鵝掌楸基因組部分SNP標記在種源評價中的應用

摘要 以6個鵝掌楸（Liriodendron chinense）種源和3個北美鵝掌楸（Liriodendron tulipifera）種源共計23個個體作為研究群體，選取11對真實SNP位點，對這253個SNP標記的PCR產物進行正反向Sanger測序。結果表明：在11個真實SNP位點中，8個SNP位點在中國鵝掌楸和北美鵝掌楸間呈現出多態性，其中3個位點是檢測鵝掌楸和北美鵝掌楸種間分化的潛在標記。11個SNP標記在北美鵝掌楸種內都沒有多態性。lm_ll_10205、lm_ll_10836、lm_ll_3853和lm_ll_8246 4個SNP位點在我國東部的湖南瀏陽、浙江松陽和江西廬山3個種源間存在多態性，僅有lm_ll_10205位點在我國西部種源間存在多態性。前期開發的SNP標記可以用于鵝掌楸種源遺傳多樣性的研究。研究種源間SNP位點的變異特征為揭示鵝掌楸的起源、進化以及遺傳變異多樣性提供了科學數據。

關鍵詞 北美鵝掌楸；鵝掌楸；SNP標記；SNP位點；種源

中圖分類號 S792.21 文獻標識碼 A 文章編號 0517-6611（2024）21-0093-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2024.21.019

開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

Application of SNP Markers of Liriodendron Genome in Provenance Evaluation

LU Ye， SHI Ji-sen

（Key Laboratory of Forest Genetics & Biotechnology of Ministry of Education of China， Co-Innovation Center for Sustainable Forestry in Southern China， Nanjing Forestry University， Nanjing， Jiangsu 210037）

Abstract In this study， a total of 23 individuals were selected from 9 provenances with representative geographical distribution （including six Liriodendron chinense and three Liriodendron tulipifera provenances） as the study population. After PCR with 11 pairs of primers from real SNPs， Sanger sequencing was performed on the 253 SNP-labeled PCR products. The results showed that among the 11 real SNP loci， 8 SNP loci showed polymorphism between Chinese and North American provenances， and 3 of them were potential markers for detecting the interspecific differentiation of Chinese and North American provenances. None of the 11 SNP markers were polymorphic within the North American Liriodendron provenances. Four SNP loci （lm_ll_10205， lm_ll_10836， lm_ll_3853 and lm_ll_8246） showed polymorphism in Liuyang （Hunan）， Songyang （Zhejiang） and Lushan （Jiangxi） species in eastern China， while only lm_ll_10205 showed polymorphism in western species of China. The results showed that the SNP markers developed in earlier studies could be used to study genetic diversity of Liriodendron provenance. The variation characteristics of SNP sites between provenances provide useful scientific data for revealing the origin， evolution and diversity of genetic variation of Liriodendron.

Key words Liriodendron tulipifera;Liriodendron chinense;SNP makers;SNPs loci;Provenance

基金項目 江蘇省農業科技自主創新資金項目“耐鹽型雜交鵝掌楸新品種培育及推廣示范”（SCX（23）3628）。

作者簡介 陸葉（1982— ），女，江蘇鎮江人，實驗師，從事林木遺傳育種研究。*通信作者，教授，博士生導師，從事林木遺傳育種研究。

收稿日期 2023-12-29

木蘭科（Magnoliaceae）鵝掌楸屬（Liriodendron）現僅存2個種，即鵝掌楸［Liriodendron chinense（Hemsl.）Sarg.］和北美鵝掌楸（Liriodendron tulipifera Linn.），是典型的孑遺植物［1］。新生代第三紀，該屬物種廣泛分布于歐亞大陸和北美洲。第四紀冰川之后，鵝掌楸分布于我國長江流域和越南北部，分化為東部和西部兩個支系，北美鵝掌楸自然分布于北美洲東南部，遺傳上位于我國東西部鵝掌楸類群之間，更接近東部類群［2］。由于結實率低，加上人為對其適生環境的干擾，鵝掌楸在我國已被列為二類瀕危保護物種［3］。鵝掌楸屬物種不僅在林業產業方面具有重要的應用前景，而且也是林木遺傳多樣性、群體結構、系統進化及雜交育種等領域理論研究的理想材料［4-5］。

RAD-seq（Restriction-site associated DNA sequencing）技術是利用限制性內切酶對基因組DNA進行酶切，然后進行高通量測序［6］，可作為一種有效的方法，進行高通量的SNP標記的開發［7］。目前已有很多研究基于RAD-seq技術對物種的遺傳多樣性和遺傳結構進行分析。劉學鋒等［8］對168份藍花楹種質材料進行RAD-seq測序，獲得45 552個高質量的SNP，分析表明，來自川渝地區的藍楹花具有相對較近的親緣關系。潘文婷等［9］用RAD-seq鑒定了北美和中國種源的鵝掌楸共4 454個SNP標記，對鵝掌楸的遺傳多樣性和遺傳結構進行分析，認為鵝掌楸屬遺傳結構的形成與其地理隔離和片段化分布有關。

