有機肥替代氮肥對煙草青枯病發生及土壤微生物群落的影響

摘要：為探究有機肥替代氮肥對煙草青枯病發生及土壤微生物群落的影響，選擇有煙草青枯病發病史的田塊進行試驗，設置常規施肥（CK）、常規施肥70%+牛糞有機肥30%（T1）和常規施肥70%+生物碳基肥30%（T2）3個處理，測定各處理的煙根附近土壤的理化性質和酶活性，采用16S rDNA和ITS基因測序技術探究有機肥替代氮肥對煙草青枯病發生和根際土壤微生物群落結構產生的影響。結果表明，與CK相比，T1、T2處理均提高了土壤pH值、有效磷含量、堿解氮含量以及磷酸酶、脲酶的活性，使青枯病的發病率和病情指數下降；T2處理整體提高了微生物α多樣性；PCoA結果表明，有機肥替代氮肥對土壤微生物有顯著影響（P<0.05）。在門水平結構分析中，T2處理使酸桿菌門（Acidobacteria）和子囊菌門（Ascomycota）的相對豐度增加，使變形菌門（Proteobacteria）和毛霉門（Mucoromycota）的相對豐度降低；在屬水平結構分析中，使苔蘚桿菌屬（Bryobacter）和原隱球菌屬（Saitozyma）的相對豐度增加，朱氏桿菌屬（Chujaibacter）和傘狀霉屬（Umbelopsis）的相對豐度降低。冗余分析和Pearson分析結果顯示，pH值、有效磷含量和堿解氮含量等理化因子是影響土壤中微生物發生變化的關鍵因子。說明有機肥替代氮肥可改善煙草青枯病的發生情況，對煙根附近的微生物多樣性和結構造成的影響較大。本試驗中生物碳基肥替代部分氮肥的總體效果最好，適當增加生物碳在基肥中的比例有利于構建良好的土壤環境。

關鍵詞：有機肥；煙草青枯病；微生物多樣性；細菌；真菌

中圖分類號：S572.06；S154.3 文獻標志碼：A

文章編號：1002-1302（2024）18-0261-09

收稿日期：2023-09-14

基金項目：貴州省煙草公司重點研發項目（編號：2021XM15）。

作者簡介：李宏城（1999—），男，云南大理人，碩士研究生，主要從事煙草微生物研究。E-mail：168383959@qq.com。

通信作者：呂 芬，碩士，副教授，主要從事煙草栽培及生理生化研究。E-mail：lvfen18 @163.com。

煙草是重要的經濟作物，長期以來在國家稅收中起著不可替代的作用，也能解決部分農村人口的就業問題，增加農民收入。然而，一些煙農長期受到原有思想的禁錮，專業能力不足，甚至不顧及當地煙草公司的相關管理，完全依靠在生產上多年積累的經驗栽培而看輕了烤煙的特殊性，為使利益最大化，一味地追求產量；有的年輕煙農只聽從長輩的建議栽培而不從發展的角度對待問題，持續施用化肥，造成煙葉產質量與當初的想法相違背，土壤通透性變差，打亂了生物間的內在聯系，環保問題變得錯綜復雜等一系列難以彌補的后果，也加劇了煙草青枯病的嚴重性^［1］。煙草青枯病又叫細菌性萎蔫病，是由茄科雷爾氏菌（Ralstonia solanacearum）大肆蔓延而引起的，該病發病程度高，寄主分布廣泛，頻繁發生對煙草產質量造成的影響不可忽視^［2-3］。一般情況下，對煙草青枯病的防控措施主要包括從源頭上選育抗病品種、針對病情噴灑化學農藥及改進栽培方式、加強田間管理等方面^［4-6］，但這些防控措施通常導致成本較高、水土資源遭受到污染、所需勞動力較多、投入和回報成正比的關系不夠突出。

