新型氮肥對玉米根際土壤固氮微生物群落的影響

摘要：為探究長期施用新型氮肥對玉米連作體系根際土壤固氮微生物（nifH基因）群落的影響，采集長期定位試驗（2014年始）玉米吐絲期根際土壤樣品，以不施氮肥（NO）為對照，分析同常規尿素（CU）相比，3種新型氮肥[控釋尿素（SU）、穩定性肥料（SF）、硫包衣尿素（SCU）]的施用對土壤固氮微生物群落的影響差異。結果表明：不施氮肥處理的固氮微生物nifH基因豐度高于施氮肥處理，不同氮肥處理中，穩定性肥料處理的固氮微生物nifH基因豐度（3.4x10 copies·g-1）顯著低于其他處理，pH（相對影響值為44.51％）和有機質（相對影響值為35.01％）是影響固氮微生物nifH基因豐度的主要因素。與不施氮肥相比，氮肥施用降低了固氮微生物nifH基因的豐富度及多樣性，與常規尿素處理相比，新型氮肥提高了nifH基因的豐富度指數但降低了多樣性指數。固氮微生物nifH基因屬水平主導物種為Desulfovibrio（相對豐度為14.11％-33.39％）、Stenotrophomonas（相對豐度為2.66％-17.72％）和Bradyrhizobium（相對豐度為2.68％-6.32％）。是否施氮對土壤固氮微生物群落結構的變化有顯著影響（P=0.001），但施用不同新型氮肥處理與常規尿素相比對群落結構變化無顯著影響（P=0.1）。研究表明，施用新型氮肥提高了固氮微生物nifH基因豐富度，改變了固氮微生物的群落結構。

關鍵詞：新型氮肥；玉米根際土壤；固氮微生物nifH基因；群落結構

中圖分類號：S513；S154.3 文獻標志碼：A 文章編號：1672-2043（2024）02-0360-08 doi：10.11654/jaes.2023-0251

東北黑土區是我國最重要的商品糧主產區，近年來國家供給側改革政策的提出雖然導致玉米的種植面積減少，但作為主要糧食作物的玉米仍大面積連年種植。種植結構單一、化肥過量施用與肥料利用率較低均會導致土壤肥力下降、有機質含量降低及土壤養分失衡。因此，優化施肥結構、調整施肥方式、提高肥料利用率，對于保護黑土資源和保障國家糧食安全具有重要作用。

研究發現，我國氮肥的當季利用率僅為30％-35％，這在造成資源大量浪費的同時降低了玉米的產量和品質。控釋氮肥能夠調控氮素釋放時間以滿足作物生育期內的養分需求；穩定性肥料是指在生產過程中加入硝化抑制劑或脲酶抑制劑或兩者同時加入，通過降低尿素在土壤中的水解速度來降低銨態氮的硝化和反硝化作用，最終達到肥料氮素緩慢釋放和減少氮素損失的一類肥料；硫包衣尿素（以硫磺為主要包膜材料）可在補充硫和氮素的同時緩釋養分。新型氮肥具有肥效長、釋放穩定、改善土壤質量等特點，新型氮肥的施用能夠減少肥料浪費和環境污染，提高氮肥利用效率。

新型氮肥在玉米中的施用效果研究較多，主要集中在作物產量、土壤物理化學性質、土壤酶活性、環境效應、土壤細菌及真菌群落結構的變化。在生物固氮的過程中，固氮菌能夠與氮氣結合，將不可吸收利用的氮氣轉化為銨態氮進而被植物吸收利用，因此對土壤氮循環起著至關重要的作用。而關于新型氮肥施用下土壤固氮微生物群落結構及多樣性的變化鮮有報道。研究表明，固氮菌群落的豐度、多樣性和組成是決定土壤固氮能力的關鍵生物學因素，固氮菌群落受到土壤中各種生物和非生物因素的影響，包括肥料、土壤養分、耕作制度等。根際是土壤與作物進行物質能量交換的重要場所，植物通過根系分泌物來影響土壤理化性質，其影響最先反映在根際土壤上，因此本研究在玉米連作體系下，以固氮微生物nifH基因作為固氮菌的指示基因，利用高通量測序技術，分析3種新型氮肥（控釋尿素、硫包衣尿素、穩定性肥料）對玉米根際土壤固氮細菌群落結構及多樣性的影響，并分析其與土壤養分之間的關系，以期為該地區高效施氮的推廣應用提供理論依據。

