靈敏Tg 檢測方法，用于臨床DTC 的復發監測和療效評估[46]。與傳統的以Ru（bpy）32+和魯米諾等小分子為探針的ECL 體系相比，使用Ru（bpy）32+納米復合物和量子點等為ECL 探針，或在體系中引入納米材料作為ECL 增強劑，能夠進一步提高ECL 方法對Tg 的檢測靈敏度。如圖2 所示， Gao 等[50]以具有大比表面積和多孔結構的介孔二氧化硅納米星（Mesoporous silica nanostars， m-SiO2 NSs）作為載體材料，負載Ru（bpy）32+和共反應劑四乙烯五胺（Tetraethylene pentamine， TEPA），制備了具有自增強能力的ECL 探針Ru（bpy）32+-TEPA@m-SiO2 NSs。所獲得的Ru（bpy）32+-TEPA@m-SiO2 NSs 能夠通過縮短電子轉移路徑和減少能量損失實現更高效率的密集ECL 發射。以具有優異光熱效應的磁珠（Magnetic beads， MBs）光熱轉換劑修飾磁玻碳電極（Magnetic glassy carbon electrode， MGCE）作為基底（MB/MGCE），通過近紅外光（Near infraredlight， NIR）照射提高電極表面溫度，進一步放大ECL 信號。以Tg 修飾的Ru（bpy）32+-TEPA@m-SiO2 NSs 為ECL 探針（Ru（bpy）32+-TEPA@m-SiO2 NSs@Tg）、Tg 抗體修飾的MB/MGCE 為工作電極，成功構建了一種競爭型ECL 免疫傳感器。利用自增強和光熱協同放大策略，使所構建的競爭型ECL 免疫傳感器對Tg 的LOD 低至10?3 pg/mL，并具有較寬的線性范圍（10?5～10 ng/mL）。此外，血清加標回收實驗證明該競爭型ECL 傳感器具有良好的實際應用潛力。與Ru（bpy）32+、魯米諾、半導體量子點（Quantum dots， QDs）等ECL探針相比，碳量子點（Carbon quantum dots， CQDs）具有水溶性良好、導電性較強、生物相容性好、成本低和容易修飾等優點。利用CQDs 豐富的羧基官能團， Zhang 等[51]將Tg 修飾到CQDs 表面，合成了檢測Tg的新型ECL探針（CQDs-Tg）。以MGCE為工作電極、Tg抗體修飾的MBs為捕獲平臺、CQDs-Tg為ECL探針，構建了基于磁珠富集策略的均相電化學發光免疫分析方法（Homogeneous electrochemiluminescence immunoassay，HO-ECLIA）。在優化的實驗條件下， HO-ECLIA 具有較寬的線性范圍（0.01～100 ng/mL）， LOD低至6.9 pg/mL，血清中的加標回收率良好（99.5%～104%）。上述研究結果表明， HO-ECLIA 在DTC 的臨床預后監測中具有良好的應用潛力。

