長期化肥減量配施秸稈對水稻土壤微生物多樣性和功能的影響
2024-11-07 00:00:00曾憲楠王曉慧孫羽王麒宋秋來梁全喜
江蘇農業科學 2024年18期
摘要：為探究長期化肥減量配施秸稈對水稻土壤微生物結構和功能的影響，以東北黑土為試驗對象，基于黑龍江省農業科學院長期水稻秸稈還田和化肥減施平臺，利用高通量測序技術對化肥不同施加量［N1（173 kg/hm2）、N2（133 kg/hm2）、N3（93 kg/hm2）、N4（53 kg/hm2）、N5（0 kg/hm2）］配施水稻秸稈（所有處理秸稈還田量均為7 500 kg/hm2）土壤細菌和真菌群落結構和功能進行研究，分析土壤微生物群落結構和功能與土壤理化性質之間的關系。結果表明，不同化肥施加量配施水稻秸稈顯著改變了土壤全氮、全磷和速效鉀的含量。秸稈還田下化肥施加量處理對土壤細菌香農指數和Chao1指數影響顯著，但對土壤真菌α多樣性指數并未產生顯著影響。主坐標結果表明，秸稈還田下化肥施加量處理可對土壤細菌和真菌的群落結構產生顯著影響。酸桿菌門、放線菌門和擬桿菌門是相對豐度最高的3個細菌門。擔子菌門、子囊菌門和壺菌門是相對豐度最高的3個真菌門。基于FAPROTAX分析土壤細菌的功能，所有處理中土壤細菌的主要功能是chemoheterotrophy（20.71%）>aerobic_chemoheterotrophy（11.37%）>nitrification（7.54%）。基于FunGuild分析土壤真菌功能，所有處理中土壤真菌的主要功能是Saprotroph>Pathotroph>Symbiotroph。結構方程表明，在秸稈還田基礎上氮肥的減少會使土壤中的N和P累積，但會使土壤有機質含量增多，并通過增加土壤有機質的含量影響土壤細菌多樣性。化肥添加量會改變土壤pH值而影響土壤真菌多樣性。土壤細菌多樣性與土壤全氮、硝態氮、總鉀和速效鉀含量呈正相關，而土壤真菌多樣性與速效磷、有機質含572t9bJMg5f41x9u2hkQdsdMOWXWD8EHmC6hXfzKuN8=量呈正相關。本研究結果表明減少氮肥施加是提高土壤微生物多樣性，改善土壤質量的有效手段。
關鍵詞：秸稈；水稻土；高通量測序；結構方程模型；網絡分析
中圖分類號：S511.06 文獻標志碼：A
文章編號：1002-1302（2024）18-0251-10
收稿日期：2023-10-31
基金項目：黑龍江省省屬科研院所科研業務費（編號：CZKYF2021-2-C027）。
作者簡介：曾憲楠（1985—），女，黑龍江綏化人，碩士，副研究員，主要從事保護性耕作研究。E-mail：zengxiannanzxn@163.com。
水稻是主要的糧食作物，水稻全球的種植面積超過1.62億hm2，是全球半數以上人口的主食［1-2］，也是我國主要的糧食作物［3］。隨著經濟的快速發展和為了滿足人口對糧食的最基本需求，需要提高水稻產量。追求產量增加導致人們過度施用化肥，我國已成為世界上最大的化肥消費國［4］。長期大量、單純地使用化肥導致溫室氣體排放增加［5-6］，引起氮磷水污染［7］，土壤退化［8］，降低化肥使用效率，影響作物產量［9］，農業的可持續發展受到嚴重威脅。保障國家糧食安全，推進農業綠色可持續發展，保持土壤肥力的前提下，化肥的合理施用已成為農業生產的研究熱點。
我國作為農業大國，具有豐富的農作物秸稈資源，每年農作物秸稈產出量將近7億t［10-11］。農作物秸稈富含農作物生長所需的主要營養元素，秸稈還田可改良土壤結構，提高土壤肥力［12-13］。已有學者對化肥減量配施秸稈進行研究。吳立鵬等研究發現，與常規施化肥比較，秸稈還田與減量氮肥配施使稻田土壤有機碳、可溶性有機碳含量增加［14］。對于小麥產量，與常規施化肥比較，秸稈還田與減量氮肥配施對小麥產量無負面影響［15］。秸稈還田與減量氮肥配施是減少化肥用量的一種有效措施。
