煙草GAPDH全基因家族鑒定及其在煙苗發育早期的表達分析

摘 要：

甘油醛-3-磷酸脫氫酶（Glyceraldehyde-3-phosphate Dehydrogenase，GAPDH）是糖酵解、糖異生和卡爾文循環的重要酶，同時在植物應對非生物脅迫和激素響應中具有重要作用。為更好地了解NtGAPDH基因家族的特征并預測基因功能，本研究利用生物信息學方法鑒定了煙草GAPDH基因家族，并結合轉錄組學和qRT-PCR技術分析其在不同條件下的表達模式。結果表明：煙草有18個NtGAPDHs基因，均屬于磷酸化GAPDH，分為NtGAPA、NtGAPB、NtGAPC、NtGAPCP 4類，分布在14條染色體上，屬于兩個亞家族。這些基因編碼的氨基酸介于263～542個，等電點在5.12～9.01，相對分子質量為28 802.92～59 315.82 Da。NtGAPDHs基因的啟動子區域含有多種順式作用元件，包括光響應元件和脫落酸響應元件等。轉錄組學分析表明，NtGAPDH基因家族成員在不同光環境下的表達模式不同，在光照條件下的表達水平普遍高于黑暗條件，特別是在種子萌發和幼苗早期發育階段。特定NtGAPDHs基因和蛋白在光照下的高表達暗示其在煙草對光信號響應中的關鍵作用。研究結果為揭示煙草GAPDH家族基因響應光誘導調控煙草幼苗早期發育的調控機制提供理論參考。

關鍵詞：

煙草；GAPDH基因家族；生物信息學分析；轉錄組；表達分析

中圖分類號：S572

文獻標識碼：A

文章編號：1008－0457（2024）05－0008－10

國際DOI編碼：10.15958/j.cnki.sdnyswxb.2024.05.002

甘油醛-3-磷酸脫氫酶（Glyceraldehyde-3-phosphate Dehyrogenase，GAPDH）普遍存在于高等植物中，在糖酵解和光合作用碳同化等過程中起重要作用。根據生化特性，GAPDH可分為磷酸化和非磷酸化兩大類，前者又可細分為葉綠體GAPA/B、胞質GAPC和質體GAPCP3種亞型［1］。GAPDH通過催化甘油醛-3-磷酸的氧化和磷酸化，利用NADP+生成1，3-二磷酸甘油酸，為糖酵解過程提供能量，并顯著影響光合作用效率，特別是在光照條件下［2-3］。葉綠體GAPDH由GAPA和GAPB基因編碼，形成異源四聚體（A2B2），以NADP+為輔酶，參與卡爾文循環中的二氧化碳固定［2］。胞質GAPDH在糖酵解和糖異生過程中催化D-甘油醛-3-磷酸生成1，3-二磷酸甘油酸，同時將NAD還原為NADH［4］。質體GAPDH在非綠色質體中以NAD+為輔酶，參與兩個連續反應，生成3-磷酸甘油酸和ATP［5］。非磷酸化GAPDH依賴于NADP+，在細胞質中催化甘油醛-3-磷酸轉化為3-磷酸甘油酸，并生成NADPH，但不產生ATP［6］。另外，GAPDHs還參與自噬［7-8］、mRNA調節［9］、基因表達調節［10］、免疫應答反應［11］和氧化還原反應［12-13］等生物功能。GAPDH定位于多種亞細胞結構，如細胞質、細胞核、膜、線粒體［1，14］和葉綠體［15］，并與各種蛋白質伴侶相互作用［16-17］。GAPDHs在非生物脅迫耐受中也起著關鍵作用，如在煙草干旱耐受性［18］、水稻耐鹽性［19］和擬南芥根中重金屬脅迫反應［20］中均有研究。