有研究表明，有機肥替代化肥中15%的氮能夠提高土壤速效磷、全氮、全鉀、有效硅等一系列營養元素在土壤中所占的比例，還可以增加轉化酶、脲酶、脫氫酶的活性^［7］。有機肥配施減量化肥對煙草青枯病有一定的防控作用^［8］，在很大程度上能使土壤微生物區系朝著有利于植物生長的方向發展，增強其代謝活性，減少土傳病害發生，從而提高農產品的產量和品質^［9-11］；另有研究表明，與僅僅施加煙草無機專用肥相比，配施一定量有機肥的土壤pH值以及速效磷、有效氯、活性有機質所占的比例，在煙株逐漸長大的還苗期、伸根期、旺長期、成熟期都更高；施用過有機肥的烤煙，在煙葉制作成香煙后，可調和各化學成分間的比例，降低燃燒時對口腔的刺激性，縮減品質低劣的煙氣，讓消費者抽吸的舒適感、愉悅感上升^［12-13］。此外，前人的研究結果表明，土壤微生物的廣泛化，可以體現微生物群落層次布局的變化程度、養分吸收水平、彼此間發揮的作用和物種組成數量的變動，盡快展示出地里泥土微環境的系統動態過程^［14］，用人為干預的方式，使土壤微生物群落和功能更加多樣化，以達到限制莊稼病蟲害廣泛傳播的目的^［15-16］。目前，對青枯病緩解的方法是以化學藥劑或利用噬菌體減少土壤中的茄科雷爾氏菌為主，在加強對植煙土壤保育的趨勢下，用有機肥替代化肥成為研究的焦點，而施用有機肥替代部分化肥減少煙草青枯病發生及對根際微生物群落的影響還需要進一步研究。本試驗用不同種類有機肥替代部分化肥，通過測定土壤理化性質及酶活性，研究土壤微生物群落的結構變化，調查青枯病的發病率和病情指數，建立土壤理化性質、酶活性和微生物群落結構與青枯病的內在聯系，旨在為當地煙草青枯病的防控和肥料施用提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 試驗地概況

試驗于2022年4—9月在貴州省安順市東屯鄉（106°14′6″E，26°10′40″N）進行，海拔1 222.7 m。土壤質地為水稻土，試驗地平坦，光照充足，灌溉方便，肥力適中且均勻，有較高的煙草青枯病發病史。基礎理化性狀：pH值5.49，全氮含量3.18%，有機質含量0.94%，有效磷含量126.74 mg/kg，速效鉀含量427.18 mg/kg，全磷含量0.78%，全鉀含量10.13%，堿解氮含量173.65 mg/kg。

1.2 試驗材料

選擇云煙87作試驗對象。肥料采用的是煙草專用復合肥，N、P₂O₅、K₂O的含量分別為10%、11%、24%；牛糞有機肥，氮、磷、鉀養分含量分別為1.79%、1.85%、2.08%；生物碳基肥，氮、磷、鉀養分含量分別為3.02%、1.42%、0.64%；普鈣（P₂O₅含量≥12%）、硫酸鉀（K₂O含量≥52%）。

1.3 試驗設計

本試驗共設置3個處理，每個處理3次重復，共9個小區，每個小區不低于60株煙苗，株行距為50 cm×110 cm。以當地常規施肥（N含量75 kg/hm²，P₂O₅含量82.5 kg/hm²，K₂O含量180 kg/hm²）為對照（CK），其他2個處理分別為煙草專用復合肥70%+牛糞有機肥30% （T1）處理、煙草專用復合肥70%+生物碳基肥30% （T2）處理。根據牛糞有機肥、生物碳基肥的氮投入比例占總投入養分比例的30%分別計算試驗的施肥量，各處理等養分量設計，以等氮量為基準，磷、鉀部分不足用普鈣、硫酸鉀補充。肥料全部以基肥施入，其他各項農藝措施與當地生產優質煙葉的措施一致。

1.4 測定項目及方法

1.4.1 土壤理化性質

參照鮑士旦檢測土壤指標的方法^［17］，其中測定pH值所用的是電位法；在全氮（TN）含量的檢測上采取半微量凱氏法；重鉻酸鉀容量法-稀釋熱法用來探究有機質（SOM）含量；在有效磷（AP）含量的測定方面，可采選0.05 mol/L HCl-0.025 mol/L（1/2H₂SO₄）法；在速效鉀（AK）含量的測定過程中，采取的是NH₄OAc浸提-火焰光度計法；選擇堿解擴散法測定堿解氮（AN）含量。

