花椒BAHD?；D移酶基因家族鑒定及表達差異分析

摘 要：

麻味物質是評價花椒（Zanthoxylum bungeanum Maxim.）品質的重要特征性成分之一，為了挖掘花椒麻味物質合成途徑酰化反應的候選基因，本研究基于花椒全基因組數據，通過生物信息學方法，對花椒BAHD?；D移酶基因家族進行了研究。研究結果共鑒定出50個花椒BAHD?；D移酶基因家族成員，這些基因可分為兩大亞家族，均編碼不穩定親水性蛋白；亞細胞定位分析表明大部分花椒BAHD成員主要定位于細胞質，其它成員定位于細胞核、葉綠體等細胞器中。基因表達分析顯示，BAHD?；D移酶基因在花椒果皮發育各階段均有特異性的表達，且在果梗、刺、莖和花中表達高于種子和葉。不同花椒品種間，即使相同基因也表現出表達差異，甚至在某些品種中未檢測到表達。此研究為花椒麻味物質合成途徑提供了新的基因資源，并將為其它高等植物BAHD酰基轉移酶基因家族的研究提供參考。

關鍵詞：

花椒；麻味物質；BAHD?；D移酶基因家族；基因表達

中圖分類號：S573.9

文獻標識碼：A

文章編號：1008－0457（2024）05－0073－14

國際DOI編碼：10.15958/j.cnki.sdnyswxb.2024.05.012

花椒（Zanthoxylum bungeanum Maxim.）為蕓香科花椒屬落葉小喬木多年生植物，是著名的“八大調味品”之一，也位于“十三香”之首，具有重要的經濟、藥用及生態價值。中國是花椒的原產國，其產量和種植面積均居世界首位。以山椒素為代表的一系列鏈狀不飽和脂肪酸酰胺類化合物，是花椒中呈現麻味的最基本的物質基礎[1-2]，主要分布在花椒果皮表面的凸起上，而在花椒中產生最具代表性的辛麻感的化合物是羥基-α-山椒素，花椒主要通過酰胺基團使人感受到麻辣的感覺，麻味的原理是花椒麻素對觸覺神經和口腔黏膜造成的一種輕微的電擊效應，這種效應可以產生50 Hz的振動頻率。辛麻味的物質是花椒樹植物的特征成分，是其重要的品質評價指標[3-4]。辛麻味物質是花椒屬植物的特征成分，是其重要的品質評價指標，也是吸引消費者和提高市場競爭力的重要因子。目前對于花椒麻味物質的研究則主要側重于對麻味物質的提取分離、生物活性和呈麻機理的研究，而對于花椒麻味物質生物合成途徑的研究較少，通過對花椒麻味物質的合成途徑的研究則將有助于進一步篩選出對花椒麻味物質有影響的基因，為之后通過現代生物技術手段改良花椒品種，從而提高其麻味物質的含量及品種提供一定依據與借鑒。

花椒中的麻味物質——不飽和脂肪酸酰胺類化合物則與植物中存在的?；Y構修飾過程有關。?；巧矬w內的重要反應，涉及催化含氧、含氮及其含硫化合物的合成，以產生相應的酯和酰胺產物［5］。植物中催化?；磻拿讣礊轷；D移酶，這一類能夠催化活性?；w轉移至特定受體的酶家族就是BAHD?；D移酶家族。BAHD?；D移酶家族是植物中修飾初生和次生代謝物的關鍵蛋白質。它們以?；o酶A為供體，生成多種揮發性脂質、修飾花青素等，與植物對病原微生物的抗性緊密相關，進而在信號轉導、脅迫防御和代謝穩態中扮演重要角色［6］。BAHD?；D移酶家族是以其前4種生化表征酶的首字母來命名的，包括芐醇O-乙酰轉移酶（BEAT）、花青素O-羥基肉桂酰轉移酶（AHCT）、鄰氨基苯甲酸N-羥基肉桂酰/苯甲酰轉移酶（HCBT）和脫乙酰乙酸麒多啉4-O-乙酰轉移酶（DAT）［6］。

據報道，BAHD?；D移酶家族成員廣泛存在于多種植物中，如模式植物擬南芥、大麥、水稻和楊樹，以及具有藥用和經濟價值的植物，如梨（Pyrus spp.）、苦皮藤（Celastrus angulatus）、茉莉花（Jasminum sambac）、茶（Camellia sinensis）和紅豆杉（Taxus wallichiana var. chinensis）［7-16］。這些BAHD蛋白在植物體內扮演著重要角色，它們參與了多種活性?；烊划a物及其前體的形成過程，其產物包括生物堿、芳香醇/胺、脂肪醇/胺、萜類化合物以及糖分解劑等［17］。

本研究將利用生物信息學技術，依托全基因組數據資源，對花椒中的BAHD?；D移酶家族的成員進行篩選鑒定，通過對花椒中BAHD?；D移酶基因家族的系統發育、進化及理化性質進行分析，同時利用花椒轉錄組數據來對花椒不同品種、不同部位、不同時期果皮中花椒的BAHD?；D移酶基因表達情況進行分析，對鑒定出的BAHD基因進行進一步分析與篩選，以期找出與花椒麻味物質合成相關的候選基因。本研究為花椒BAHD?；D移酶基因家族的研究提供了理論依據，并且將為其他植物BAHD?；D移酶基因家族的研究提供一定依據和借鑒。