前期研究以北美鵝掌楸和鵝掌楸的雜交F1代和2個親本為材料，利用RAD-seq技術已開發的大量可靠的SNP標記［10］，筆者從中選取了11對真實SNP位點，以6個鵝掌楸種源和3個北美鵝掌楸種源共計23個個體為研究材料，分析SNP位點在不同種源間的變異特征，旨在為研究鵝掌楸物種分子水平上的變異提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

種源材料均來自國家林業和草原局世行貸款項目管理中心于1990年推廣支持體系中的“闊葉樹中心組”的科研項目建立的實驗林。在鵝掌楸全分布區內抽樣收集了15個地理種源的鵝掌楸種子，同時分別從美國密蘇里（Missouri）、路易斯安那（Louisiana）、北卡羅來納（North Carolina，北卡）、南卡羅來納（South Carolina，南卡）、佐治亞（Georgia）引進該地區北美鵝掌楸種源的種子，翌年分別在四川邛崍、湖北京山、湖南桃源、江西分宜和福建邵武進行了地理種源研究試驗。2014年4月從定植于湖北省京山縣虎爪山林場的24年生的種源材料中選取了9個種源的材料，每個種源23株，共計23株作為后續試驗材料。取樣具體如下：湖南瀏陽的3株鵝掌楸（1-10、1-13、1-23），浙江松陽的2株鵝掌楸（4-1、4-24），江西廬山的3株鵝掌楸（8-3、8-17、8-24），四川敘永的3株鵝掌楸（9-5、9-19、9-22），貴州松桃的3株鵝掌楸（11-12、11-15、11-22），云南勐臘的2株鵝掌楸（12-5、12-22），北卡羅來納的3株北美鵝掌楸（15-19、15-21、15-23），南卡羅來納的2株北美鵝掌楸（18-16、18-21），密蘇里的2株北美鵝掌楸（19-16、19-21）。其中，來自湖南瀏陽、浙江松陽和江西廬山的種源為我國東南部種源，來自四川敘永、貴州松桃和云南勐臘的種源為我國西南部種源，來自北卡羅來納、南卡羅來納和密蘇里的種源為北美種源。

1.2 試驗方法

1.2.1 基因組DNA的提取。

新鮮葉片用液氮冷凍，-80 ℃保存。采用天根試劑盒（DNAsecure Plant Kit，離心柱型）提取DNA，保存在-20 ℃冰箱中。

1.2.2 引物合成。

根據前期研究開發的鵝掌楸27個真實SNP位點［10］，選取其中的11個SNP位點，利用鵝掌楸和北美鵝掌楸不同種源個體，對SNP位點在種群間的多態性進行研究，引物序列見表1。

1.2.3 PCR擴增體系。

用11對引物和KOD FX（Toyobo，KFX 101）DNA聚合酶對23個DNA樣本進行PCR，將具有特異性條帶的PCR產物進行Sanger測序。測序由上海英駿生物技術有限公司完成。用BioXM2.6軟件比對測序結果。

PCR反應體系（50 μL）為：2×PCR Buffer for KOD FX 25 μL，2 mmol/L dNTPs 10 μL，10 μmol/L Primer 1.5 μL，KOD FX DNA polymerase 1 μL，DNA 5 μL，ddH2O 6 μL。PCR 反應程序如下：94 ℃預變性 2 min；98 ℃變性10 s，Tm 5 ℃退火 30 s，68 ℃延伸 1 min，36 個循環；最后4 ℃保溫。

2 結果與分析

2.1 DNA質量檢測

對提取的DNA進行瓊脂糖電泳檢測，如圖1所示，DNA條帶清晰完整，無明顯彌散條帶，表明DNA質量好且純度較高。用Nanodrop檢測DNA樣品的OD260/OD280值，均在1.8～2.0。高質量的DNA達到后續試驗要求。