土壤中微生物種類豐富且數量眾多，在土壤生態功能，尤其是元素循環過程中扮演著重要角色，對植物的健康起到重要作用［16-17］。土壤微生物對環境變化較為敏感，微生物群落的改變從一定程度上反映了土壤生態功能變化。因此，研究長期化肥減施配秸稈還田對土壤微生物群落的影響，對評價秸稈還田和配施化肥對土壤生態的影響以及尋找環境友好型的農業措施具有重要的指導意義。已有的研究發現使用化肥減施和秸稈還田會顯著改變土壤微生物學特性。Huang等的研究表明，秸稈與化肥減量配施可以提高紫色土土壤氨氧化細菌和氨氧化古菌的amoA基因多樣性［18］。楊濱娟等研究秸稈還田與不同比例化肥配施對稻田土壤根際微生物的影響，發現秸稈還田處理能夠增加固氮菌的數量［19］。可見不同農作物的秸稈、不同的土壤類型對土壤微生物群落結構和豐度的影響不一致。
黑土具有土質肥沃、保肥、適宜農作物生長等良好的農業生產條件，黑龍江省位于我國黑土帶上，已成為我國重要的商品糧生產基地，也是我國糧食安全的“壓艙石”［20］。對水稻秸稈還田的研究較多，以往的研究主要集中探討了秸稈還田對作物產量［21-22］或土壤理化性質的影響［23-24］，但是關于水稻秸稈還田與化肥減量配施后，東北黑土土壤微生物群落結構和多樣性變化的研究較少。為此，以東北黑土為對象，基于黑龍江省農業科學院長期水稻秸稈還田和化肥減施平臺，應用高通量測序技術，研究水稻秸稈與化肥減量配施對土壤細菌和真菌群落結構的影響及與土壤理化性質的關系，以期為寒地稻田合理施肥提供科學依據。
1 材料與方法
1.1 試驗區概況
試驗于2017年在黑龍江省農業科學院現代農業示范區（45°49′N，126°48′E，海拔117 m）進行。該地區屬中溫帶大陸性季風氣候，冬夏季節短，年平均氣溫為4.5 ℃，年平均氣溫≥10 ℃有效積溫2 700 ℃以上，作物年生長周期約為155 d，年平均降水量為569.1 mm，降水主要集中在6—9月。供試土壤類型為黑土。0～20 cm土層土壤養分含量如下：土壤有機質含量為26.50 g/kg，全氮含量為2.01 g/kg，有效氮含量為79.56 mg/kg，有效磷含量為55.84 mg/kg，速效鉀含量為168.42 mg/kg。
1.2 試驗材料
供試水稻品種：龍稻21（培育單位為黑龍江省農業科學院耕作栽培研究所）；供試秸稈為單季水稻殘體，生長周期完成后，冬季不留茬。秋季收獲水稻，將試驗區所有秸稈搬出區外，人工粉碎成約5 cm，秸稈按照不同處理用量，均勻拋撒，翻埋殘茬秸稈，越冬；翌年春季泡田后使用攪漿平地機平整土地，插秧。田間管理措施同當地常規管理一致。
1.3 試驗設計
采用單因素試驗設計，共有5個氮肥施入量，分別為N1（173 kg/hm2）、N2（133 kg/hm2）、N3（93 kg/hm2）、N4（53 kg/hm2）、N5（0 kg/hm2）（表1）。所有處理秸稈還田量均為7 500 kg/hm2。所有處理的磷、鉀施入量分別為純磷46 kg/hm2，純鉀75 kg/hm2（依據當地施肥方法及用量）。
1.4 樣本采集
于2023年水稻收獲期進行土壤樣品采集。用土鉆在每個小區按照S型隨機采集5點，采集0～20 cm土層土壤，5點混合為1個復合樣品。去除土壤中的石塊和植物殘茬，用2 mm的篩子篩土。一部分土壤樣品經風干后用于測定土壤的理化性質。另一部分樣品在-80 ℃冰箱中冷凍保存，用于微生物DNA的提取和群落分析。
1.5 測定方法
1.5.1 土壤化學性質測定
全氮含量采用凱氏定氮法測定，堿解氮含量采用堿解擴散法測定，銨態氮含量采用KCl浸提蒸餾-凱氏定氮法測定，硝態氮含量采用酚二磺酸法測定，土壤總有機碳含量采用重鉻酸鉀法測定，總磷含量采用鉬銻抗分光光度法測定，速效磷含量采用Olsen法測定，速效鉀含量采用火焰光度法測定，pH值采用電位法測定［25］。
1.5.2 微生物測序