1 材料與方法

1.1 花椒BAHD基因家族成員的鑒定

為了鑒定花椒基因組中的BAHD酰基轉移酶基因家族成員，首先從Pfam數據庫中獲取了BAHD?；D移酶家族的HMM模型（PF02458），并用此模型通過隱馬爾科夫模型軟件（HMMER）在花椒基因組數據庫［18］中篩選出潛在的BAHD?；D移酶基因家族成員。此外，采用擬南芥BAHD蛋白序列［19］作為查詢序列，通過BLAST軟件對花椒蛋白序列進行比對，獲取所有潛在的BAHD?；D移酶基因家族成員的蛋白序列。最后，使用SMART軟件［20］和INTERPRO［21］在線工具欄中pfam軟件來對這些候選基因的保守結構域進行分析，并驗證這些候選基因的保守結構域的完整性，剔除掉其中不含BAHD家族特征結構域的候選序列，最終得到擁有BAHD酰基轉移酶家族特征結構域的花椒BAHD家族成員的序列。

1.2 花椒BAHD?；D移酶基因結構及系統發育分析

從花椒基因組中共鑒定出50個BAHD?；D移酶蛋白序列。采用ClustalX軟件［19］對大麥、擬南芥、東北紅豆杉、苜蓿、大豆、瓜葉菊、甜瓜等（附表1）34個物種［20］的BAHD?；D移酶蛋白序列和花椒鑒定出的蛋白序列（共168個）進行多序列比對，生成ALN格式的文件（附表1）。該文件被導入MEGA v.11軟件［21］中，采用鄰接法（Neighbor-Joining）進行系統發育樹的構建，自展值設置重復次數2000次。隨后，采用ITOL［21］美化構建好的進化樹。

1.3 花椒BAHD基因的理化性質與蛋白3D結構分析

利用EXPASY［21］分析花椒BAHD基因的氨基酸數量（aa）、分子量（MW）、等電點（pI）和不穩定系數（II）。同時使用WOLF［21］ 預測花椒BAHD基因的亞細胞定位。通過SWISS-MODEL［21］構建花椒BAHD蛋白的三維結構模型。

1.4 花椒BAHD基因的保守基序及基因結構分析

為闡明花椒BAHD蛋白motif序列的進化，采用MEME［21］進行蛋白保守基序分析，最大值設置為10，基序長度范圍為6～50之間。利用GSDS網站［21］繪制基因結構圖。

1.5 花椒BAHD基因的表達量

利用TBtools軟件［22］中的Gene Location Visualize from GTF/GFF工具繪制花椒BAHD基因在染色體上的定位信息。使用本實驗室獲得的花椒轉錄組數據（附表2），分析花椒的不同發育時期、不同部位和不同品種中的表達模式。使用TBtools軟件中的HEATMAP工具可視化花椒 BAHD酰基轉移酶基因的表達水平。

2 結果與分析

2.1 花椒基因家族成員序列屬性分析

根據基因?；D移酶基因家族的保守結構域和隱馬爾可夫模型文件（HMM），使用（PFAM：PF02458）對已有全基因組測序結果進行搜索識別，最終得到BAHD酰基轉移酶基因共計50個（表1）?；ń稡AHD?；D移酶基因家族成員蛋白分子量在47～53 kDa之間，其編碼的氨基酸序列長度在420～470 aa之間，等電點在5.23～8.96之間，對其蛋白質親水性預測結果表明，只有其中兩個蛋白質具有疏水性，其余蛋白均為親水蛋白，不穩定系數在31.51～48.56之間，因此花椒中的BAHD?；D移酶家族編碼蛋白為不穩定親水蛋白。亞細胞定位預測表明，花椒BAHD?；D移酶家族成員中約有62%的蛋白定位于細胞質基質中，28%和8%的蛋白分別定位于葉綠體和細胞核中，僅有1個蛋白定位于細胞骨架中。

HXXXD和DFGWG為BAHD酰基轉移酶家族的特征保守結構域［23］?；ń稡AHD基因家族成員保留了HXXXD結構域，而DFGWG保守結構域具有變異性，只在28個成員中檢出，而其余22個成員中的DFGWG保守結構域分化為NFGWG、DLGWG、DFGEG和DFGSG。對于花椒中這22個存在相同DXGXG分化的成員，可能與水稻酚胺合成途徑中關于脂肪族苯酚酰胺的生物合成的BAHD?；D移酶有一定聯系［24］。

在BAHD?；D移酶基因家族中與花青素合成有關的植物中鑒定出了YFGNC結構域［25］，植物花青素合成途徑屬于類黃酮途徑的一條重要分支［26］。而花椒的BAHD基因家族部分成員中鑒定出了23個成員擁有YFGN結構域，與程俊等［27］鑒定出胡椒中的YFGN結構域相同，并且花椒中還存在YYGN、FYGN、FFGN變種。

2.2 花椒BAHD?；D移酶基因家族進化分析

為分析花椒BAHD?；D移酶基因家族各成員間的進化關系，本研究分別下載了大麥、擬南芥、紅豆杉、蒺藜苜蓿、大豆、瓜葉菊等34個物種的BAHD?；D移酶基因家族蛋白序列，同本研究鑒定的50個花椒BAHD?；D移酶基因家族蛋白進行序列比對，并構建系統發育樹。結果顯示，這些序列可以劃分為5大分支（圖1）。