1.4.2 土壤酶活性測定

使用具有資質的第三方（蘇州格銳思生物有限公司）的試劑盒，對土壤中過氧化氫酶、磷酸酶和脲酶的活性做檢測。

1.4.3 病害調查

依據GB/T 23222—2008《煙草病蟲害分級及調查方法》對田間自然發病情況進行病害調查^［18］。

發病率=發病的煙株數調查的總煙株數×100%；

病情指數=∑（病級數×該級病株數）最高病級數×調查總株數×100。

1.4.4 土壤微生物測定

土壤細菌：用Illumina Hiseq測序方法判斷土壤微生物群落結構和多樣性，首先以序列分別是5′-CCTACGGGNGGCWGCAG和GGACTACHVGGGTATCTAAT-3′的341F和806R作引物，對16S rDNA中V3～V4區域實行擴增，對細菌群落結構和豐富度進行檢測，使用TruSeqDNA PCR-free Sample Preparation Kit試劑盒將提制的PCR生成物建立成文庫。其次，通過Qubit和Q-PCR的方式檢查文庫，檢查達標過后，使用NovaSeq 6000對DNA文庫進行測序工作。測序數據經過Qiime v1.9.1的質量把關，一些質量分數低、長度短的序列將被去除，就能夠獲得結尾的有效數據。最后，利用Uparse對當前樣本的全部有效數據進行聚類，通常默許作為OTU的要求是以97%的相似性序列聚類，緊接著用Qiime v1.9.1中的blast方法與Unit（v7.2）數據庫對OTU序列做物種注釋，這樣不同分類水平的微生物豐度數據將呈現出來^［19］。

土壤真菌：選擇MN NucleoSpin soil Kit（Machery-nagel，Dueren，德國）的方法，從土壤樣品中提取總DNA。以真菌在ITS1保守區為根據，使用引物ITS1F（CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA）和ITS2（GCTGCGTTCTTCATCGATGC）進行擴增。擴增體系50 μL：10×Buffer KOD 5 μL，2 mmol/L dNTPs5 μL，25 mmol/L MgSO₄ 3 μL，Index Primer（10 μmol/L）1 μL，Universal PCR Primer（10 μmol/L）1 μL，KOD酶1 μL，Template 1 μL（100 ng/μL），ddH₂O補足至50 μL。每個樣品進行重復擴增、合并，然后使用Cycle Pure Kit（Omega，Norcross，GA，USA）進行純化，形成測序文庫，使用Illumina HiSeq 2500技術進行測序分析。

1.4.5 數據處理

試驗數據用Microsoft Excel 和SPSS 26.0進行分析處理，用R語言進行圖形繪制。

2 結果與分析

2.1 有機肥替代氮肥對土壤理化性質的影響

由表1可知，不同處理土壤理化性質存在一定差異。相較于CK，T1、T2處理的pH值和有效磷含量均顯著升高（P<0.05）；T1處理堿解氮含量顯著高于CK，全氮和有機質的含量均高于CK和T2處理，但差異不顯著；CK、T1處理的速效鉀含量顯著低于T2處理。

2.2 有機肥替代氮肥對土壤酶活性的影響

由表2可知，有機肥替代氮肥對土壤的酶活性產生一定影響。T1處理的過氧化氫酶活性低于CK和T2處理，但處理間差異不顯著；T1、T2處理的磷酸酶活性顯著高于CK，T1、T2處理間差異不顯著；T1處理的脲酶活性顯著高于CK和T2處理。

2.3 有機肥替代氮肥對煙草青枯病發生的影響

由表3可知，T1和T2處理均降低了發病率和病情指數。與CK相比，T1處理發病率降低1.13百分點，病情指數降低1.46；T2處理發病率降低0.84百分點，病情指數降低1.04。說明有機肥替代氮肥既可降低青枯病的發病率，又能減小青枯病的病情指數。由表4可知，病情指數與土壤中全氮、有機質和速效鉀的含量以及過氧化氫酶的活性均呈正相關關系，其中與過氧化氫酶活性的相關性達顯著水平；病情指數與土壤pH值、有效磷含量、堿解氮含量、磷酸酶活性、脲酶活性呈負相關關系，其中與堿解氮含量的相關性達顯著水平。