2.3 表面增強拉曼免疫分析方法

由于納米級粗糙金屬（金和銀等）基底能夠對其表面所吸附的化合物產生較強的物理增強（即表面局域等離子激元被激發所引起電磁增強）和化學增強（即表面原子簇對所吸附的分子構成拉曼增強的活性點）效應來增強待測物的拉曼信號，因此表面增強拉曼光譜（Surface-enhanced Raman spectroscopy， SERS）能夠實現復雜樣品中痕量目標物的高靈敏檢測[52-55]。已有研究表明，拉曼（Raman spectroscopy， RS）和SERS 技術能夠作為一種輔助診斷手段，通過對甲狀腺組織樣品中核酸、Tg 和外泌體等特定生物標志物的檢測或成像提高TC 早期診斷的準確性、敏感性和特異性[31，56-64]。Garaei 等[61-62]以具有較強局域表面等離子體共振（Localized surface plasmon resonance， LSPR）的Au-Ag 雜化雙金屬納米殼微球為基底，建立了一種高靈敏檢測Tg 的SERS 分析方法。由于雙金屬納米殼的粗糙表面能夠極大地增強Raman 信號（SERS 增強因子約為1.5×107），該方法成功獲得了單個Tg 的SERS 光譜。如圖3 所示， Spaziani 等[63]采用自組裝法在單晶硅片或光纖尖端制備三角形AuNPs 膜，并以其為SERS 基底，開發了一種用于Tg 檢測的夾心SERS 免疫分析方法。該方法通過在單晶硅片或光纖尖端（Optrode）修飾的AuNPs 自組裝膜固定Tg捕獲抗體，用于識別待測樣中的Tg；將Tg 檢測抗體和Raman 探針4–巰基苯甲酸（4-Mercaptobenzoicacid， 4-MBA）同時修飾到球形AuNPs 上，作為檢測探針。當Tg 存在時， Tg 捕獲抗體修飾的AuNPs 自組裝膜、Tg 和檢測探針形成夾心結構，使4-MBA 的Raman 信號得到極大增強。Tg 的濃度與4-MBA 的SERS 信號強度成正比，據此實現了對Tg 的定量檢測。該SERS 方法對Tg 的檢出限低至7 pg/mL，并成功應用于通過細針穿刺活檢（Fine-needle aspiration biopsy， FNAB）所獲得的實際樣本洗脫液中Tg 的檢測，進一步證明其能夠滿足臨床血液樣本中Tg 高靈敏檢測的需求。另外，以光纖尖端AuNPs 自組裝膜為基底的SERS 方法能夠整合于FNAB 成像光纖，實現POCT 檢測。

2.4 光纖局域表面等離子體共振免疫傳感器

表面等離子體共振（Surface plasmon resonance， SPR）對介質的折射率（Refractive index， RI）的變化高度敏感，因此， SPR 生物傳感器被廣泛用于無標記生物分子相互作用研究和實時檢測[65-69]。LSPR 是發生在納米顆粒或周期性陣列納米結構中的一種獨特的SPR，與依賴宏觀表面的SPR 相比， LSPR 可以通過控制納米結構的尺寸、形狀和組成調諧共振波長和增強靈敏度，因此LSPR 生物傳感器比傳統的平面SPR 生物傳感器具有更高的靈敏度[68-69]。此外，將光纖技術與LSPR 集成，即在光纖尖端構建LSPR 生物傳感器，因其具有體積小、靈敏度高、與遠程和實時監測的兼容性和多通道測量的潛力而備受關注。Omair 等[70]證明基于金納米棒（Gold nanorods， AuNRs）的LSPR 分析方法有望實現Tg 的單分子檢測。近年來， Lee 研究組[71-75]研發了多種光纖局域表面等離子體共振（Fiber-optical localized surface plasmon resonance，FO-LSPR）生物傳感器用于血清中Tg 的檢測。Kim 等[75]研發了一種基于納米間隙圓頂陣列（Dome arraywith nanogaps， DANG）的高性能光纖表面等離子體共振（FO-SPR）傳感器用于Tg的無標記實時檢測。首先在光纖尖端沉積30 nm的金膜，將粒徑為200 nm的羥基化聚苯乙烯珠（Hydroxylated polystyrene（PS） beads）吸附在金膜表面，然后采用離子刻蝕法（Reactive ion etching， RIE）去除未被PS珠覆蓋的金膜，獲得圖案化的納米圓頂（Nanodome），進一步通過逐層組裝法對納米圓頂進行聚合物涂覆，并沉積30 nm 厚的金膜，最終經退火去除聚合物涂層即可獲得DANG（圖4）。該研究結果表明，具有DANG 的FO-SPR 傳感器的折射率靈敏度比沒有納米結構的FO-SPR 傳感器高7.8 倍。在DANG 表面固定Tg 抗體后，所獲得的FO-SPR免疫傳感器對Tg檢測具有優異的選擇性和極低的LOD（38 fg/mL）。此外， FO-SPR免疫傳感器可用于血清樣本中Tg濃度水平的監測，表明其具有良好的實用性。