Clade Ⅰ分支中的序列聚類為2個亞支，在Clade Ⅰa亞支中，所包含的序列大部分都與青花素代謝過程有著緊密的關聯，這些序列已經得到了廣泛的研究和驗證，如：NP_171849，BAA74428，ABY59019等［6， 28-29］，該分支中的擬南芥BAHD?；D移酶基因家族成員也均是屬于花色苷分支成員且擁有YFGN蛋白質結構域，說明該分支主要與植物花瓣中存在的花青素合成途徑有一定聯系。Clade Ⅰb主要由擬南芥BAHD家族基因組成，均為轉移蛋白酶家族成員，但該類中無功能已知成員，盡管在分支命名上存在差異，但本研究中該分支的聚合類型及其與家族成員種類的關系與Luo等［30］的研究結果相吻合。在很大程度上支持了本研究的分類方法是可靠和準確的。

Clade Ⅱ主要由AAM64817與CAA61258組成，二者雖然根據同源性被歸類為BAHD轉移酶，但其似乎并不具有BAHD家族成員的催化機制，反而參與植物蠟質的合成，如AAM64817在超長鏈脂肪酸（VLCFA）的合成中發揮作用，是C28脂肪酸延長的必要材料［28， 31-32］。但由于該分支成員與花椒BAHD家族基因距離較遠，因此推測在花椒的BAHD?；D移酶一般不參與植物蠟物質的合成。

Clade Ⅲa分支主要由乙酰轉移酶組成，功能各異，如AAN09796主要參與乙酸芐酯的生物合成，是植物花香的重要來源［33］。但由于花椒BAHD家族基因成員與其關系較遠，說明可能花椒并不具備類似功能，且該分支BAHD家族成員底物種類多樣化，而對于花椒BAHD家族成員的底物，則需要通過進一步試驗來確定。Clade Ⅲb是由來自茄科的碧冬茄的ABG75942蛋白單獨組成，其參與花中揮發性異丁香酚的生物合成，并促進苯乙醛、苯乙醇、乙酸苯乙酯、苯乙基苯甲酸酯和乙酸芐酯的形成，催化針葉醇的乙酰化以產生針葉樹乙酸酯［34］，但由于其親緣關系與花椒BAHD家族基因較遠，故推斷花椒的BAHD家族基因并不具備與該功能相似的功能。

Clade Ⅴ所含成員最多，且與花椒的BAHD家族成員關系最近，功能最為相似，故根據功能性的不同，將Clade Ⅴ分為兩個亞分支。在Clade Ⅴa種，因其具有許多亞分支，且每個分支功能各異，如根據擬南芥的NP_179932基因為亞精胺二芥子酰基轉移酶，介導種子中二萘酰亞精胺偶聯物的積累，并催化N1，N8-二戊酰基亞精胺生物合成所需的2個偶聯步驟［35-36］，得出該分支可能與亞精胺的生物合成有關；亦通過分析擬南芥的Q94CD1基因，我們了解到其結構域參與了木栓蛋白聚合物中芳烴的合成?；谶@一發現，我們推測花椒中的BAHD家族成員可能也參與木栓蛋白的合成過程［29， 37］。同時，碧冬茄的AAU06226基因的功能驗證表明，該基因編碼的酶主要催化苯甲?；鸵阴；D移到多種潛在的底物醇上，參與形成揮發性酯，如苯甲酸芐酯和苯乙基苯甲酸酯［38-40］。因此，我們推斷花椒中的這一分支的BAHD家族成員可能主要負責催化這些基團的轉移。這些反應的主要產物包括羥基肉桂酰基酯、苯甲酸芐酯以及其他相關的苯甲酸類物質的衍生物［41］。Clade Ⅴb中的花椒BAHD?；D移酶以羥基肉桂酰輔酶A奎寧酸轉移酶和羥基肉桂酰轉移酶有關聯，具有催化以奎寧酸為底物的?；磻墓δ?。產物多為羥基肉桂?；?、奎寧酸底物合成出的相關產物，故推測此分支中的花椒BAHD家族成員可能也具有相似功能。

2.3 花椒BAHD?；D移酶基因結構與保守基序分析

花椒BAHD?；D移酶基因家族分析結果如圖2所示，在Motif1中可見BAHD酰基轉移酶家族完全保守結構域HXXXD，這是BAHD?；D移酶家族基因重要鑒定條件之一，并且在蛋白序列中間的位置負責催化活性［42］，在圖2中可見DFGWG保守結構域，該基序是催化所必須的，也具有結構功能［42］。BAHD?；D移酶基因家族的DFGWG特征結構域不完全保守，花椒中存在的部分DFGWG變種與NFGWG、DLGWG、DFGEG和DFGSG變種，部分變種與楊樹中存在的變種一致［43］，因此在植物BAHD酰基轉移酶基因家族中存在一定相似進化方向的趨勢。

