田陽區仔豬副豬嗜血桿菌的分離鑒定及耐藥性檢測

摘要：為了了解百色市不同地區規模化養殖場及散養戶中不同日齡斷奶仔豬源副豬嗜血桿菌流行情況和對臨床中常用抗生素的耐藥性情況，為臨床中仔豬源副豬嗜血桿菌防控及合理用藥提供參考依據。本研究于2022-2023年采集田陽區養殖場及散養戶中患呼吸道疾病的斷奶仔豬鼻咽拭子及死亡仔豬胸腔積液和肺臟樣品組織287份，對采集的287份病料樣品采用細菌分離鑒定進行副豬嗜血桿菌鑒定，分別采用人工攻毒小鼠試驗和K-B藥敏紙片法檢測其分離菌株的致病性和對常用抗生素的耐藥性。結果顯示：從田陽區不同鄉鎮規模化養殖場及散養戶中采集的217份病料樣品中分離到92株副豬嗜血桿菌（42.4%），分離的62株副豬嗜血桿菌對小鼠具有致病性（死亡率在40%～100%之間），且對青霉素、阿莫西林、氨芐西林等10種抗生素的耐藥率為51.6%以上，本研究為田陽區不同鄉鎮規模化養殖場及散養戶中仔豬副豬嗜血桿菌病的綜合防控提供參考。

關鍵詞：仔豬；副豬嗜血桿菌；分離鑒定；致病性；耐性

在豬的養殖過程，仔豬的呼吸道疾病是臨床中常見的疾病之一，其中細菌性因素是引起仔豬呼吸道疾病的主要因素之一，其中副豬嗜血桿菌最為常見[1-3]。仔豬副豬嗜血桿菌病主要有不同血清型的副豬嗜血桿菌（haemophilus parasuis，Hps）引起仔豬的呼吸道傳染病，該菌可以感染不同階段的仔豬，其中以4～8周玲的仔豬最易感，其死亡率高達80%以上，給養豬業造成嚴重的經濟損失[3-5]。仔豬副豬嗜血桿菌主要表現為呼吸困難、纖維素性胸膜炎及關節炎等為主的一系列的臨床癥狀，在臨床中仔豬副豬嗜血桿菌與相關病毒性疾病（圓環病毒、藍耳病毒及豬瘟）混合感染，不僅給臨床中相關疾病的診斷帶來一定困難，還可以導致其豬的死亡，具有高的感染率和死亡率[6-7]。國內外相關研究表明，仔豬副豬嗜血桿菌病具有多種血清型，且有地域流行性，給仔豬副豬嗜血桿菌病疫苗制備帶來一定的困難[8]。本研究對采集田陽區不同養豬場中疑患呼吸道疾病（似患副豬嗜血桿菌病）的病料組織樣品進行副豬嗜血桿菌分離鑒定，并研究其分離菌株的致病性和對臨床中常用藥物的耐藥性，為進一步指導田陽區不同鄉鎮規模化養殖場及散養戶中合理使用抗生素治療仔豬副豬嗜血桿菌病奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 病料來源

2022—2023年采集田陽區養殖場及散養戶中患呼吸道疾病（類似副豬嗜血桿菌病臨床癥狀的）仔豬的鼻咽拭子樣品、肝臟樣品、胸腔積液樣品和肺臟樣品共計287份。

1.2 細菌分離與培養

將采集的各種病料組織（鼻咽拭子、肝臟、胸腔積液和肺臟等樣品）287份進行編號1～287號，并放在無菌PBS中處理（8 000 r/min離心5 min），取處理的上清液在超凈工作臺無菌中按照1：100比例分區劃線接種于副豬嗜血桿菌鑒別培養基（巧克力培養基）上，在含有5% CO2厭氧的環境中培養箱中37 ℃恒溫條件下培養12～18 h后，挑取副豬嗜血桿菌鑒別培養基（巧克力培養基）上單個典型菌落在無菌條件下接種于TSB液體培養基中37 ℃振蕩（100 r/min）12～18 h后，按照革蘭氏染色試劑盒說明書進行染色和顯微鏡觀察。

1.3 生化試驗鑒定

取1.2中純化培養的分離菌株，參照副豬嗜血桿菌特定生化鑒定試劑盒說明書，將1.2中純化培養的分離菌株，加入細菌生化鑒定試劑盒37 ℃恒溫培養24～48 h后鑒定其生化特性。

1.4 致病性試驗

參考文獻[9-10]的方法，將分離的副豬嗜血桿菌按照1.2中方法培養至對數期（采用分光光度計測定），在無菌的條件下計數，并調整純化培養的副豬嗜血桿菌濃度為108 cfu/mL，分離的副豬嗜血桿菌菌株的1株通過腹腔注射（劑量為0.25 mL/只）攻毒5只小鼠為攻毒組，未進行攻毒的5只小鼠以同樣的方法給予等量的TSB液體培養基，致病試驗期為7 d，在攻毒試驗期間，每天觀察2次，觀察其攻毒組和對照組的小鼠發病與死亡情況。

1.5 藥敏試驗

對分離菌株進行藥敏試驗，其操作方法參照美國臨床檢驗標準委員會（NCCLS）2020年推薦的標準K-B紙片法進行結果判定。

2 結果

2.1 細菌分離培養

采集的各種病料組織（鼻咽拭子、胸腔積液和肺臟）287份經分離培養結果顯示，分離的菌株在副豬嗜血桿菌鑒別培養基（巧克力培養基）上長出典型的菌落，通過TSB培養基純化培養，通過革蘭氏染色鏡檢，結果顯示，分離得到的菌株培養特性和形態學均符合副豬嗜血桿菌標準菌株的培養特性、形態學。