煙草（Nicotiana tabacum L.）屬于喜光植物，黑暗條件會導致煙草葉片發育不成熟，根系部位生長活力減弱，體內干物質積累減少進而影響煙草品質［21］。通過比較不同光環境下煙草種子萌發到早期幼苗發育過程中的差異表達基因編碼蛋白構建的蛋白質互作網絡（Protein-Protein Interaction Networks，PPI），發現煙草NtGAPDH基因家族在該過程中起到重要作用，而且在光暗環境中具有差異化的表達模式［22］。在前期基礎上，本研究在煙草全基因組水平上對NtGAPDH基因家族進行分子進化和保守結構域分析，并以普通煙草‘云煙85’為試驗材料，對煙草在光暗環境下幼苗發育過程中的NtGAPDH基因家族成員進行了轉錄和蛋白表達分析，結果將為煙草種子萌發和早期幼苗發育光響應生物學過程中NtGAPDHs的功能研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 NtGAPDHs基因家族的鑒定

煙草的全基因組序列（Nitab-v4.5_genome_Chr_Edwards2017.fasta）和注釋文件（Nitab-v4.5_gene_models_Chr_Edwards2017.gff）從茄科植物基因組數據庫（https：//solgenomics.net/）獲取。擬南芥GAPDH家族（包括AtGAPAs、AtGAPBs、AtGAPCs、AtPGAPCPs）蛋白序列從擬南芥基因組數據庫TAIR（https：//www.arabidopsis.org/）、植物基因組數據庫phytozome13（https：//phytozome-next.jgi.doe.gov/）和NCBI（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）獲取。利用TBtools軟件的Fasta Extract （Recommended）工具提取煙草的CDS序列，并使用Batch Translate CDS to Protein模塊將其翻譯為蛋白，并與擬南芥GAPDH家族蛋白序列進行雙向Blast比對，獲得初步的NtGAPDHs家族成員。將這些初篩過的蛋白序列通過NCBI的ProteinBlast板塊進行二次Blast比對，并使用CD-Search工具對蛋白的保守結構域進行分析，去除冗余，獲得NtGAPDHs家族成員。

1.2 NtGAPDHs基因家族特征分析

使用TBtools的Amazing Gene Location From GFF3/GTF File工具將染色體定位可視化。利用在線預測軟件Expasy（https：//web.expasy.org/protscale/）對NtGAPDHs的分子式、分子量和等電點進行預測。采用WolF PSORT網站（https：//wolfpsort.hgc.jp/）進行亞細胞定位預測。

1.3 NtGAPDHs蛋白的系統發育關系及基因和蛋白結構分析

通過MAGE 7軟件對煙草和擬南芥的GAPDHs蛋白序列進行比對，將bootstrap值設置為1000，采用鄰接法（NJ）構建系統發育樹，使用Itol網站（https：//itol.embl.de/）對進化樹進行美化。利用GSDS網站（http：//gsds.cbi.pku.edu.cn/）對NtGAPDHs家族進行基因結構分析。通過MEME網站（https：//meme-suite.org/meme/doc/meme.html）對煙草NtGAPDHs蛋白序列的保守基序（motif）進行預測，并將目標保守基序的數量設置為10。利用TBtools軟件對煙草基因組注釋文件進行解析，并對NtGAPDHs家族的motifs和保守結構域（conserved domain）進行整合和可視化分析。

1.4 NtGAPDHs基因家族順式作用元件預測

使用TBtools軟件從煙草基因組序列和注釋文件中提取NtGAPDHs基因上游2000 bp的啟動子序列，通過PlantCare網站（https：//www.plantcare.co.uk/）對其進行順式作用元件的預測，利用TBtools工具進行可視化。

1.5 不同條件下煙苗中NtGAPDHs表達分析

供試煙草品種‘云煙85’的種子由貴州煙草科學研究院提供。授粉后40 d收獲所有種子，并在熱空氣干燥器中40 ℃的環境下機械干燥36 h。脫粒后的種子在室溫下進行儲存，所有試驗在1個月內進行。試驗設2個光環境處理，每個處理3次重復，分別在持續黑暗和12 h光/暗間斷的光周期條件進行種子萌發和幼苗發育試驗。在播種后的第2、4、6 d對種子整體取樣，進行轉錄組和蛋白組測序。本研究從上述轉錄組和蛋白組數據中篩選出煙草GAPDH基因的差異表達基因和差異表達蛋白。用Excel軟件進行數據整理并作圖。