基于MEME在線工具鑒定出花椒BAHD?；D移酶基因家族有10個motif（圖2-b）。所有分支都包含motif 1、motif 6和motif 8；CladeⅤa、CladeⅤb的成員都包含motif 3、motif 5、motif 9；Clade Ⅴa分支存在缺少miotif 2、motif 7、motif 10的情況，缺少的小亞支中成員均出現該情況；而Ⅴb分支中10個motif均有分布，不存在缺少某一個motif的情況。

在真核生物的進化過程中，內含子的丟失和獲得扮演著至關重要的角色。對花椒BAHD基因的外顯子和內含子組成（圖2-c）進行分析，結果表明：不同分支間的內含子和外顯子構成存在一定差異性，其中大部分部分基因含有2個外顯子，有一個分支只含有1個外顯子，也有其他亞支擁有3個外顯子的現象，但都不具有明顯規律；在花椒BAHD?；D移酶基因家族成員中，大部分成員都擁有1個內含子，但亞分支上的成員有些出現了無內含子，也有出現擁有2個內含子的現象，規律性不強但與亞支的不同存在一定聯系；花椒BAHD基因家族成員中有成員出現不含有UTR區域的現象，但該現象具有分支上的規律性。

2.4 花椒BAHD酰基轉移酶基因的表達量分析

花椒BAHD?；D移酶基因家族成員在染色體上的位置信息如圖3所示，50個BAHD?；D移酶基因序列分布在20條染色體上，其中第33條染色體上分布了14個BAHD基因，第21條染色體上分布了11條BAHD基因。其余染色體上的BAHD基因的分布比較稀疏，每個染色體上分布1～3個基因。

基于花椒果實不同發育時期、不同組織和不同品種的轉錄組數據分析表明（圖4），在花椒果實不同發育過程中，不同BAHD酰基轉移酶基因在其不同發育階段中的表達存在幾種變化趨勢：

（1）在果實不同發育時期內表達量均高于其他基因的EVM0009549、EVM0050658、EVM0034821和EVM0025466 4個基因都在某一時期達到表達量最高的峰值后出現下降；也有EVM0024335基因在FP1時期就達到了表達量高峰，后面幾個時期表達量出現下降趨勢的；而EVM0044232基因在前幾個時期表達較少，最后FP7時期出現表達量高峰。總體上來說BAHD基因在花椒不同時期的果皮中表達存在一定規律。根據基因的不同，其表達量高峰分布于不同階段中，不同基因在同一時期的表達量也存在一定差異。

（2）花椒BAHD酰基轉移酶基因在果柄、刺、莖稈、葉片、花、幼嫩種子和成熟種子中均有表達，并且在莖稈、刺、果柄和花中表達的基因的數量要比葉片和種子中表達的基因的數量要多，在不同部位中表達量高的基因的數量最多的部位是莖稈，其次是葉片和果柄，花與種子表達量高的基因數量少于前三者。

（3）BAHD酰基轉移酶基因在種子中表達的基因的數量要少于其余部位，并且表達量高的基因的數量少于其他部位，但接近刺中的基因表達量高的基因數目。幼嫩種子中部分基因的表達量要略大于成熟種子，但也存在部分基因在成熟種子中表達量要大于幼嫩種子中的表達量的現象；幼嫩種子中表達的基因數量要少于成熟種子中表達的基因的數量，但是幼嫩種子中表達量高的基因的數量要大于成熟種子中的數量；存在兩個時期的種子中相同BAHD?；D移酶基因的表達量發生變化的現象。

（4）不同品種的花椒對花椒中不同的BAHD?；D移酶基因的表達存在影響，同種基因在不同種花椒中的表達量存在較為明顯的差異。如在不同部位、不同時期花椒中均擁有高表達量的EVM0009549基因，在貴州油椒‘FV4’和青花椒‘FV5’中出現了表達量不明顯的情況；在5種花椒中‘FV1’表達的基因的數量最多，表達量高的基因數量也最多；而‘FV5’表達的基因的數量最少，但表達量高的基因與其他種數量差距??；‘FV3’中表達量不明顯的基因數量最多。相同基因在不同種花椒中的表達存在差異，在表達量上也存在差異。

2.5 花椒BAHD酰基轉移酶3D結構預測

BAHD家族的蛋白是一類具有共同特征的球狀蛋白，它們大多數位于細胞質中，少數則定位于細胞核［20］。盡管這些蛋白質的一級結構各不相同，但它們普遍含有HXXXD和DFGWG這兩個關鍵的保守序列。HXXXD序列位于活性中心，而DFGWG序列則位于活性位點之外，這兩個序列對于蛋白質的催化功能和與供體及底物的結合至關重要。

通過對花椒中來自兩個Clade Ⅴ亞支的4個BAHD基因的氨基酸序列進行三級結構預測分析，我們發現了以下模式：EVM0025466的預測蛋白為羥基肉桂酰轉移酶，具有17個α螺旋和18個β鏈（圖5-a）；EVM0059967的預測蛋白為ω-羥基棕櫚酸酯和O-阿魏酰轉移酶，含有15個α螺旋和19個β鏈（圖5-b）；EVM0034324的預測蛋白為亞精胺羥基肉桂酰轉移酶，同樣具有15個α螺旋和19個β鏈（圖5-c）；而EVM0050180的預測蛋白為羥基肉桂酰輔酶A莽草酸酯/奎寧酸酯羥基肉桂酰轉移酶，具有17個α螺旋和18個β鏈（圖5-d）。這些結構特征為理解這些BAHD家族成員的功能提供了重要線索。

