9味中藥及中藥聯用對奶牛乳房炎病原菌金黃色葡萄球菌的體外抑菌效果

摘要：金黃色葡萄球菌是一種主要的食源性病原體，該菌也是造成反芻動物乳房炎的主要致病菌。而奶牛乳房炎極大地影響著奶牛的健康以及乳制品質量，從而影響到畜牧業的發展。因此選擇合適的方式治療和預防奶牛乳房炎是至關重要的。本研究共納入了9味中藥，旨在選擇出最高效的抑制致病菌的中藥及中藥復方來改善奶牛乳房炎多發以及難以治療的現狀。試驗結果顯示金銀花、訶子、蒲公英、甘草及其中藥復方在體外抑菌試驗中對金黃色葡萄球菌的抑制效果較為理想。本研究為中藥療奶牛乳房炎方面提供了新的證據。中藥及中藥復方有望為治療奶牛乳房炎提供新的有意義的研究方向。

關鍵詞：中藥；體外抑菌試驗；奶牛乳房炎；金黃色葡萄球菌

我國為奶牛養殖大國，然而奶牛乳房炎一直困擾著養殖場。奶牛乳房炎是奶牛養殖過程中一種常見且多發的奶牛疾病，其發病率高并且不僅影響奶牛的產奶量還會導致奶制品質量下降，此外后續還會持續影響奶牛產奶后的發情周期，可能會導致奶牛的乳房出現永久性的損傷，造成損失[1]。奶牛乳房炎因其常見性和多發性嚴重影響我國奶牛養殖業的大力發展。

細菌感染是造成奶牛乳房炎的主要原因。根據先前的報道可知引起奶牛乳房炎的最主要的病原微生物是金黃色葡萄球菌。金黃色葡萄球菌能產生毒素和酶類物質，導致乳腺組織炎癥反應，因此其會引起奶牛乳房慢性感染并且金黃色葡萄球菌產生的毒素會對奶牛乳房造成不可逆的損傷，嚴重影響產奶量和乳品質[2]。因此，研究金黃色葡萄球菌在奶牛乳房炎中的發病作用并探索對其有效的抗菌藥物對于改善奶牛乳房炎的多發病現狀是十分重要的。

中藥作為中國傳統醫藥理論指導采集、炮制的藥物在各方面都發揮著重要作用[3]。 中藥具有來源廣泛、不易產生耐藥性、毒副作用小、無殘留的特點，并且還可以作為潛在的抗菌藥物被廣泛應用于畜禽的疾病防控和治療中[4]。本研究探究了9味常見的中草藥以及其復方，采用體外試驗的方法探究中藥及其復方是否對藥物病原菌金黃色葡萄球菌產生體外抑制反應。本研究旨在篩選更高效的抑菌中藥來防止奶牛乳房炎，并對奶牛乳房炎的預防和治療提供新思路。

1 材料和方法

1.1 材料

1）試驗菌株。本研究試驗樣品來自青島市某養殖場患有乳房炎奶牛的奶樣，采樣后分離出金黃色葡萄球菌。

2）主要培養基與中藥樣品。本研究選擇金銀花、訶子、蒲公英、甘草、沙參、山藥、黃連、艾葉、白芷等9味常見中藥。上述中藥均購自青島晟和醫藥中藥店（杏林堂店）；本實驗用培養基購自賽默飛世爾科技中國有限公司。

3）試驗儀器。DNP-9162-1A電熱恒溫培養箱（常州潤華電器有限公司）；電子天平 XPR226DR/AC（梅特勒托利多科技（中國））；實驗室冰箱283（廣州傲雪制冷設備有限公司）。

1.2 試驗方法

1）制備中藥液。取試驗所需的9味中藥每種80 g，分別加入1 000 mL超純水浸泡1 h使其有效成分析出，隨后加熱煮沸再小火慢煮至80 mL，過濾取中藥清液，將濾渣再加超純水至800 mL，重復煎煮至80 mL，取中藥清液。將兩份清液樣品混合后離心，取上清液繼續煎煮至80 mL，再進行高溫滅菌處理。將中藥樣品液放置恒溫4 ℃的醫用冰箱冷藏備用。