1.6 qRT-PCR分析

采用植物RNA提取試劑盒DNase I（康為生物，江蘇）提取總RNA。通過HiFiScript gDNA Removal RT MasterMix（康為生物，江蘇）快速去基因組逆轉錄預混液去除雜質，隨后使用HiFiScript cDN Synthesis Kit（康為生物，江蘇）合成cDNA，采用一步法熒光定量PCR試劑盒UltraSYBR One Step RT-gPCR Kit ultraSYBR（康為生物，江蘇）進行實時熒光定量PCR（qRT-PCR）。相對表達量按公式2-△△Ct計算［23］。0 d歸一化表達量為1，然后計算取樣時間與0 d相比的Fold Change變化。NtGAPDHs基因特異性引物與內參基因煙草肌動蛋白基因Actin（Tac9）［24］見表1。

2 結果與分析

2.1 煙草GAPDHs基因家族的鑒定和理化性質分析

基于煙草基因組數據，從煙草中一共鑒定出18個磷酸化煙草NtGAPDHs基因家族成員，并未發現非磷酸化NtGAPDHs。根據基因在染色體上的位置，將這18個NtGAPDHs基因家族成員依次命名為NtGAPA1-1～11、NtGAPA2-1～2、NtGAPB、NtGAPC2-1～3、NtGAPCP，見表2。使用TBtools提取NtGAPDHs的蛋白序列，并進行理化性質分析。這些NtGAPDHs蛋白的氨基酸長度在263～542個氨基酸之間，平均為437個氨基酸，蛋白質相對分子質量在28 802.92～59 315.82 Da，等電點在5.12～9.01。根據這些蛋白的不穩定系數全部小于40可以得出，NtGAPDHs蛋白結構穩定，根據這些蛋白的平均親水性可以看出，除了NtGAPA1-2、NtGAPA1-4、NtGAPA1-9和NtGAPA1-11之外其他蛋白的總平均親水性均為負值，均是親水性蛋白。亞細胞定位預測結果顯示，有12個NtGAPDHs蛋白定位在細胞質中，有14個NtGAPDHs蛋白定位在葉綠體中，有9個NtGAPDHs蛋白定位在線粒體中，只有2個NtGAPDHs蛋白定位在過氧化物酶體和細胞核。

2.2 NtGAPDHs基因家族的系統發育分析

為了研究煙草與擬南芥GAPDH家族的進化關系，以擬南芥和煙草共26個GAPDHs基因進行進化樹的構建（圖1）。進化樹分析結果表明，擬南芥AtGAPDHs基因主要分為胞質AtGAPDH（AtGAPCP）、葉綠體AtGAPDH（AtGAPA/B）、非磷酸化AtGAPDH（AtNPGAPDH）、質體AtGAPDH（AtGAPC）。根據系統發育樹可將煙草NtGAPDH基因家族進化樹大致分為5部分，Ⅰ區與擬南芥非磷酸化GAPDH（AtNPGADPHs）聚為一簇，Ⅱ區與擬南芥質體GAPDH（AtGAPC）和葉綠體GAPDH（AtGAPB）聚為一簇，Ⅲ區與擬南芥葉綠體GAPDH（AtGAPA）聚為一簇，IV區與擬南芥胞質GAPDH（AtGAPCP）聚為一簇，說明它們分別與擬南芥AtNPGAPDH、AtGAPC、AtGAPB、AtGAPA、AtGAPCP基因具有較高同源性。