綜上所述，Clade Ⅴa的兩個蛋白（EVM0025466、EVM0059967）的區別主要是α和β螺旋數目不同，在整體結構上不存在太大的差異；Clade Ⅴb的2個蛋白（EVM0034324、EVM0050180）的主要差異也是α和β螺旋數目不同。這4個蛋白的3D結構預測結果在整體上是相似的，可能是由于這四個蛋白同處于一個Clade Ⅴ分支。

3 討論與結論

本研究采用多種植物的BAHD酰基轉移酶基因為參考，通過生物信息學分析了花椒基因組中的BAHD?；D移酶基因的結構特征，有助于對植物BAHD基因家族的注釋，并在一定程度上揭示了花椒BAHD基因家族的成員以及基因結構特征，也作為進一步研究花椒BAHD家族提供一定依據和借鑒。

BAHD?；D移酶在植物體內扮演著多重角色，不僅參與植物生長發育的調控，還在脅迫反應以及次生代謝產物的合成和修飾過程中發揮著至關重要的作用［17］。本研究在花椒基因組中共鑒定了50個BAHD?；D移酶基因家族成員。

3.1 花椒BAHD酰基轉移酶基因家族成員的系統發育關系

對花椒與其他物種的BAHD酰基轉移酶基因家族成員進行系統發育樹構建，得到花椒的BAHD成員主要分步于1個大分支Clade Ⅴ，這一分支又可分為兩個亞支Clade Ⅴa與Clade Ⅴb。Clade Ⅴa分支中的花椒蛋白可能參與以笨甲酰輔酶和乙酰輔酶A作為酰基供體參與亞精胺或木栓蛋白聚合物的芳烴的合成［29， 37］，其產物多為羥基肉桂?；?、苯甲酸芐酯以及其他苯甲酸類物質的衍生物［41］。Clade Ⅴb中的花椒分支與羥基肉桂酰輔酶A奎寧酸轉移酶和羥基肉桂酰轉移酶有關聯，具有催化以奎寧酸為底物的?；磻墓δ埽?7］。Clade Ⅴa分支中存在缺少motif 2、motif 7、motif 10的現象出現，并且缺少motif的情況的基因所處小分支中均出現該情況，因此Ⅴa中的小亞支可能存在由于植物學上的功能的差異從而導致的motif丟失現象，具體情況還需進一步探索。在花椒BAHD基因家族成員的外顯子和內含子組成中，Clade Ⅴa、Clade Ⅴb兩個分支中都出現了在組成上存在差異的現象。不同亞分支間的內含子和外顯子的組成上存在差異，其中大部分基因含有2個外顯子，而有一個分支，其組成上只有1個外顯子；其余成員大部分都擁有1個內含子，但在CladeⅤa、CladeⅤb中也都存在部分亞分支無內含子、擁有2個內含子的現象；并且存在亞分支基因結構中不含有UTR區域的現象，而根據花椒BAHD家族成員的基因結構差異存7BrYARMunGUBUB3YXaf5lA==在分支規律性，可以根據此來為一步探索不同小分支之間的功能性差異提供一種思路。

花椒的BAHD?；D移酶基因家族中的HXXXD結構域高度保守，而DFGWG結構域在花椒中并不完全保守，22個成員存在DXGXG的分化與其他物種的植物擁有相同變異方向［43］可能還會擁有相似的進化趨向。在花椒的BAHD基因家族部分成員中鑒定出了YFGN結構域，還存在YYGN、FYGN、FFGN變種，這些擁有YFGN結構域的花椒BAHD家族成員可能與花青素合成途徑存在一定聯系，且鑒定出YFGN結構域的花椒基因可為鑒定花椒BAHD家族基因提供一種思路。

3.2 花椒BAHD?；D移酶基因家族成員的理化性質與蛋白結構

Suzuki等［44］的研究表明BAHD家族的分子量在48～55 kDa之間，氨基酸平均數為445個，且主要定位于細胞質中，少數定位于細胞核中。本研究的花椒的BAHD基因家族成員蛋白分子量在47～53 kDa之間，氨基酸長度在420～470 aa之間，理論等電點在5.23～8.96之間，與其研究結果基本一致。對其蛋白質親水性預測結果表明，只有兩個蛋白具有疏水性，其余蛋白均為親水蛋白，并且蛋白的不穩定系數在31.51～48.56間，所以花椒的BAHD家族成員的蛋白為不穩定親水蛋白。

BAHD家族成員的第一個表征晶體結構是在植物蛇根木（Rauvolfia serpentina）中發現的酶，屬于BAHD（芐醇乙酰基轉移酶、花青素-O-羥基肉桂?；D移酶、鄰氨基苯甲酸-N-羥基肉桂酰基/苯甲酰基轉移酶、去乙?；L春新堿乙?；D移酶）酶超家族的一員（Rauvolfia serpentina vinorine，RsVS）（PDB ID：2BGH），由14個β鏈和13個α螺旋組成［46］，BAHD家族中N-?；D移酶的第一個表征晶體結構是大麥芽氨酸香豆酰轉移酶（Hordeum vulgare agmatine coumaroyltransferase，HvACT）（PDB ID：7CYS）該結構包含18個β鏈和13個α螺旋［45］。目前發表的BAHD成員的晶體結構為26種?；ń分械腂AHD成員的蛋白3D結構便是使用這些已發表晶體結構進行預測構建。選取4個花椒的BAHD酰基轉移酶基因的氨基酸進行三級結構預測，Clade Ⅴa的2個蛋白主要是α和β螺旋數目不同，在整體形狀上不存在特別大的差異，Clade Ⅴb的2個蛋白之間的差異也主要是α和β螺旋數目不同，這4個蛋白在3D結構上沒有明顯的差異可能是由于同處于一個大亞族Clade Ⅴ。