2）金黃色葡萄球菌懸液制備。將冷凍保存的標準菌株在營養瓊脂上劃線復活并使其處于37 ℃環境溫度下培養24 h。培養完成后將金黃色葡萄球菌菌落接種到7.5%氯化鈉肉湯中。將菌液接種到Baird-Parker培養基上，37 ℃至長出金黃色葡萄球菌菌落呈圓形，表面光滑，濕潤，菌落直徑為2～3 mm，細菌排列呈葡萄球狀顏色呈深灰黑色，有淺色邊緣。將菌液稀釋至3.0×108 CFU/mL，留存備用。

3）抑菌試驗。使用牛津杯法進行抑菌試驗，通過在牛津杯周圍抑菌濃度范圍內的細菌生長被抑制，形成透明的抑菌圈[5]。抑菌圈的判定為：抑菌圈直徑大于20 mm為極度敏感（++++）；抑菌圈直徑在20～15 mm之間為高度敏感（+++）；抑菌圈直徑在15～10 mm之間為高度敏感（++）；抑菌圈直徑小于10 mm為低度敏感（+）；無抑菌圈為不敏感（-）[6]。

4）測定最小抑菌濃度（MIC）及最小殺菌濃度（MBC）。在抑菌圈的邊緣處，瓊脂培養基中所含抑菌物質的濃度即為該菌懸液對該種指示菌的MIC。 MBC是指能夠殺滅培養基內99.9%以上測試細菌菌量的最低濃度。本研究采用試管稀釋法測定所測樣品組的MIC及MBC。本研究所有測量性試驗均重復三次。

5）測定雙聯中藥復方抑菌濃度（FIC）。根據尹光美等[7]的研究方法，本研究使用棋盤稀釋法進行聯合抑菌定量法，計算部分抑菌濃度（FIC）指數：FIC指數=MIC甲藥聯用/MIC甲藥單用+MIC乙藥聯用/MIC乙藥單用。

判別標準為：協調作用（FIC<0.5）；相加作用（0.5<FIC<1）；無關作用（1<FIC<2），拮抗作用（FIC>2）。

2 結果分析

2.1 9味中藥對金黃色葡萄球菌的體外抑菌程度

試驗數據結果如表1所示，可知9味中藥對金黃色葡萄球菌產生了不同的抑菌效果。其中7味對金黃色葡萄球菌有抑菌效果，而沙參和山藥對金黃色葡萄球菌不產生抑菌效果。在7味有效抑菌的中藥中，金銀花、訶子的抑菌等級為極度敏感，蒲公英、甘草的抑菌等級為高度敏感，黃連次之抑菌等級為中度敏感，而艾葉白芷抑菌等級為低度敏感。

2.2 MIC和MBC的測定

試驗數據結果如表2所示，訶子和金銀花在抑金黃色葡萄球菌方面表現最佳，其中金銀花和訶子的MIC為7.813 mg/mL，MBC為15.625 mg/ mL，蒲公英和甘草的MIC為15.625 mg/mL，MBC為31.250 mg/ mL；黃連、艾葉以及白芷在抑金黃色葡萄球菌方面表現不佳，其中黃連的MIC為125.000 mg/mL，MBC為250.000 mg/ mL；艾葉和白芷的MIC為250.000 mg/mL，MBC為500.000 mg/ mL。因此，根據以上試驗結果對于抗金黃色葡萄球菌效果來說，訶子和金銀花效果更好。

2.3 中藥復方FIC指數測定

試驗數據結果如表3所示，結果顯示不同種類的雙聯中藥復方的MIC和FIC不同。其中蒲公英+金銀花、蒲公英+訶子、訶子+金銀花的相關作用均為相加。而金銀花+甘草、蒲公英+甘草、訶子+甘草的相關作用為無關。不過與單一中藥相比雙聯中藥復方的MIC值均有下降。且抑菌圈直徑與藥物對測試菌的最低抑菌濃度呈負相關，即MIC愈小，抑菌圈愈大，抑菌效果越好。因此，選擇合適的中藥進行聯合復方使用對金黃色葡萄球菌的抑菌效果更好。