2.3 NtGAPDHs基因家族的基因結構、蛋白結構域和保守motif分析

基因家族成員在序列上具有保守性和相關性，外顯子-內含子的基因結構能反應基因進化的特征，并為基因的功能分化提供支持。將NtGAPDHs家族的基因結構、蛋白結構域和保守基序及其系統進化樹使用TBtools軟件進行整合可視化。通過MEME網站在線分析，預測18個NtGAPDHs蛋白的保守motif，獲得了10個相對保守的motif，這些保守基序的長度介于21～50個氨基酸（圖2）。經過NCBI-CDD數據庫注釋后發現，NtGAPA1-3、NtGAPA1-6、NtGAPA1-8、NtGAPA1-10含有PLN02466 Super family結構域；NtGAPA1-1、NtGAPA1-7含有PLN02467結構域；NtGAPA1-2、NtGAPA1-9含有ALDH-FS Super family結構域；NtGAPA2-2、NtGAPB、NtGAPAC2-2～3、NtGAPCP含有PLN02272 Super family結構域等（圖3-a）。同時，motif之間的排列具有一定的規律性（圖3-b），NtGAPA1-1～10均存在motif8-motif6-motif10-motif4的相對穩定的結構，但是存在NtGAPA1-1、NtGAPA1-4、NtGAPA1-7基因多了1個motif9-motif2結構，NtGAPA1-3、NtGAPA1-6、NtGAPA1-8、NtGAPA1-10多了1個motif8-motif9-motif2的現象。而NtGAPA1-11、NtGAPA2-1～2、NtGAPB、NtGAPC2-2～3、NtGAPCP均存在motif8-motif5-motif1-motif3的相對穩定結構。這些結果表明不同的NtGAPDHs基因家族成員在序列上可能存在部分差異，同時會有部分基因出現保守基序缺失或增加的現象，說明煙草NtGAPDH基因家族在進化過程中可能存在結構特征差異。為進一步分析煙草NtGAPDHs基因之間的進化關系，構建了煙草NtGAPDHs的基因結構圖（圖3-c）。結果顯示，不同的煙草NtGAPDHs家族成員內含子和外顯子數量有差異。

2.4 NtGAPDHs基因家族成員的染色體定位分析

煙草GAPDH家族成員的染色體定位如圖4所示。煙草GAPDH基因家族18個基因不均勻的分布在14條染色體上（Chr.1、Chr.3、Chr.4、Chr.5、Chr.8、Chr.12、Chr.14、Chr.15、Chr.17、Chr.19、Chr.20、Chr.22、Chr.23、Chr.24）。同時由圖4可以看出，煙草GAPDH基因的數量和染色體的長度之間沒有必然的聯系，每條染色體上排列的基因數目差別不大，所有染色體上只含有1～2個基因，Chr.4、Chr.15、Chr.20和Chr.22四條染色體上的GAPDH基因數目最多，均含有2個基因，且Chr.20染色體上出現了基因成簇排列的現象，比如NtGAPA1-10與NtGAPC2-3就聚為一簇。

2.5 NtGAPDHs基因家族成員順式作用元件預測

順式作用元件能夠調控基因表達，進而反映出基因功能。選取NtGAPDHs基因上游2000 bp的序列進行NtGAPDH基因家族成員順式作用元件的分析。煙草NtGAPDHs基因家族成員的順式作用元件預測結果如圖5所示，NtGAPDHs基因啟動子共預測到34類順式作用元件，包括生長素反應元件、細胞周期調控作用元件、防御和應激反應作用元件、赤霉素反應作用元件、光反應作用元件、低溫反應作用元件、水楊酸反應作用元件、脫落酸反應作用元件、厭氧誘導調控元件、參與生長素反應調控元件、晝夜節律控制調節元件、光反應的調控元件、MeJA反應作用調節元件、玉米醇溶蛋白代謝調控元件、分生組織表達調控元件、胚乳表達調控元件、柵欄葉肉細胞分化的調控元件、光響應元件、MYB結合位點參與干旱誘導、MYB參與光反應結合位點、創傷反應元件等，其中參與光響應和脫落酸反應的順式作用元件最多，為221個，在所有的NtGAPDHs基因中均有涉及。其次預測到脫落酸響應元件有53個，MeJA反應作用調節元件26個。這些說明了NtGAPDH基因家族不同成員不僅在光信號響應中發揮了重要作用，同時能廣泛的參與煙草的生長發育過程包括激素代謝、生長調控、信號轉導等，而且還能響應生物與非生物脅迫。