3.3 花椒BAHD?；D移酶基因的表達特征

花椒BAHD家族基因在花椒果皮中展現出表達差異，在表達達到高峰后，其表達水平通常呈現下降趨勢。此外，這些成員在不同植物部位的表達情況亦有所區別，具體表現為莖稈、刺、果柄和花的表達量普遍高于葉片和種子。值得注意的是，如果一個基因在某一特定部位的表達量較高，那么在其他部位的表達量則相對較低。這些現象共同揭示了花椒BAHD家族基因的表達情況受到花椒不同部位的顯著影響。

花椒BAHD基因種子發育的不同階段呈現出差異化的表達模式。相較于成熟種子，幼嫩種子中BAHD家族成員的基因表達量較低，這揭示了花椒BAHD基因的表達在種子發育過程中存在動態變化。并且部分基因在幼嫩種子中處于未表達狀態，可能與種子發育過程中的不同生物學功能及代謝需求相關。

不同品種的花椒對BAHD?；D移酶基因的表達具有顯著影響，導致同種基因在不同品種的花椒中表現出明顯的表達量差異。在研究的5個品種中，‘FV1’品種的花椒顯示出了BAHD酰基轉移酶基因表達數量的優勢，其表達量相對較高。相反，‘FV5’品種的花椒則表現出較低的基因表達數量。值得注意的是，‘FV3’品種雖然表達基因數量正常，但由于其表達量不高，因此基因表達情況并不明顯。這些結果表明，花椒的品種差異是導致BAHD?；D移酶基因表達差異的重要因素之一，對于理解和利用花椒的遺傳特性具有重要意義。

花椒BAHD基因的表達受到多種因素的影響，包括組織部位、種子發育階段以及花椒品種等。這些差異可能與花椒的生長發育、次生代謝產物的合成以及環境適應性等生物學過程密切相關。并且我們發現不同品種的花椒對BAHD?；D移酶基因的表達有顯著影響，花椒的遺傳資源可能在很大程度上決定了其生理特性和代謝產物的積累，從而導致不同BAHD基因的表達情況存在明顯差異。

3.4 結論

本研究從花椒基因組中篩選鑒定了50個BAHD家族成員，分析發現所有成員均具有HXXXD結構；并且擁有DFGWG結構的成員中有些出現變種；部分成員還具有YFGN結構。這50個成員在發育進化樹中根據已鑒定功能蛋白的聚類結果分為兩個分支，每個分支下的小分支間在基因結構上存在一定差異。花椒BAHD家族基因在表達情況上存在差異：（1）BAHD基因在果皮不同時期存在特異高表達；（2）BAHD基因在不同部位表達存在差異，表達量最高的部位是莖稈、刺和花；（3）成熟種子的表達量大于幼嫩種子；（4）花椒BAHD基因在不同品種花椒中表達情況也有明顯差異。

（責任編輯：嚴秀芳）

參 考 文 獻：

[1]

Zhang L L，Zhao L，Wang H Y，et al.The relationship between alkylamide compound content and pungency intensity of Zanthoxylum bungeanum based on sensory evaluation and ultra-performance liquid chromatography-mass spectrometry/ mass spectrometry （UPLC-MS/MS） analysis［J］.Journal of the Science of Food and Agriculture，2019，99（4）：1475-1483.

［2］高夏潔，鐘葵，趙鐳，等.不同產區花椒油的椒麻感官特性及物質組成［J］.食品科學，2022，43（8）：281-287.

［3］Sugai E，Morimitsu Y，Kubota K.Quantitative analysis of sanshool compounds in Japanese pepper （Xanthoxylum piperitum DC.） and their pungent characteristics［J］.Bioscience，Biotechnology，and Biochemistry，2014，69（10）：1958-1962.

［4］Menozzi C，Riera C E，Munari C，et al.Synthesis and evaluation of new alkylamides derived from α-hydroxysanshool，the pungent molecule in Szechuan pepper［J］.Journal of Agricultural and Food Chemistry，2009，57（5）：1982-1989.

［5］Wang L L，Chen K，Zhang M，et al.Catalytic function，mechanism，and application of plant acyltransferases［J］.Critical Reviews in Biotechnology，2022，42（1）：125-144.

［6］Auria J C.Acyltransferases in plants：a good time to be BAHD［J］.Current Opinion in Plant Biology，2006，9（3）：331-340.

［7］Grienenberger E，Besseau S，Geoffroy P，et al.A BAHD acyltransferase is expressed in the tapetum of Arabidopsis anthers and is involved in the synthesis of hydroxycinnamoyl spermidines［J］.The Plant Journal，2009，58（2）：246-259.