使用Mobio12888 power soil extraction kit提取土壤總DNA。本研究通過Illumina MiSeq測序平臺檢測土壤細菌16S rRNA基因片段序列，引物是16S rRNA基因V4區的通用引物515F（正向引物：5′-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3′）和806R（反向引物，5′-GACTACHVGGGTWTCTAAT-3′）。真菌使用ITS rDNA上的ITS1-ITS2可變區ITS1（5′-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3′） 和ITS2 （5′-GCTGCGTTCATCGATGC-3′）。每個樣品含有特有的6 bp條形碼序列被添加到引物中，用于區分多個樣品。PCR反應體系共25 μL：含有 2.5 μL TransStart Buffer、2 μL dNTP、1 μL 正向/反向引物 （10 ng/μL）和1 μL DNA（30 ng/μL）模版，17.5 μL去離子水。 PCR條件如下：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃45 s，30個循環；72 ℃最終延伸10 min。PCR產物經2%瓊脂糖電泳檢測，并使用AxyPrep DNA純化試劑盒進行純化。每個樣品分別進行3個PCR重復，然后等量合并3個PCR樣品，并在Illumina Miseq v3平臺 （2×300 bp） 上進行PE300雙端測序。
1.5.3 高通量測序數據分析
使用北京百邁克生物信息云平臺上的QIIME1（版本1.81）軟件對原始序列進行分析。
原始序列按照以下標準進行質量過濾：去除平均得分<20或長度<200 bp的原始序列。 使用 PEAR軟件（版本0.9.8）對雙端測序序列進行拼合。使用Usearch軟件（版本7.1）去除嵌合體。使用UPARSE軟件以 97% 的相似度生成操作分類單位 （OTU）并對OTU的代表性序列進行分類學注釋，置信度閾值為0.7，細菌比對數據庫為SILVA（v.3.2），真菌比對數據庫為UNITE（v.8.2）。所有序列按照單個樣本的最低序列數對序列進行歸一化后進行后續的統計分析。
1.6 數據分析
基于OTU表計算所有樣品的α多樣性指數和β多樣性指數（主坐標分析），使用R軟件（v.3.2.5）的Vegan軟件包計算。采用FAPROTAX功能預測分析環境樣品中細菌分為80多個功能分組（如硝酸鹽呼吸、產甲烷、發酵、植物病原等）。采用FunGuild功能預測將環境樣品中真菌分為病理營養型（pathotroph）、共生營養型（symbiotroph）、腐生營養型（saprotroph） 3個營養型。利用Spearman相關方法分析了土壤微生物與養分含量之間的關系，并構建相關矩陣。利用通徑系數（也稱為結構方程模型）分析了N添加、微生物多樣性、土壤理化性質之間的關系。使用AMOS 22.0（IBM Corporation，美國）軟件對SEM進行分析。使用SPSS 22.0進行數據統計分析。分別使用Kolmogorov-Smirnov和Levene檢驗分析了數據分布的正態性和異方差特征。使用Origin 8.0軟件繪制圖表。
2 結果與分析
2.1 長期化肥減量配施秸稈對水稻土壤化學性質的影響
在秸稈還田下，不同化肥施加量僅對土壤全氮、全磷和速效鉀含量有顯著影響（圖1）。其中，土壤全氮含量隨著化肥施加量減少呈先下降后上升再下降的趨勢。土壤全磷含量隨著化肥施加量的減少呈先上升后下降趨勢，在N2處理達到最高值。土壤速效鉀含量呈現的規律為N4>N2>N1>N3>N5，N4與其他4個處理差異顯著。
2.2 長期化肥減量配施秸稈對水稻土壤微生物α多樣性的影響
在秸稈還田下不同化肥施入量對土壤細菌香農指數和Chao1指數的影響顯著（表2）。Chao1指數呈現的規律為N4>N5>N1>N2>N3，香農指數呈現的規律是N5>N4>N1>N2>N3。但是土壤真菌香農指數和Chao1指數在不同化肥施加量處理下差異并不顯著（表2）。