2.6 NtGAPDHs在光暗環境下的轉錄和翻譯模式分析

煙草種子屬于需光種子，并且煙草對不同的光環境反應強烈，因此弱光或黑暗環境是限制煙草產量提升的重要非生物脅迫。通過黑暗處理后種子萌發到早期幼苗發育（2、4、6 d）的轉錄組分析GAPDHs家族響應情況發現（圖6-a），在種子萌發到早期幼苗發育階段鑒定到的差異表達的NtGAPDHs基因有17個，NtGAPDHs基因在不同環境中均有表達，并且不同NtGAPDHs在種子萌發和幼苗發育階段的各發育時期表達水平不同，同一NtGADPH在不同的發育時期表達水平也存在差異。光照可顯著提高NtGAPA1-3、NtGAPA1-9、NtGAPA1-10、NtGAPA2-2、NtGAPC2-3和NtGAPCP在煙草種子孵育的第2天中的表達量。在煙草種子孵育的4 d，NtGAPA1-1、NtGAPA1-6、NtGAPB在光照環境下的表達水平要明顯高于暗環境。在煙草幼苗發育（6 d）階段，NtGAPA1-2～5、NtGAPA1-7～11、NtGAPA2-1～2、NtGAPC2-2的表達水平較高。在種子萌發到早期幼苗發育階段共鑒定到3個差異蛋白（圖6-b），分別為NtGAPA1-6、NtGAPA1-11、NtGAPA2-2，它們在種子萌發的第6天表達水平要明顯高于第2天和第4天，且在光環境下的表達量要高于黑暗環境下。

2.7 黑暗條件下NtGAPDHs基因的qRT-PCR驗證

為了證實NtGAPDHs參與了煙草種子萌發過程中的暗脅迫反應，采用qRT-PCR方法驗證了種子在光暗環境下NtGAPDHs基因的表達情況；測定結果如圖7所示，NtGAPDHs基因的表達趨勢與轉錄組結果基本一致。

3 討論與結論

在光合作用中，GAPDHs通過糖酵解途徑為光反應提供能量和還原力［1-6］。逆境脅迫如干旱、鹽分脅迫、重金屬和極端溫度等，會激活植物的應激響應機制，其中GAPDHs可能通過參與抗氧化系統和信號傳導途徑來保護植物免受損傷［18-22］。此外，GAPDHs在細胞內部的作用［7-13］，進一步凸顯了其在植物生長發育中的關鍵角色。本研究發現煙草NtGAPDHs家族基因在不同光環境下發育的煙草早期幼苗中表達模式存在差異，NtGAPDHs在吸脹種子和萌發后的種子中的表達量高于即將萌發的種子。12 h光/暗周期的光環境下其大部分相對表達水平要高于黑暗環境。而在種子萌發到早期幼苗NtGAPDHs家族蛋白的表達豐富為萌發后的幼苗高于吸脹的種子和即將萌發的種子，亦是在光環境下的表達要高于暗環境，說明光可能激發了NtGAPDHs基因和（或）蛋白表達水平。

NtGAPDHs在光環境下的高表達可能有助于調節這些代謝途徑，以適應光合作用的增強和能量需求的變化。隨著植物基因組研究的不斷推進，越來越多的植物物種的基因組被全面解析，甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）基因家族成員在許多植物中被成功鑒定。這些研究不僅揭示了GAPDH基因家族在不同植物中的多樣性，也為我們理解這些基因在植物生理功能中的角色提供了寶貴的線索。研究表明，不同植物物種中GAPDH基因家族成員的數量存在顯著差異[25-28]。在西瓜（Citrullus lanatus （Thunb.） Matsum. & Nakai）基因組中鑒定出了15個ClGAPDHs成員［25］；在甜橙（Citrus sinensis）基因組中，這一數量多達46個CsGAPDHs成員［26］；在大豆（Glycine max）中則鑒定到了16個GmGAPDHs成員［27］。本研究中，我們在煙草的參考基因組中鑒定出了18個NtGAPDHs成員，這些基因不均勻地分布在煙草的14條染色體上，這一現象可能反映了基因的復雜調控機制及其在不同發育階段或環境條件下的不同功能。