［8］Zhang Z，Xu L.Arabidopsis BRASSINOSTEROID INACTIVATOR2 is a typical BAHD acyltransferase involved in brassinosteroid homeostasis[J].Journal of Experiment Botany，2018，69（8）：1925-1941.

［9］Liu C X，Qiao X，Li Q H，et al.Genome-wide comparative analysis of the BAHD superfamily in seven rosaceae species and expression analysis in pear （Pyrus bretschneideri）［J］.BMC Plant Biology，2020，20（1）：14.

［10］Yamane M，Takenoya M，Yajima S，et al.Crystal structure of barley agmatine coumaroyltransferase，an N-acyltransferase from the BAHD superfamily［J］.Acta Crystallographica Section F Structural Biology Communications，2020，76（12）：590-596.

［11］Yan X G，Qin X Y，Li W G，et al.Functional characterization and catalytic activity improvement of BAHD acyltransferase from Celastrus angulatus Maxim［J］.Planta，2020，252（1）：6.

［12］Wang T，Li L Y，Zhuang W B，et al.Recent research progress in taxol biosynthetic pathway and acylation reactions mediated by Taxus acyltransferases［J］.Molecules，2021，26（10）：2855.

［13］Zhao Y J，Yu X H，Lam P Y，et al.Monolignol acyltransferase for lignin p-hydroxybenzoylation in Populus［J］.Nature Plants，2021，7（9）：1288-1300.

［14］Aktar S，Bai P，Wang L，et al.Identification of a BAHD acyltransferase gene involved in plant growth and secondary metabolism in tea plants［J］.Plants Basel，2022，11（19）：2483.

［15］Wang Y，Zhang H，Wan C，et al.Characterization of two BAHD acetyltransferases highly expressed in the flowers of Jasminum sambac （L.）.Aiton[J].Plants （Basel），2021，11（1）：13.

［16］Yuan Z，Yang H，Pan L，et al.Systematic identification and expression profiles of the BAHD superfamily acyltransferases in barley （Hordeum vulgare）［J］.Scientific Reports，2022，12（1）：5063.

［17］Xu D H，Wang Z，Zhuang W B，et al.Family characteristics，phylogenetic reconstruction，and potential applications of the plant BAHD acyltransferase family［J］.Frontiers in Plant Science，2023，14：1218914.

EyaF+MqKFL9xRmGWMV8f4w==［18］Feng S J，Liu Z S，Cheng J，et al.Zanthoxylum-specific whole genome duplication and recent activity of transposable elements in the highly repetitive paleotetraploid Z.bungeanum genome［J］.Horticulture Research，2021，8（1）：205.

［19］Larkin M A，Blackshields G，Brown N P，et al.clustal W and clustal X version 2.0［J］.Bioinformatics，2007，23（21）：2947-2948.

［20］Tuominen L K，Johnson V E，Tsai C J.Differential phylogenetic expansions in BAHD acyltransferases across five angiosperm taxa and evidence of divergent expression among Populus paralogues［J］.BMC Genomics，2011，12（1）：236.

［21］Tamura K，Stecher G，Kumar S.MEGA11：molecular evolutionary genetics analysis version 11［J］.Molecular Biology and Evolution，2021，38（7）：3022-3027.

［22］Chen C，Chen H，Zhang Y，et al.TBtools：an integrative Toolkit developed for interactive analyses of big biological data［J］.Molecular Plant，2020，13（8）：1194-1202.

［23］Unno H，Ichimaida F，Suzuki H，et al.Structural and mutational studies of anthocyanin malonyltransferases establish the features of BAHD enzyme catalysis［J］.Journal of Biological Chemistry，2007，282（21）：15812-15822.

［24］Peng M，Gao Y Q，Chen W，et al.Evolutionarily distinct BAHD N-acyltransferases are responsible for natural variation of aromatic amine conjugates in rice［J］.Plant Cell，2016，28（7）：1533-1550.

［25］Nakayama T，Suzuki H，Nishino T.Anthocyanin acyltransferases：specificities，mechanism，phylogenetics，and applications［J］.Journal of Molecular Catalysis B：Enzymatic，2003，23（2）：117-132.

［26］趙海菲，王天婭，余坤江，等.MYB轉錄因子調控植物花青素生物合成的研究進展［J］.山地農業生物學報，2022，41（3）：49-56.

［27］程俊，后思宇，李靖，等.胡椒堿合成相關BAHD?；D移酶基因的克隆與分析［J］.分子植物育種，2023，21（2）：437-453.

［28］Lai C，Kunst L，Jetter R.Composition of alkyl esters in the cuticular wax on inflorescence stems of Arabidopsis thaliana cer mutants［J］.The Plant Journal，2007，50（2）：189-196.

［29］Waki T，Yoo D，Fujino N，et al.Identification of protein-protein interactions of isoflavonoid biosynthetic enzymes with 2-hydroxyisoflavanone synthase in soybean（Glycine max（L.）Merr.）［J］.Biochemical and Biophysical Research Communications，2016，469（3）：546-551.

［30］Luo J，Nishiyama Y，Fuell C，et al.Convergent evolution in the BAHD family of acyl transferases：identification and characterization of anthocyanin acyl transferases from Arabidopsis thaliana［J］.The Plant Journal，2007，50（4）：678-695.