2.3 長期化肥減量配施秸稈對水稻土壤微生物β多樣性的影響
基于Bray-Curtis距離的非度量多維排列NMDS，結果表明不同處理下土壤細菌（R2=0.19，圖2-A）和真菌群落組成（R2=0.31，圖2-B）均存在顯著差異。
2.4 長期化肥減量配施秸稈對水稻土細菌和真菌群落結構組成的影響
細菌共有OTU數量為1 969個，N1處理特有OTU數目為123個，而N5特有種OTU數目為101個（圖3-A）。真菌共有OTU數量為360個，N1處理特有OTU數目為256個，而N5特有種OTU數目為189個（圖3-B）。通過GraPhlAn可視化結果所示，細菌門水平上節點大小表現前3位為酸桿菌門（Acidobacteria）>放線菌門（Actinobacteria）>擬桿菌門（Bacteroidetes）（圖3-E）。真菌門水平上節點大小表現為擔子菌門（Basidiomycota）>子囊菌門（Ascomycota）>壺菌門（Chytridiomycota）（圖3-F）。細菌相對豐度屬水平前3位分別是uncultured_bacterium_f_Nitrosomonadaceae、uncultured_bacterium_f_Anaerolineaceae、Sphingomonas（圖3-C）。其中，N1處理的uncultured_bacterium_f_Nitrosomonadaceae和uncultured_bacterium_f_Nitrosomonadaceae高于其他處理組（圖3-C）。而Sphingomonas在N5處理中最高。真菌相對豐度屬水平前3位分別是Cladosporium、Mrakia、Schizothecium（圖3-D）。其中，在N3處理的Cladosporium達到最低相對豐度。在N4處理Mrakia為最低值，而Schizothecium為最高值（圖3-D）。
2.5 相關性網絡與關鍵種
微生物隨機分子生態網絡（MENA）結果顯示，土壤細菌中共有45個nodes，100個edges，modularity是0.460，graph_diameter是16.62，graph_density是0.101，clustering_coefficient是0.364，正相關68%，負相關32%（圖2-C）。其中，與周圍物種聯系緊密并且主要呈正相關的主要是Proteobacteria門，主要與周圍物種呈負相關的是Bacteroidetes（圖2-C）。土壤真菌中共有50個nodes，100個edges，modularity是0.473，graph_diameter是19.59，graph_density是0.082，clustering_coefficient是0.309，正相關85%，負相關15%（圖2-D）。其中，與周圍物種聯系緊密并且主要呈正相關的主要是Ascomycota，主要與周圍物種呈負相關的是Basidiomycota（圖2-D）。Zi-pi圖結果表示土壤細菌中有5個關鍵屬（Connectors），分別為uncultured_Acidobacteria_bacterium、uncultured_bacterium_c_OPB35_soil_group、Sphingomonas、uncultured_bacterium_o_Gaiellales、Pseudarthrobacter。其中，Pseudarthrobacter、Sphingomonas在N5處理的相對豐度最高，分別為0.85%和2.47%。土壤真菌中有5個關鍵屬（Connectors），分別為Pyrenochaetopsis、Vishniacozyma、Stenella、Ramichloridium、Hortaea。其中，Pyrenochaetopsis和Hortaea在N4處理中相對豐度最高。