1材料與方法

1.1試驗地概況

長期定位試驗始于2014年，試驗設置在吉林省梨樹縣中國農業大學梨樹試驗站（43°16′43.6″N，124°26′ 9.5″E）。該地區屬溫帶半濕潤大陸性季風氣候，全年降水主要集中在6-8月，年平均氣溫為6.8℃，年均降水量為614 mm。供試土壤類型為薄層黑土，基本理化性質如下：pH 5.74、有機質含量為18.9 g·kg-1、堿解氮含量為87.5 mg·kg-1、速效磷含量為18.5 mg·kg-1、速效鉀含量為186.3 mg·kg-1。

1.2試驗設計

試驗設置5個處理：①不施氮肥（NO）；②常規尿素（CU）；③控釋尿素（SU）；④穩定性肥料（SF）；⑤硫包衣尿素（SCU）。其中常規尿素采用28-11-11復合肥（中化化肥控股有限公司），控釋尿素為樹脂包裹的高分子無機肥料（中國-阿拉伯化肥有限公司），穩定性肥料為同時添加脲酶和硝化抑制劑的肥料（中國-阿拉伯化肥有限公司），硫包衣控釋肥為硫磺包裹的無機肥料（上海漢楓集團），上述氮肥施用量均為224kg·hm-2（以N計）。所有處理磷、鉀肥料施用量完全相同（P2O5 88 kg·hm-2，K2O 88 kg·hm-2），磷肥為磷酸二銨（P2O5 46％，N 18％），鉀肥采用氯化鉀（K2O60％），所有肥料作為基肥在播前一次性施入。每個處理3次重復，共15個小區，完全隨機區組排列，小區面積為40 m2（寬3.6 m、長11.1 m）。試驗地為玉米連作，每年5月初播種，10月初收獲，供試玉米品種為良玉99，種植密度為65 000株·hm-2。

1.3土壤樣品采集及測定項目

土壤樣品采集于2021年7月玉米吐絲期，取樣器具經滅菌處理，采用抖根法收集根際土壤樣品。每個試驗小區均勻選取3個點，迅速去除可見動植物殘體及石塊等，將3個點的土壤樣本過2 mm孔徑無菌網篩后混合均勻并作為1個土壤樣品，取5-10 g土樣裝入無菌管中，帶回實驗室-80℃保存，用于微生物提取，剩余土壤樣品4℃冷藏保存，用于土壤基本理化性質的測定。土壤pH（土水比1：2.5）采用電位法測定；堿解氮采用堿解擴散法測定；速效鉀采用NH4OAc浸提、火焰光度計法測定；速效磷采用NaHCO3浸提-鉬銻抗比色、分光光度計法測定；有機質采用重鉻酸鉀外加熱法測定。

1.4土壤DNA提取及實時熒光定量PCR

微生物組DNA提取方法參照PowerSoil DNA Isolation Kit（MoBio Laboratories，Carlsbad，CA）[Omega Stool DNA Kit]試劑盒說明書。提取得到的DNA用1％瓊脂糖凝膠電泳和分光光度法進行DNA質量和濃度的檢測，質檢合格后進行PCR擴增，引物為5’-AAAGGYGGWATCGGYAARTCCACCAC-3’和5’-TTGTTSGCSGCRTACATSGCCATCAT-3’。采用絕對定量PCR檢測技術，檢測固氮微生物nifH基因數量。

1.5數據分析

采用Excel 2019軟件進行數據處理，SPSS 25軟件進行數據分析。土壤性質對nihH基因豐度的相對影響通過使用gbm包進行聚合增強樹分析（ABT）進行定量估計，其中500棵樹用于增強，5折交叉驗證估計誤差；基于R（4.2.2）中vegan包計算細菌群落Shannon和Chaol指數；根據分類學分析結果，可以得知不同樣本在各分類水平（如域、界、門、綱、目、科、屬、種、OTU等）上的物種組成情況，利用R（4.2.2）軟件制圖；使用RColorBrewer包基于Bray-Curtis距離計算并繪制非度量多維排列分析（Multidimensional scaling，NMDS）和組間差異分析（Analysis of similarities，ANOSIM）圖；同時利用置換多元方差分析（Permutational multivariate analysis of variance，PERMANOVA）評估氮肥施用和肥料類型對固氮微生物nifH基因多樣性（Alpha多樣性指數）和結構（OTU豐度）的影響，利用R（4.2.2）軟件完成。