2.4 有機肥替代氮肥對土壤微生物群落的影響

2.4.1 有機肥替代氮肥對土壤微生物α多樣性的影響

煙草根際土壤細菌和真菌對有機肥替代氮肥有不同的響應。由表5可知，細菌的Sob指數、Chao1指數和ACE指數均表現為T1處理＜CK＜T2處理，Shannon指數表現為CK＜T1處理＜T2處理，處理間差異均不顯著。真菌的Sob指數和Chao1指數均表現為CK＜T1處理＜T2處理，ACE指數表現為T1處理＜CK＜T2處理，Shannon指數表現為CK＜T2處理＜T1處理。其中，T2處理Sob指數顯著高于CK和T1處理，CK和T1處理差異不顯著，其余指數各處理間的差異均不顯著。

2.4.2 有機肥替代氮肥對土壤微生物β多樣性的影響

對不同有機肥替代氮肥處理的土壤微生物群落進行主坐標分析（PCoA），結果見圖1。細菌的PCoA結果（圖1-A）能夠解釋56.75%的變異，真菌的PCoA結果（圖1-B）能夠解釋57.50%的變異，不同處理均處在不同象限，距離間隔也較遠，且細菌P=0.005，真菌P=0.002，表明處理間具有顯著差異性（P＜0.05），有機肥替代氮肥會對土壤微生物群落的相似性造成影響。

2.4.3 有機肥替代氮肥對土壤微生物群落結構的影響

細菌門水平各群落結構的相對豐度詳見圖2-A，與T2處理相比，CK和T1處理酸桿菌門（Acidobacteria）的相對豐度分別下降了2.78、1.79百分點；相較于T1和T2處理，CK變形菌門（Proteobacteria）的相對豐度分別提高了1.80、2.51百分點；T1處理放線菌門（Actinobacteria）的相對豐度相比CK和T2處理分別提高了1.77、2.84百分點；CK綠彎菌門（Chloroflexi）的相對豐度相比T1和T2處理分別降低1.95、0.56百分點。真菌門水平各群落結構的相對豐度詳見圖2-B，T2處理子囊菌門（Ascomycota）相比CK和T1處理分別提高了7.54、12.33百分點，CK毛霉門（Mucoromycota）的相對豐度相比T1和T2處理分別提高了4.20、5.52百分點，T1處理擔子菌門（Basidiomycota）的相對豐度相比CK和T2處理分別提高了0.40、3.48百分點，CK處理被孢霉門（Mortierellomycota）的相對豐度相比T1和T2處理分別提高了2.57、5.35百分點。

細菌屬水平各群落結構的相對豐度詳見圖3-A，可以看出，T2處理苔蘚桿菌屬（Bryobacter）的相對豐度相較于CK和T1處理分別提高了1.44、1.10百分點；相較于CK，T1和T2處理朱氏桿菌屬（Chujaibacter）的相對豐度分別降低了0.22、1.70百

分點，鞘脂單胞菌屬（Sphingomonas）的相對豐度分別降低1.14、0.93百分點。真菌屬水平各群落結構的相對豐度見圖3-B，相較于CK，T1和T2處理傘狀霉屬（Umbelopsis）的相對豐度分別降低5.73、1.07百分點；孢球托霉屬（Gongronella）的相對豐度分別降低4.04、1.99百分點；T2處理原隱球菌屬（Saitozyma）的相對豐度相比于CK和T1處理分別提高1.36、1.27百分點。以上結果表明，有機肥替代氮肥會對土壤微生物門、屬水平的群落結構組成造成影響，且不同處理中不同屬類的占比不同。