2.6 微生物之功能預測
由圖4-A可知，基于FAPROTAX分析土壤細菌的功能，所有土壤中相對豐度前3位的是chemoheterotrophy、aerobic_chemoheterotrophy、nitrification。chemoheterotrophy在N5處理達到最高值20.71%。nitrification、aerobic_ammonia_oxidation等功能相對豐度在N4處理達到最高值，分別為11.37%、7.54%。基于FunGuild分析土壤真菌功能，總體上3種營養類型豐度從高到低分別是嗜酸>病理營養>共生營養（圖4-B）。進一步對真菌功能進行分析，結果表明相對豐度前3位的是腐生真菌、蘭科腐生、植物病原體，且隨著化肥施加量的降低，腐生功能相對豐度先降低再升高再降低，而病原體表現出先升高再降低再升高的趨勢，關鍵拐點均為N3和N4處理（圖4-C）。
2.7 相關性分析
結構方程結果表明，在秸稈還田基礎上氮肥的減少會使土壤中的N和P累積、土壤細菌和真菌的多樣性、pH值減少，但土壤有機質含量增多，并且通過增加土壤有機質的含量影響土壤細菌多樣性（圖5-A）。 化肥添加量會改變土壤pH值而影響土壤真菌多樣性（圖5-A）。土壤細菌多樣性與土壤全氮、硝態氮、總鉀和速效鉀含量呈正相關，而土壤真菌多樣性與速效磷、有機質含量呈正相關（圖5-B）。
3 討論與結論
3.1 少量氮肥施加結合秸稈還田提高土壤微生物多樣性
本研究發現，化肥施加會顯著影響細菌α多樣性但是對真菌alpha多樣性影響不顯著（表2），并且少量添加氮肥（53 kg/hm2）和不添加氮肥（0 kg）下土壤中細菌明顯高于其他化肥添加量組（表2）。這是由于一方面適當的氮肥施加是促進微生物活動的關鍵。少量的氮肥不僅可以為土壤中的微生物提供額外的氮源，促進微生物的代謝活動和生長，還可以改變土壤中的生態環境，刺激一些特定類型微生物的生長和多樣性，豐富土壤微生物群落，這與之前的研究結果［26-27］一致。有研究表明單獨添加化肥可顯著改變土壤真菌多樣性，少量添加會增加土壤真菌多樣性，而大量添加會顯著抑制土壤真菌的多樣性［28］。本研究由于秸稈還田和化肥同時添加，秸稈的施加導致土壤中有機碳含量和種類都發生了改變，反而抵消了化肥添加所導致的土壤養分之間的化學計量的改變，因此土壤真菌并未發生改變。馬玉穎等的研究結果表明，有機肥和秸稈還田會顯著提高砂姜黑土真菌多樣性［29］。這表明土壤真菌對秸稈還田和化肥添加的響應是不同的，這也與秸稈的質量、土壤類型等緊密相關［29］。秸稈還田能夠增加土壤的有機質含量，豐富土壤中的碳源，為微生物提供多樣的有機質和營養物質。秸稈還田還能夠改善土壤結構，增加團聚體數量，增加土壤的通透性和空氣含量，為微生物提供適宜生長的空間。總之，在秸稈還田的基礎上只需要少量或者不施加氮肥即可維持土壤中細菌和真菌的多樣和豐富度。
3.2 少量氮肥施加結合秸稈還田對土壤微生物組成的影響
本研究發現，優勢細菌在未添加氮肥的處理中含量最高，Sphingomonas在未添加氮肥（0 kg）的處理組相對豐度最高（圖3-C）。據報道Sphingomonas能夠利用多種有機污染物作為碳源和能源，如多環芳烴、農藥、染料等，從而減少這些物質對植物和環境的危害、促進植物生長，這有助于糧食安全生產和糧食高產。此外，uncultured_bacterium_f_Nitrosomonadaceae隨著氮肥減施呈先下降后上升的趨勢，這表明本身土壤的硝化細菌也能夠滿足農田土壤的氨氧化過程累積氮的需求。特別是，Sphingomonas既是優勢屬也是關鍵屬。Pseudarthrobacter、Sphingomonas等關鍵屬與周圍物種聯系密切，并且他們也在無氮肥添加處理中相對豐度最高。