2結果與分析

2.1不同氮肥施用對土壤性質的影響

不同氮肥施用對土壤化學性質的影響見表1。根際土壤樣本中，施氮肥處理較NO處理pH值降低了0.12-0.31個單位，其中SCU處理pH值最低，為5.37。施氮肥可提高土壤堿解氮含量，其中以SU處理最為顯著，為80.29 mg·kg-1。不同氮肥施用對土壤有機質、速效鉀及速效磷的影響不顯著（Pgt;0.05）。

2.2固氮微生物nifH基因豐度及土壤性狀對其的影響

由圖1a可知固氮微生物nifH基因的豐度為3.4x10-4.9x10 copies·g-1，除SF處理顯著降低外，其余施氮肥處理固氮微生物nifH基因豐度與NO處理無顯著差異。不同施氮肥處理中，SF處理的固氮微生物nifH基因豐度（3.4x10 copies·g-1）低于其他處理。土壤性質對基因豐度的相對影響由ABT模型確定（圖1b），其中pH和有機質是影響固氮微生物nifH基因豐度的主要因素，相對影響值分別為44.51％和35.01％。

2.3不同新型氮肥對nifH基因Alpha多樣性的影響

本文中的Alpha多樣性指數通過Chaol和Shannon指數進行分析，Chaol指數用來評估樣品中所含OTU的總數，其值越大nifH基因豐富度越高。與NO處理相比，氮肥施用降低了nifH基因豐富度，其中SF處理降低比例最大，降低了16.6％；不同氮肥施用處理中，新型氮肥處理的固氮微生物nifH基因豐富度高于CU處理。

Shannon指數用來估算固氮微生物nifH基因多樣性，其值越大，多樣性越高。通過分析發現，NO處理的固氮微生物nifH基因多樣性高于施氮處理；不同氮肥施用處理中，SF和SCU處理的nifH基因多樣性指數低于CU處理，但均未造成顯著差異。

2.4不同新型氮肥對固氮微生物群落Bate多樣性的影響

圖3為固氮微生物的NMDS分析，應力函數值（Stress=0.132）小于0.2，說明NMDS分析排序性良好，可準確反映樣本點的真實分布情況。NO處理與CU、SU、SF、SCU處理明顯分離，不同氮肥施用處理的空間分布較集中。ANOSIM分析發現，施氮肥處理與NO處理間存在顯著差異（P=0.001），但施用不同新型氮肥處理與CU處理間不存在顯著差異（P=0.1）。

由表2可知，施氮顯著影響（P=0.002）固氮微生物群落結構，氮肥類型顯著影響（P=0.006）nifH基因多樣性。

2.5不同新型氮肥對土壤固氮微生物群落組成的影響

由圖4可知固氮微生物nifH基因屬水平注釋結果中共有10個菌屬，其中Desulfovibrio（脫硫弧菌，豐度為14.11％-33.40％）、Stenotrophomonas（寡養單胞菌，豐度為2.66％-17.72％）和Bradyrhizobium（慢生根瘤菌，豐度為2.68％-6.32％）為主要優勢菌屬。除Others外，Desulfovibrio在NO和SU處理中注釋結果豐度最高，占比分別為27.34％和33.40％；而CU和SF處理中固氮微生物nifH基因注釋結果豐度最高的屬為Stenotrophomonas，占比分別為14.92％和17.72％。與NO相比，SU、SF、SCU處理Stenotrophomonas的相對豐度分別顯著提高了44.00％、48.65％和100.00％，SU、SCU處理Bradyrhizobium的相對豐度分別降低了31.29％和34.30％，而SF處理使Bradyrhizobium的相對豐度提高了42.92％。與CU處理相比，SU、SF、SCU處理Stenotrophomonas的相對豐度分別降低了47.51％、15.81％、22.80％，Bradyrhizobium的相對豐度分別提高了13.66％、136.66％、8.53％。