2.4.4 有機肥替代氮肥土壤差異物種分析

利用LEfSe （LDA effect size）分析可以獲得有機肥替代氮肥土壤微生物群落的主要差異物種。分析細菌屬水平差異物種的結果如圖4（LDA＞3.0）所示。CK中Lutispora和居土桿菌屬（Humibacter）為特異物種，T1處理中擬無枝酸菌屬（Amycolatopsis）、彎桿菌屬（Flexivirga）、土地桿菌屬（Pedobacter）和羅河桿菌屬（Rhodanobacter）為特異物種，T2處理中ADurbBin063_1和赭黃嗜鹽囊菌屬（Haliangium）為特異物種。真菌屬水平的差異物種分析結果如圖5（LDA＞3.2）所示，CK中Boothiomyces為特異物種，T1處理中錐蓋傘屬（Conocybe）、綠僵菌屬（Metarhizium）、Sagenomella和小克銀漢霉屬（Cunninghamella）為特異物種，T2處理中Conlarium為特異物種。表明與常規施肥相比，有機肥替代氮肥會使土壤屬水平微生物群落中特異物種發生改變。

2.4.5 土壤優勢微生物群落結構與土壤理化因子之間的冗余分析和關聯分析

采用冗余分析（RDA）反映土壤微生物群落結構與土壤理化因子之間的關系。細菌屬水平群落的RDA結果如圖6-A所示，土壤理化因子中有效磷含量、pH值和堿解氮含量的箭頭較長，說明有效磷含量、pH值和堿解氮含量對屬水平優勢細菌相對豐度的影響較大。在屬水平上對土壤細菌群落中相對豐度排前20名的菌屬進行Pearson分析，結果如圖6-B所示，可以看出，苔蘚桿菌屬與pH值、有效磷含量呈顯著正相關關系；鞘脂單胞菌屬與堿解氮呈極顯著負相關關系（P<0.01）；Burkholderia-Caballeronia-Paraburkholderia與有機質含量、全氮含量呈顯著負相關關系，與有效磷含量呈顯著正相關關系；彎桿菌屬（Flexivirga）與速效鉀含量呈顯著負相關關系。真菌屬水平群落的RDA結果如圖6-C所示，土壤理化因子中堿解氮含量的箭頭最長，說明對屬水平優勢真菌相對豐度的影響最大，其次是速效鉀含量、pH值、有機質含量。在屬水平上對土壤真菌群落中相對豐度排前20名的菌屬進行Pearson分析，結果如圖6-D所示，被孢霉屬（Mortierella）與pH值呈顯著負相關關系，與有效磷含量呈極顯著負相關關系；金孢子菌屬（Chrysosporium）與堿解氮含量呈極顯著正相關關系；裂殼菌屬（Schizothecium）與有機質、全氮含量呈顯著負相關關系。

3 討論

土壤是煙株生長的養分來源之一，是煙株正常與否的基礎，與煙葉的產質量密切相關。對本試驗結果而言，與CK相比，T1、T2處理不僅提高了土壤的pH值、有效磷含量和堿解氮含量，還降低了青枯病的發病率和病情指數。其主要原因可能是有機肥中堿性物質的釋放，中和了土壤原有的酸性物質導致pH值升高，青枯菌吸收鐵元素的效率隨著土壤pH值的升高而下降，在對生存和繁衍不利的條件下，隨著時間的推移，病菌逐漸減少，導致煙草青枯病的發病率降低^［20］。此外，堿解氮含量較高，土壤中有益微生物數量和種類增多，優勢增大，對有害菌的排斥力加強，促進煙株長勢正常^［21］；也有研究表明，土壤pH值、有效磷含量和堿解氮含量升高，能減少病原菌，發病率也隨著降低^［22］。土壤酶在加快土壤物質循環、提升養分分解效率等方面都產生重要影響，與常規施肥相比，有機肥替代部分氮肥處理的土壤脲酶和磷酸酶活性顯著升高，這與楊茜等的研究結果^［23］基本一致；T2處理提高了土壤過氧化氫酶的活性，而T1處理的活性降低，這與汪林等的研究結果^［24］一致。

