mTOR通路相關分子表達變化在HL60細胞增殖抑制中的作用研究

李琳 孫王男 任孝敏 姜紅

【摘 要】目的：探討維瑞肽多西紫杉醇對白血病HL60細胞增殖的抑制作用和分子機制。方法：CCK8法檢測維瑞肽多西紫杉醇對HL60細胞增殖的影響。采用流式細胞儀分析細胞周期變化。CR實驗檢測TOR通路相關分子的mRNA水平的變化。結果：維瑞肽多西紫杉醇可抑制HL60細胞增殖，細胞周期阻滯于G0/G1期。TOR相關分子PI3K、AKT、mTOR分子mRNA水平明顯下降。結論：維瑞肽多西紫杉醇抑制HL60細胞的增殖的作用與PI3K、AKT、mTOR分子mRNA水平表達下降有關。

【關鍵詞】 HL60細胞;維瑞肽多西紫杉醇; 增殖

Methods： HL60 cells were subcultured in RPMI1640 medium containing 10% fetal bovine serum， and the cells in logarithmic growth phase were cultured. The effect of VRT-DTX on the proliferation of HL60 cells was detected by CCK8 assay， and the inhibition rate of cell proliferation was calculated. Flow cytometry was used to analyze the changes of cell cycle after different drugs. qPCR method was used to detect the expression of PI3K、AKT and mTOR.RESULTS： voramide peptide docetaxel inhibited the proliferation of HL60 cells， and the inhibitory effect was enhanced with the increase of drug concentration and duration of action. The expression of G0/G1 phase is prolonged， S phase is shortened， cell cycle is arrested in G0/G1 phase; It indicated that voramide peptide docetaxel can exert anti-proliferative effect by induce cell cycle arrest of HL60 cells; the expression of PI3K、AKT and mTOR is significantly down-regulated. Conclusion： The voramide peptide docetaxel can inhibit the proliferation of HL60 cells， which correlated to down-regulation of PI3K、AKT and mTOR in HL60 cells.

Key words： HL60 cell; VRT-DTX; proliferation

【中圖分類號】 R94

【文獻標識碼】 A【文章編號】 1672-3783（2019）04-03-031-01

白血病靶向治療和定向誘導分化是目前國內外關注的重點方向之一。其中，與生長素受體特異性結合的維瑞肽與化療藥物結合可以增加化療藥物的靶向性。我們在研發多西紫杉醇-維瑞肽偶合物（簡稱維瑞肽多西紫杉醇）的基礎上，重點探討了其誘導白血病HL60細胞凋亡的作用，同時研究了其作用的分子機制。

1 材料與方法

1.1 主要原料與試劑耗材：

（DTX）2-維瑞肽偶合物（本課題組自行合成）;CK8試劑盒，碧云天公司;Annexin V /PI凋亡試劑盒，日本同仁公司;雙抗，索萊寶公司。

1.2 細胞增殖與凋亡檢測：CCK-8法測定細胞增殖，Annexin V-FITC/ PI雙標的流式細胞儀法測定細胞凋亡水平。

1.3 qPCR檢測在偶合物作用下HL60細胞中BAX， Caspase3/8/9及BCL2的mRNA水平的變化：調整細胞數為5×106-1×107cells，Trizon法提取RNA，常規方法進行逆轉錄，熒光定量qPCR測定基因表達水平。

2 結果

2.1 維瑞肽多西紫杉醇對HL60細胞增殖抑制作用的影響：HL60細胞經不同濃度（DTX）2-VRT和多西紫杉醇 （5x10-8 mM至5 mM）處理后48 h后，根據公式計算的細胞的增殖抑制率計算IC50， （DTX）2-VRT對HL60細胞作用后的IC50為0.001906μm。

2.2 流式檢測偶合物對HL60細胞周期的影響

PI標記后經流式細胞儀檢測結果顯示，對照組HL60細胞是G1期比例為21.4%，經不同濃度的（DTX）2-VRT（0.0001906μm，0.001906μm，0.01906μm）作用48h后，HL60細胞G1期比例升高，分別為 31.24%、34.8%、46.34%。

2.3 qPCR檢測在多西紫杉醇維瑞肽偶合物作用下HL60細胞中mTOR通路相關分子PI3、AKT、mTOR分子mRNA水平的變化

圖1所示，HL60細胞經不同濃度的（DTX）2-VRT（0.0001906μm， 0.001906μm，0.01906μm）作用48h后，PI3K、AKT、mTOR分子mRNA水平都是明顯下降的，推測（DTX）2-VRT可以通過抑制mTOR通路抑制HL60的細胞的增殖。

3 討論

化學抗癌藥因自身弱點而產生毒副作用，是癌癥難以治愈的重要原因之一，多西紫杉醇（DTX）也不例外[1-2]。眾多研究表明，腫瘤細胞可高密度表達正常細胞不具有的某些特殊受體，針對這些特殊受體及可選擇性與受體結合的靶向多肽開展研究而發展起來的分子靶向抗癌治療策略。維瑞肽 （Vapreotide，VRT）是在對內源性靶向多肽生長抑素進行結構修飾及調整的基礎上，通過化學合成而得的高效靶向多肽之一[3-4]。維瑞肽偶聯的化療藥物是增加抗腫瘤靶向性的重要技術方向。

本項目中所采用的創新技術將抗癌藥物多西紫杉醇DTX與小分子靶向多肽維瑞肽相結合，合成多西紫杉醇-維瑞肽偶合物。結果表明維瑞肽多西紫杉醇可抑制HL60細胞增殖，G0/G1期延長，S期縮短。PI3K、AKT、mTOR分子mRNA水平都是明顯下降。初步證明維瑞肽多西紫杉醇具有明顯抑制HL60細胞的增殖的作用，并與PI3K、AKT、mTOR分子mRNA水平表達下降有關。

參考文獻

[1]Bisserier M， Wajapeyee N.Mechanisms of resistance to EZH2 inhibitors in diffuse large B-cell lymphomas. Blood. 2018 Mar 23. pii： blood-2017-08-804344.

[2]Liu Y， Li Y， Ou Q， Wu X， Wang X， Shao YW， Ying J.Acquired EGFR L718V mutation mediates resistance to osimertinib in non-small cell lung cancer but retains sensitivity to afatinib.Lung Cancer. 2018 Apr;118：1-5.

[3]Feng Q， Yu MZ， Wang JC， Hou WJ， Gao LY， Ma XF， Pei XW， Niu YJ， Liu XY， Qiu C， Pang WH， Du LL， Zhang Q.Synergistic inhibition of breast cancer by co-delivery of VEGF siRNA and paclitaxel via vapreotide-modified core-shell nanoparticles.Biomaterials. 2014 Jun;35（18）：5028-38.