2.5 基于分子印跡的比色分析方法

比色法是通過比較或測量有色物質溶液的色深測定待測物含量的方法。與其它檢測方法相比，比色法檢測成本低、更直觀，無需復雜儀器即可對檢測目標物進行定性或定量分析[76-78]。分子印跡聚合物（Molecular imprinting polymers， MIPs）具有特異性好、穩定性高以及可重復使用等優點，已被廣泛應用于生物分析、環境檢測和食品安全等領域[79-80]。近年來，比色法與MIPs 及納米技術的結合使其具有較低的LOD、較高的靈敏度及準確度，進一步拓展了比色法在包括DTC 在內的重大疾病POCT 中的應用范圍[78，81-83]。Wang等[83]在紙基上以Tg和3，3′，5，5′-四甲基聯苯胺（3，3′，5，5′-Tetramethylbenzidine， TMB）為雙模板合成MIPs/血紅素-石墨烯納米片（H-GNs）復合材料（MIPs/Hemin-graphene nanosheets （H-GNs） composites），如圖5 所示。H-GNs 具有類過氧化物酶（Peroxidase-like）活性，可以引發自由基聚合制備MIPs，并催化過氧化物酶底物（TMB）顯色用于比色檢測。Tg-TMB雙印跡策略增強了TMB對催化界面的可及性且不干擾Tg模板分子的特異性識別，因此具有良好的靈敏度和特異性。在優化的實驗條件下，該比色傳感器的灰度強度與Tg 濃度在0.7～100 ng/mL 范圍內成正比，檢出限為0.1 ng/mL。血清樣本加標實驗結果表明，該方法可用于血清中Tg的測定，為DTC評估及復發監測提供了一種成本低、易操作且便攜的POCT傳感器。

3 結論與展望

Tg 濃度水平的檢測在DTC 等甲狀腺疾病診斷、預后和療效監測等方面具有良好的臨床應用前景。由于Tg 在外周血、淋巴洗脫液等臨床樣品中的濃度較低，特別是經甲狀腺清除治療后的DTC 病人外周血中的Tg 濃度極低，并且背景干擾大，其檢測具有很大的挑戰性。傳統的RIA、IRMA 和ICMA 臨床檢測方法的LOD 較高且易受樣本中共存的Tg 抗體的干擾，僅能夠檢測DTC 患者術前血液樣本或腫瘤組織樣本中的Tg 濃度。在DTC 術后監測過程中，通常使用ECL 免疫分析方法檢測患者血液樣本中Tg 的濃度。近年來，研究人員研發了基于光學和化學等不同檢測原理，具有簡單、快速、低成本和靈敏度高等優點的傳感系統用于定量檢測血液中Tg 濃度。但是，絕大多數Tg 生物傳感器仍處于概念的可行性和準確性驗證階段，需要進一步對產品進行設計和優化才能進入臨床應用。未來， Tg 檢測方法的研究應關注以下幾個方面。（1）盡管ECL 免疫傳感器已經用于臨床應用，但需使用專用設備和配套試劑，檢測成本較高，通過發展高性能新型ECL 探針（量子點等）和共反應物有望降低ECL 免疫傳感器對Tg 的檢測成本并提高檢測靈敏度。（2）ECL 免疫傳感器的靈敏度和選擇性易受樣品中血清蛋白等高豐度組分的影響，檢測的準確性仍需進一步提高。發展電極表面修飾技術，將抗污高分子等引入到電極界面，以降低血清蛋白等干擾物在電極表面的吸附，能夠提升ECL 免疫傳感器對血液等復雜樣品中Tg 檢測的準確性。（3）傳感器的檢測性能受電極/基底等傳感界面、納米標記物表面Tg 抗體的固定量、取向等因素影響，不同實驗室制備的同類傳感器性能存在較大的差異。建立界面修飾、信號探針的大規模、標準化制備工藝，有助于消除不同實驗室之間同類Tg 傳感器的制備差異。（4）將低成本的Tg 生物傳感器和信息科技深度融合，有望實現其在POCT 中的大規模應用。總之， Tg 生物傳感技術的發展將為DTC 等甲狀腺疾病患者的健康管理提供新的技術手段。

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吉林省自然科學基金-國家重點實驗室（學科類）重大專項項目（No. SKL202302030）資助。