3討論

土壤固氮菌群落對氮肥添加的響應對土壤氮供應的可持續性非常重要，關于固氮微生物的研究已經有很多，其中有研究表明不同肥料可使固氮微生物多樣性及結構發生改變。本研究中（圖1a），施氮處理的固氮微生物nifH基因拷貝數低于不施氮肥處理，這與李穎在玉米／大豆間作體系試驗中得到的隨著施氮量的增加固氮微生物nifH基因拷貝數逐漸下降的研究結果一致，且本研究結果并未表現出顯著差異，也與多數研究中氮肥的添加對固氮微生物nifH基因拷貝數的變化無顯著影響的結果一致。ABT分析結果（圖1b）表明，土壤pH是驅動土壤固氮菌生長的主要因素，作為外源養分，氮肥在調節土壤pH方面發揮了重要作用，氮肥對土壤pH的調節間接影響了固氮微生物nifH基因豐度。本研究中，與不施氮相比，氮肥施用降低了固氮微生物nifH基因的Alpha多樣性指數，這與一項對東北黑土區玉米根際微生物群落的研究結果一致，微生物群落對氮的輸入具有抗性，隨著氮輸入的增加，Alpha多樣性顯著降低。新型氮肥相比常規尿素施用增加了固氮微生物nifH基因豐富度但降低了多樣性，可能原因是新型氮肥能夠延緩氮素釋放，使整個生育期內的固氮微生物大量富集。

對固氮微生物nifH基因屬水平注釋結果分析發現，Stenotrophomonas和Bradyrhizobium為主要的優勢菌屬，劉爽等的研究也證明在固氮微生物nifH相關分析中，Stenotrophomonas和Bradyrhizobium屬的相對豐度較高。本研究發現與不施氮肥和施用常規尿素相比，施用新型氮肥處理顯著提高了Stenotrophomonas菌屬的相對豐度，包海花的研究發現Stenotroph-omonas菌屬與農田氮轉化相關，是一種能降解硝酸鹽、降低總氮含量的菌，正由于這種特性，導致它在施用新型氮肥處理中具有較高的含量，同時王保莉等研究發現，在以硝酸鈉為氮肥的處理中Stenotrophomonas為優勢菌屬，說明施用不同類型的氮肥會造成Stenotrophomonas菌屬相對豐度的改變。而所有處理中，只有SF處理提高了Bradyrhizobium的相對豐度，其余處理均為降低趨勢，Bradyrhizobium為慢生型根瘤菌，施用不同類型的氮肥會導致Bradyrhizobium相對豐度的變化，而Mark等發現Bradyrhizobium可以促進作物對氮的吸收，增加作物產量，這與本研究在分析作物產量部分的研究結果一致，即施穩定性肥料處理的作物產量最高。

施氮與不施氮處理在NMDS分析中明顯分離，但3種新型氮肥與常規尿素相比，固氮微生物群落結構無明顯區別，ANOSIM結果與其相同。為了進一步驗證施用氮肥和氮肥類型對固氮微生物nifH基因多樣性及結構的影響，本研究進行了PERMANOVA分析，結果與ANOSIM分析一致，氮肥類型對固氮微生物nifH基因多樣性的影響更大，而群落結構主要受施氮影響。這與Chen等在東北黑土上一項長期定位試驗結果一致，即不同含量氮肥的施用顯著影響固氮菌的群落結構。不同類型新型氮肥對固氮微生物nifH基因結構無顯著影響，可能原因是玉米連年種植均施用氮肥，在長期定位的8年間，根際效應形成了穩定的微生物群落，因此新型氮肥類型不會造成當季的顯著差異。

4結論

長期定位田間試驗結果顯示，新型氮肥通過影響土壤pH及有機質影響固氮微生物nifH基因拷貝數。與常規尿素處理相比，新型氮肥的施用降低了固氮微生物nifH基因拷貝數，其中以施穩定性肥料處理降低效果最為顯著；新型氮肥施用顯著影響固氮微生物nifH基因的Alpha多樣性指數，但對固氮微生物nifH基因群落結構的影響并不顯著。