然而，優勢真菌在少量氮肥的處理中表現優異。Cladosporium是一種致病菌，而其相對豐度在N3和N4處理中較低。而Schizothecium相對豐度在N4處理中最高，Schizothecium能夠提高植物活力、植物鮮重、根鮮重和根干重，這使得植物能夠向土壤中分泌更多促進微生物多樣性的物質。此外，Hortaea、Pyrenochaetopsis屬等真菌與周圍物種聯系緊密，并且也在低氮肥添加處理中相對豐度最高。據報道，Hortaea能有效防治植物和真菌性土傳病害，同時可使植物葉部的細菌和真菌病害明顯減少。Pyrenochaetopsis能夠直接參與調節土壤碳循環中的土壤呼吸作用和土壤酶活性，并且對土壤難溶性碳（有機質等）具有較強的溶解能力［30］。總之，在秸稈還田基礎上，減少氮肥施加量能夠調動土壤中優勢和關鍵物種來促進碳氮循環、生物降解、病害防治、污染修復等。
3.3 少量氮肥施加結合秸稈還田促進土壤養分的累積
在秸稈還田的基礎上，土壤中總氮、堿解氮含量隨著氮肥的減施呈波動上升，而硝態氮和銨態氮含量波動下降。這可能是由于少量的氮肥會促進土壤的固氮作用，大量的氮肥反而會起抑制作用。一部分氮會被土壤團聚體或有機質吸附，降低氮的流失速率，從而增加土壤的氮含量；少量的氮肥可以促進土壤中氮循環過程，增強土壤中氮的微生物分解作用，本研究中硝化細菌的豐度在少量施加氮肥處理中也明顯增多（圖3），這些微生物能夠分解秸稈，氮有效性通過優先改變秸稈碳同化微生物群落介導土壤有機質的啟動效應。此外，少量的氮肥可能導致土壤pH值的變化，使土壤中的氮更容易形成穩定的化合物，不容易流失，從而增加土壤氮含量［31］。
在秸稈還田基礎上，在少量施加氮肥的處理中土壤有效鉀含量和土壤pH值達到最高值。這是由于秸稈還田可改善土壤結構，增加土壤的有機質含量，改善土壤的質地，這有助于提高土壤的保水保肥能力，有利于磷、鉀等營養物質的積累。同時，有機質含量與土壤中鉀含量顯著相關（圖5），一方面秸稈還田通過增加大團聚體中的土壤腐殖酸來提高對鉀的吸附；另一方面，秸稈的摻入能夠在一定程度上提高土壤中磷鉀的有效性，使其更易被植物吸收［32］。
施用少量氮肥可以為作物生長提供必要的營養物質，促進植物對磷和鉀的吸收，提高植物對這些養分的利用效率，有助于土壤中磷鉀的累積。此外，施加少量的氮肥可促進微生物活動，土壤中的微生物會參與分解釋放出養分，包括磷和鉀，將這些養分轉化為植物可吸收的形式。本試驗結果表明，細菌主要通過調節土壤中鉀含量，而真菌主要通過調節磷含量來改善土壤質量（圖5）。總之，在秸稈還田的基礎上應當注意適量施用氮肥，避免過量氮肥造成負面影響，以實現土壤養分、pH值的合理調控。
綜上所述，在秸稈還田基礎上，少量化肥或者不使用化肥能夠提高土壤細菌和真菌的多樣性和微生物之間的聯系，促進優勢屬和關鍵屬發揮降解污染、促進植物生長、氮素循環等功能，提高土壤磷鉀的含量。因此，減少氮肥施加是提高土壤微生物多樣性，改善土壤質量的有效手段。本試驗結果可為秸稈還田替代化肥技術的應用提供技術支持，為化肥減施的農業可持續發展提供理論依據。
本研究發現，東北黑土區水稻秸稈條件下，不同化肥添加量對土壤微生物多樣性的影響并不一致。不同化肥添加量對土壤細菌α多樣性的影響要顯著高于真菌α多樣性，但均顯著改變了土壤細菌和真菌β多樣性。不同化肥施加量顯著改變了土壤全氮、全磷、有效鉀的含量，但是對其他理化性質影響不顯著。不同化肥添加量并不會導致土壤細菌和真菌的優勢菌發生改變，但會顯著改變其相對豐度，細菌門中酸桿菌門、放線菌門和擬桿菌門相對豐度最高；真菌門中擔子菌門、子囊菌門和壺菌門相對豐度最高。土壤細菌群落組成和多樣性主要受到土壤全氮、硝態氮、總鉀和速效鉀含量的影響，土壤真菌群落結構和多樣性主要受到土壤pH值的影響。綜上，化肥減施下秸稈還田會改變土壤微生物的結構和多樣性，而常規水稻秸稈還田可以提高土壤微生物的多樣性，對保護土壤的健康和穩定具有積極意義。
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