［31］Haslam T M，Maas-Fernández A，Zhao L，et al.Arabidopsis ECERIFERUM2 is a component of the fatty acid elongation machinery required for fatty acid extension to exceptional lengths［J］.Plant Physiology，2012，160（3）：1164-1174.

［32］Pascal S，Bernard A，Sorel M，et al.The Arabidopsis cer26 mutant，like the cer2 mutant，is specifically affected in the very long chain fatty acid elongation process［J］.The Plant Journal，2013，73（5）：733-746.

［33］D'Auria J C，Chen F，Pichersky E.Characterization of an acyltransferase capable of synthesizing benzylbenzoate and other volatile esters in flowers and damaged leaves of Clarkia breweri［J］.Plant Physiology，2002，130（1）：466-476.

［34］Dexter R，Qualley A，Kish C M，et al.Characterization of a petunia acetyltransferase involved in the biosynthesis of the floral volatile isoeugenol［J］.The Plant Journal，2007，49（2）：265-275.

［35］Luo J，Fuell C，Parr A，et al.A novel polyamine acyltransferase responsible for the accumulation of spermidine conjugates in Arabidopsis seed［J］.Plant Cell，2009，21（1）：318-333.

［36］Wang C Y，Li J X，Ma M L，et al.Structural and biochemical insights into two BAHD acyltransferases （AtSHT and AtSDT） involved in phenolamide biosynthesis［J］.Frontiers in Plant Science，2021，11：610118.

［37］Gou J Y，Yu X H，Liu C J.A hydroxycinnamoyl transferase responsible for synthesizing suberin aromatics in Arabidopsis［J］.Proceedings of the National Academy of Sciences，2009，106（44）：18855-18860.

［38］Boatright J，Negre F，Chen X，et al.Understanding in vivo benzenoid metabolism in petunia petal tissue［J］.Plant Physiology，2004，135（4）：1993-2011.

［39］Orlova I，Marshall-Coloón A，Schnepp J，et al.Reduction of benzenoid synthesis in petunia flowers reveals multiple pathways to benzoic acid and enhancement in auxin transport［J］.The Plant Cell，2006，18（12）：3458-3475.

［40］Colón A M，Sengupta N，Rhodes D，et al.A kinetic model describes metabolic response to perturbations and distribution of flux control in the benzenoid network of Petunia hybrida［J］.The Plant Journal，2010，62（1）：64-76.

［41］孫燕銘，李億紅，程曦，等.梨BAHD家族成員的鑒定、序列特征及表達分析［J］.核農學報，2018，32（10）：1917-1930.

［42］Molina I，Kosma D.Role of HXXXD-motif/BAHD acyltransferases in the biosynthesis of extracellular lipids［J］.Plant Cell Reports，2015，34（4）：587-601.

［43］Yu X H，Gou J Y，Liu C J.BAHD superfamily of acyl-CoA dependent acyltransferases in Populus and Arabidopsis：bioinformatics and gene expression［J］.Plant Molecular Biology，2009，70（4）：421-442.

［44］Suzuki H，Sawada S，Watanabe K，et al.Identification and characterization of a novel anthocyanin malonyltransferase from scarlet sage （Salvia splendens） flowers：an enzyme that is phylogenetically separated from other anthocyanin acyltransferases［J］.The Plant Journal，2004，38（6）：994-1003.

［45］Yamane M，Takenoya M，Yajima S，et al.Crystal structure of barley agmatine coumaroyltransferase，an N-acyltransferase from the BAHD superfamily［J］.Acta Crystallographica.Section F，Structural Biology Communications，2020，76（12）：590-596.

Identification and Differential Expression Analysis of BAHD Acyltransferase Gene Family in Zanthoxylum bungeanum Maxim.

Xiong Wenwei， Cai lian， Su Jing， Yang Yintiao， Feng Shijing*

（College of Forestry， Guizhou University， Guiyang 550025， Guizhou， China）

Abstract：

Alkyamides are one of the important characteristic components for evaluating the quality of Zanthoxylum bungeanum Maxim. In order to explore candidate genes for the acylation reaction related to the synthesis of alkyamides in Z. bungeanum， the BAHD acyltransferase gene family of Z. bungeanum was studied by bioinformatics method based on the whole genome data of Z. bungeanum. The results showed that a total of 50 members of the Z. bungeanum BAHD acyltransferase gene family were identified. These genes can be divided into two subfamilies， all of which encode unstable hydrophilic proteins. Subcellular localization analysis showed that most of the Z.bungeanum BAHD members were mainly located in the cytoplasm， and other members were located in the nucleus， chloroplasts and other organelles. Gene expression analysis showed that the genes of BAHD family members were highly expressed in all stages of pericarp development of Z. bungeanum， and the expression in pedicels， spines， stems and flowers was higher than that in seeds and leaves. Among different pepper varieties， even the same gene also showed expression differences， and even no expression was detected in some varieties. This paper provides a new gene resource for the synthesis pathway of numb-taste compounds in Z. bungeanum， and will provide a reference for the study of BAHD acyltransferase gene family in other higher plants.

Keywords：

Zanthoxylum bungeanum Maxim.; alkylamides; BAHD acyltransferase gene family; gene expression