2.2生化試驗鑒定

分離的92株分離菌株的生化鑒定結果顯示，分離的92株分離菌株的生化特性與細菌生化鑒定試劑盒說明書的副豬嗜血桿菌的生化特性一致。

2.3 致病性試驗

攻毒試驗期間，經過觀察攻毒組小鼠和對照組的小鼠，其中攻毒組小鼠在攻毒后2～5 d出現死亡，個別小鼠表現為呼吸困難、腹圍增大等，剖檢死亡的小鼠可見肺臟出現了不同程度的水腫、出血，且腹腔出現嚴重滲出液。采集死亡小鼠的病料組織（肝臟、肺臟及心血等樣品）中分離得到了與攻毒一致的副豬嗜血桿菌，攻毒試驗結束，未攻毒組健康存活。其中62株副豬嗜血桿菌能引起小鼠死亡（40%～100%），為致病性副豬嗜血桿菌。

2.4 藥敏試驗

藥敏試驗結果由表1可知，62株副豬嗜血桿菌對青霉素、阿莫西林、氨芐西林等10種藥物的耐藥率為51.6%～91.9%，對頭孢噻呋、頭孢噻肟、環丙沙星等4種藥物耐藥率為6.5%～40.3%。

3 討論

仔豬副豬嗜血桿菌廣泛存在于自然界的養殖環境中，當飼養管理不當如應激（如天氣驟變、轉群、運輸）導致其免疫力下降引起發病，可以通過多種途徑（直接接觸傳播、空氣傳播、飼料飲水傳播等）在不同豬只之間傳播，為臨床中常見的條件致病菌之一[8-9]。副豬嗜血桿菌病可以引起豬嚴重的呼吸道感染，具有發病比較急、死亡率較迅速等特點，且在臨床中常常出現混合感染，尤其對仔豬的危害較大[10]。本試驗結果表明，采集的各種病料組織（鼻咽拭子、肝臟、胸腔積液和肺臟等樣品） 217份中分離到62株致病性的副豬嗜血桿菌分離菌株，其對小鼠的死亡率40%～100%。說明副豬嗜血桿菌是引起百色市不同地區規模化養殖場及散養戶中仔豬呼吸道感染的主要的病原菌，均為致病性菌株且均在百色市不同地區規模化養殖場及散養戶中流行嚴重，因此，對仔豬副豬桿菌病應進行有效的防控，可以考慮接種多價的副豬桿菌疫苗。仔豬副豬桿菌是臨床中常見的呼吸道性細菌病之一，在豬的養殖過程中主要通過抗生素進行防治，目前在養殖過程中抗菌藥物的濫用，導致其臨床中分離的副豬嗜血桿菌的耐藥性呈現日漸上升的趨勢，且出現嚴重的耐藥性，同時降低其治療效果[11]。藥敏試驗結果表明，62株致病性副豬嗜血桿菌對臨床中常用的10種抗生素耐藥率為51.6%以上，說明從該地區養豬場中分離的副豬嗜血桿菌對臨床中常用的藥物產生耐藥嚴重性。因此，應該引起重視，通過藥敏試驗進行分析其耐藥性，注意抗生素的合理使用，降低其耐藥性，提高治療效果，同時應該對養殖場和散養戶制定有效消毒制度，減少環境感染。■

參考文獻：

[1] 孔恒.生豬呼吸道疾病的綜合防治措施[J].中國動物保健， 2023， 25 （12）：

25-26+37.

[2] 瞿紅穎，劉欣，劉毅，等. 泰地羅新注射液對豬自然感染呼吸道疾病的臨床療效試驗[J].北方牧業， 2023 （23）： 10-11.

[3] 吳艷，黎娜銘，張宇鑫，等.豬呼吸道病原菌多重PCR檢測方法的建立及應用[J].動物醫學進展， 2023， 44 （12）： 82-87.

[4] 肖敏，劉建，盧昌，等.副豬嗜血桿菌的分離鑒定與滅活疫苗的初步研制[J].

動物醫學進展，2022，43（8）：35-40.

[5] 杜炎斌，袁麗英，東笑，等.英德市某規模化豬場副豬嗜血桿菌分離鑒定及藥敏試驗[J].動物醫學進展， 2022，43（6）： 32-36.

[6] 粟元文，粟翰霄.淺談副豬嗜血桿菌病的診斷與綜合防制[J].四川農業科技，2023（6）：65-68.

[7] 陳旺，王元，劉英玉，等.昌吉市某豬場副豬嗜血桿菌病的檢測分析[J].新疆畜牧業，2023，39（3）：22-26.

[8] 張鵬云，陳敏，劉明星，等.副豬嗜血桿菌間接ELISA抗體檢測試劑盒的研制與應用[J].中國農業科學，2023，56（8）：1606-1614.

[9] 徐引弟，王治方，焦文強，等.血清6型副豬嗜血桿菌的分離鑒定和生物學特性研究[J].黑龍江畜牧獸醫，2023（2）：62-65+69+135.

[10] 范春梅.湖南省部分家庭豬場呼吸道疾病流行病學調查分析[J].中國豬業，2020，15（5）：80-83.

[11] 馮建遠，吳廷瑛，郭旋，等.廣西規模化豬場呼吸道病原菌調查及耐藥性分析[J].中國豬業，2020，15（2）：66-69.