3 討論

金黃色葡萄球菌是一種強大的細菌，可導致人類和動物的嚴重疾病甚至死亡。此外，它是牛、奶牛、羊和山羊乳房炎的主要原因之一，其可以對奶牛的乳房組織造成不可逆的損傷，并且導致牛奶產量和質量大幅下降，給乳制品行業造成相當大的經濟損失[8]。金黃色葡萄球菌外毒素在包括乳腺炎在內的感染中發揮作用，治療主要依靠抗生素如青霉素，氨芐西林鈉和苯唑西林鈉。根據沈冬梅等[9]的試驗結果表明，氨基糖苷類、氯霉素類藥物對于金黃色葡萄球菌具有較好的抑菌作用，青霉素類、大環內酯類藥物在治療奶牛乳房炎方面應用得較多，我國優先選擇抗生素類藥物治療奶牛乳房炎，但是長期使用抗菌藥會使致病菌產生耐藥性難以提高治療效果，此外乳汁中的抗生素殘留也難以攻克。這極大地影響了奶牛的乳汁質量并造成經濟損失。

中藥來源于植物、動物和礦物中提取的天然產物和提取物，具有維持健康和治療疾病的有效生物功能。幾十年來，它在全球范圍內廣泛使用[10]。早在東漢時期，中醫典籍《神農本草經》就記載了中醫在治病方面的應用。中藥藥理學研究表明，中藥以及其提取物可以有效改變細胞中細胞膜的通透性從而改變細菌細胞壁的生理性質，從而可以通過改變蛋白質合成以及DNA復制轉錄過程來發揮藥理作用[11]。

本試驗共納入金銀花、訶子、蒲公英、甘草、黃連、艾葉、連翹、沙參、山藥共9味中藥，其中金銀花、訶子、蒲公英、甘草、黃連、艾葉、連翹，均表現出了對金黃色葡萄球菌的抑菌效果，并且金銀花、訶子、蒲公英、甘草抑菌效果突出，表現出了極度敏感的抑菌效果，MIC 結果為7.813～15.625 mg/mL，MBC 結果為15.625～31.25 mg/mL。查閱文獻可知金銀花、訶子、蒲公英、甘草均為抗菌抗炎效果極好的中草藥。其中金銀花具有廣譜的抗病毒、抗菌效果，能抑制多種病原微生物的生長。金銀花的有效抗菌成分為綠原酸和異綠原酸為主，其可以改變致病菌細胞的細胞膜和細胞壁生理特性從而抑制細菌的代謝酶活性[12]。訶子含有的訶子鞣質可以對生物膜產生影響[13]。蒲公英抑菌作用與黃酮類、酚酸類、多糖有關，其抑菌機制為可以破壞細胞膜的完整性，從而致使金屬離子、蛋白質和糖類物質滲出，導致細菌細胞代謝紊亂，最終導致細胞死亡，起到抑菌作用[14]。類似的甘草中也含有黃酮類化合物以及多糖，從而也可以通過影響細胞膜以及細胞壁的生物活性發揮抑菌的效果[15]。

因此，中藥抗菌研究有很大發展空間以及前景。但也有些問題需要注意，首先中藥作為中華文明五千年的結晶，其種類繁多，成分復雜，還有很多成分尚未探索透徹，因此在進行中藥聯合治療時要特別注意不同的中藥復方是否會產生毒性成分從而造成損失；其次，人們對中藥及其中藥復方生理層面以及分子層面的了解知之甚少，因此在后續的研究中可以更多地對中藥分子層面發揮作用影響進行討論；再次，不同的中藥其有效成分不同，因此其有效成分的提取方式、提取溫度、保存條件也不同，要注意不同中藥的有效成分的提取工藝；最后，為了更高效地對中藥進行研究，建議在選擇中藥時先查閱相關資料參考中藥的藥用價值，以做到優選更合適的中藥作為試驗對象。

4 結論

本研究試驗結果顯示中藥可以有效地對造成奶牛乳房炎的致病菌金黃色葡萄球菌產生體外抑制作用。此外，通過試驗結果可知適宜的中藥組方聯用的MIC數值更小，說明相比于單一的中藥有更好的抑菌效果。

中藥治療奶牛乳房炎可以很好地改善致病菌耐藥性以及乳汁中抗生素殘留問題，并且一些中藥可以作為飼料添加使用來預防疾病，因此更多地篩選出高效的中藥來治療奶牛乳房炎對我國的畜牧業蓬勃發展是有重大意義的。希望后續的研究中可以盡快地篩選出更多而有效的中藥及中藥聯用來改善奶牛乳房炎高發、難治療的現狀。■

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