煙草作為一種重要的經濟作物，GAPDH基因家族的研究不僅有助于揭示這些基因在光合作用、脅迫應答等過程中的功能，也能夠更好地理解這些基因在植物生理功能中的角色，還能為煙草的改良和育種提供新的策略。例如，通過調控NtGAPDHs的表達，可能增強煙草對光能的利用效率，提高其對逆境脅迫的抵抗力，從而培育出更適應不同環境條件的新品種。此外，這些研究結果也為其他植物物種中GAPDH基因家族的功能研究提供了參考，有助于揭示GAPDH基因在不同植物中的多樣性和演化趨勢。

本研究在煙草中（N. tabacum）鑒定了18個NtGAPDHs基因，并對它們的系統發育關系、保守基序、基因結構和表達水平進行了研究。18個NtGAPDHs可為兩個亞家族，并且在每個亞家族中具有相似的基因結構和保守基序。順式作用原件分析表明NtGAPDHs對光照、脅迫、植物激素具有不同的響應模式。此外，轉錄組學、qRT-PCR分析表明，NtGAPDHs在煙草早期發育的過程中具有顯著的時間表達差異，并且受不同光環境的誘導會顯示出不同的表達模式。本研究結果為闡明NtGAPDHs的生物學功能提供了參考，并有助于選擇合適的煙草遺傳改良候選基因。

（責任編輯：段麗麗）

參 考 文 獻：

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Genome-wide Identification of the GAPDH Gene Family and Their Expression Analysis During the Early Development of Tobacco Seedlings

Chen Yubin1，2，Liu Qiyuan1， Luo Yan1， Peng Keqin1，Lv Yuanbing1，Liu Yiling3， Li Zhenhua1*

（1.Guizhou University， College of Agriculture/Key Laboratory of Molecular Breeding for Grain and Oil Crops in Guizhou Province/Key Laboratory of Functional Agriculture of Guizhou Provincial Higher Education Institutions， Guiyang 550025， Guizhou， China; 2.Guizhou Maotai Distillery （group） Hongyingzi Agricultural Science and Technology Development Co.， Ltd， Zunyi 564500， Guizhou， China; 3.Guizhou Key Laboratory for Tobacco Quality， College of Tobacco， Guizhou University， Guiyang 550025， Guizhou， China）

Abstract：

Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase （GAPDH） is an pivotal enzyme involved in glycolysis， gluconeogenesis， and the Calvin cycle， while also serving a crucial role in plant responses to abiotic stress and hormone signaling. This study aimed to elucidate the characteristics and predict the functions of the NtGAPDH gene family by employing bioinformatics to identify the tobacco GAPDH gene family and investigating their expressionprofiles under dark conditions using a combination of transcriptomics， proteomics， and qRT-PCR. The research revealed that tobacco contained 18 NtGADPHs genes， all of which were classified as phosphorylated GAPDH， and were further divided into four types （NtGAPA， NtGAPB， NtGAPC， NtGAPCP）. These genes were located on 14 chromosomes， and were part of two subfamilies. The genes encode amino acids ranging from 263 to 542， exhibiting isoelectric points between 6.54 and Their promoter regions contain various cis-acting elements， including light-responsive and abscisic acid-responsive elements. 9.01， and relative molecular masses ranging from 28，802.92 to 59，315.82 Da. The promoter regions of these genes contained various cis-acting elements， including light-responsive and abscisic acid-responsive elements. Transcriptomic and proteomic analyses revealed distinct expression patterns among members of NtGAPDH gene family in response to varying different light conditions. Higher expression levels were observed in light-exposed conditions compared to dark conditions， especially during seed germination and early seedling development stages. The high expression of specific NtGAPDH genes and proteins in response to light indicated their significant involvement in tobacco's light signal response. These findings provide a theoretical basis for understanding the regulatory mechanisms of the tobacco GAPDH gene family in response to light-induced control during early seedling development.

Keywords：

tobacco; GAPDH gene family; bioinformatics analysis; transcriptome; expression analysis