微生物與煙株相互作用，相互聯系，相互依存，微生物在煙株生長的過程中，扮演了改善土壤肥力和結構的角色，是影響煙株健康的一個重要因素；相反，煙株也能為微生物提供生存所需要的養分、空間。牛糞在發酵堆放后有微生物滋生，施入煙地里可以攜帶微生物進入土壤，生物碳表面具有很多小孔，獨特的構形為微生物生長提供了格外適應的環境，使其持續生存變得容易，充實了土壤細菌α多樣性^［25］。王亞麒等在貴州的長期定位施肥試驗中也發現，有機、無機肥料混合配施，土壤細Mf49eR+siZWLmOvbGuxdJovqFwJBTPlHJPPVkNhMOYs=菌多樣性和豐富度可被提高^［26］。本試驗結果表明，T1和T2處理對土壤微生物群落發揮作用，T1處理會降低細菌的物種數量和豐富度，T2處理提高細菌的物種數量和豐富度，但2個處理都增加了真菌的物種數量和豐富度，特別是T2處理的效果最為明顯，這和Luo等的研究結果^［27］基本一致。

有機肥被部分氮肥替代后，對土壤微生物群落結構的作用明顯。本研究結果表明，與對照組相比，試驗組微生物群落的相對豐度均有所改變。在門水平上的細菌群落中，T2處理使酸桿菌門的相對豐度升高，使變形菌門和放線菌門的相對豐度降低；T1處理使放線菌門增加了相對豐度，使變形菌門降低了相對豐度。酸桿菌門的變動有助于平衡土壤內部激素，促進植株生長，提升植物的抗病性和養分利用率，讓放線菌門改變相對豐度的原因可能是生物碳改變了土壤的團粒結構，變形菌門固氮以及提高氮肥的利用率是其主要的職能^［28-31］；在真菌群落中，T2處理使子囊菌門的相對豐度提高，使毛霉門的相對豐度降低；T1處理使擔子菌門的相對豐度提高。子囊菌門能加速土壤有機質分解，具有分解木質纖維素的特殊功能，因此子囊菌門的相對豐度升高，有利于植煙土壤外源有機質的礦化和養分釋放^［32］。在屬水平上，T2處理使細菌群落中苔蘚桿菌屬的相對豐度提高，降低了朱氏桿菌屬的相對豐度；苔蘚桿菌屬能促進土壤碳循環，在土壤速效磷促進煙草生長發育的過程中起著重要作用^［33-34］；T2處理增加了真菌群落中原隱球菌屬的相對豐度，T1處理降低了傘狀霉屬的相對豐度。通過對有機肥替代氮肥土壤進行特異物種分析可知，赭黃嗜鹽囊菌屬和Conlarium分別是生物碳基肥替代氮肥處理中細菌和真菌的特異物種，其中赭黃嗜鹽囊菌屬可能是植煙土壤中的益生菌，益生菌的出現讓土壤環境向好的方向發展^［35］。本試驗對土壤微生物群落結構與理化性質進行相關性分析，結果表明，土壤理化因子會對土壤微生物群落結構產生影響，pH值、有效磷含量和堿解氮含量會影響屬水平優勢細菌的相對豐度，這與王初亮等的研究結果^［36］基本一致。在屬水平上對土壤微生物相對豐度排前20名的菌屬進行Pearson分析表明，苔蘚桿菌屬與pH值及有效磷含量呈顯著正相關關系，鞘脂單胞菌屬與堿解氮含量呈極顯著負相關關系，被孢霉屬與pH值呈顯著負相關關系，與有效磷含量呈極顯著負相關關系，故推測pH值、有效磷含量和堿解氮含量可能是引起微生物群落變化的主要土壤理化因子，進一步影響煙草青枯病的發生。

4 結論

有機肥替代氮肥能減輕煙草青枯病的發生，且會影響土壤細菌、真菌群落結構和多樣性。生物碳基肥替代氮肥提升了酸桿菌門、子囊菌門和苔蘚桿菌屬的相對豐度，降低了變形菌門、毛霉門和朱氏桿菌屬的相對豐度；牛糞有機肥替代氮肥提高了放線菌門和擔子菌門的相對豐度，降低了傘狀霉屬的相對豐度。綜上，本試驗中生物碳基肥替代氮肥的實際綜合效果更好，可作為當地煙區肥料管理和青枯病防控的理論參考。

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