2.2 PCR產物檢測

PCR產物經過瓊脂糖凝膠電泳檢測，將符合預期的目的條帶切膠回收、純化后進行Sanger測序驗證。圖2為部分引物在不同個體間的PCR擴增結果。

2.3 SNP位點檢測

對總計253個包含SNP標記的PCR產物進行正、反向測序，因49個樣品未能測序成功，最后獲得204個測序結果，結果見表2。

在11個真實的SNP位點中，nn_np_7542、lm_ll_11011、nn_np_5667、nn_np_4694、lm_ll_10205、lm_ll_10836、lm_ll_3853和lm_ll_8246 8個SNP位點在鵝掌楸和北美鵝掌楸間呈現出多態性，其中lm_ll_7542、lm_ll_5667、lm_ll_4694 3個位點雖在鵝掌楸種內和北美鵝掌楸種內未檢測到多態性，但是在鵝掌楸和北美鵝掌楸種間呈現出多態性，是檢測鵝掌楸和北

美鵝掌楸種間分化的潛在標記。nn_np_9274、nn_np_9109和nn_np_9757 3個SNP位點無論是在鵝掌楸種內，還是北美鵝掌楸種內，甚至鵝掌楸和北美鵝掌楸種間都未檢測出多態性。 11個SNP位點，在北美鵝掌楸種內皆為單一且相同堿基，因此11個SNP位點在北美鵝掌楸種內無多態性。

從我國種源內部來看，除了lm_ll_11011 SNP位點缺少測序結果，lm_ll_10205、lm_ll_10836、lm_ll_3853和lm_ll_8246 4個SNP位點在我國東部的湖南瀏陽、浙江松陽和江西廬山3個種源間存在多態性，其中lm_ll_10205位點在浙江松陽、江西廬山、四川敘永、貴州松桃、云南勐臘間呈現多態性，并且其在四川敘永種內也存在多樣性。lm_ll_10836、lm_ll_3853和lm_ll_8246位點在我國西部的四川敘永、貴州松桃和云南勐臘3個種源間沒有多態性，其基因型分別為T、G、A，但都與東部的江西廬山種源呈現多態性。lm_ll_10836位點在浙江松陽的基因型也是T，與西部種源沒有多態性，但在湖南瀏陽種源中出現了基因型C。lm_ll_3853和lm_ll_8246位點，在東部種源湖南瀏陽的基因型和西部種源相同，沒有多態性。

3 討論

SNP即單核苷酸多態性（single nucleotide polymorphism）是繼RFLP、SSR標記后的第3代分子標記，普遍存在于生物基因組中［11］。由于SNP遺傳穩定性高，位點豐富且分布廣泛，富有代表性、二態性和等位基因性，檢測快速，易于實現自動化分析等優點，因此，SNP標記已經在遺傳圖譜、基因遺傳、分子進化、功能基因組研究等領域得到了廣泛運用［12］。

為了研究SNP位點在不同種源之間變異情況，該研究從前期開發的SNP位點中選取11個真實的SNP位點，采集6個我國種源和3個北美種源，共23個個體作為研究群體，結果表明，SNP位點在鵝掌楸不同種源間呈現不同的變異。11個SNP標記在北美鵝掌楸種內都沒有多態性。lm_ll_7542、lm_ll_5667、lm_ll_4694在鵝掌楸和北美鵝掌楸中間呈現出多態性，可以作為檢測鵝掌楸和北美鵝掌楸種間分化的潛在標記。11個SNP位點在6個鵝掌楸種源和3個北美鵝掌楸種源間的多態性高于6個鵝掌楸種源內的多態性，這可能與鵝掌楸物種的進化關系有關。鵝掌楸在經歷了第四紀冰川時期后，僅存在于我國漢水流域以南地區，以及北美洲的美國東部沿海至加拿大的安大略省五大湖區的多倫多地區。北美鵝掌楸種源在進化歷程中SNP位點未見較大的突變發生；而在鵝掌楸種源中，我國東南部種源相比于西南部種源發生了一定比例的堿基突變，在SNP位點處堿基種類較多。由此可見，前期開發出來的SNP標記可以用于鵝掌楸的起源和遺傳多樣性研究。在后續的研究中可增加種源的個體數和SNP標記數量，確保測序準確度的同時，為鵝掌楸種源變異的研究提供科學依據。

參考文獻

［1］ 王章榮.鵝掌楸屬雜交育種成就與育種策略［J］.林業科技開發，2008（5）：1-4.

［2］ CHEN J H，HAO Z D，GUANG X M，et al.Liriodendron genome sheds light on angiosperm phylogeny and species-pair differentiation［J］.Nature plants，2019，5（1）：18-25.

［3］ 季孔庶，王章榮.鵝掌楸屬植物研究進展及其繁育策略［J］.世界林業研究，2001，14（1）：8-14.

［4］ 羅西，郭秋菊，姚蘭，等.瀕危植物鵝掌楸的天然種群結構特征［J］.中南林業科技大學學報，2021，41（7）：115-123.

［5］ 祝園青，白天道，王曉波，等.馬褂木母樹林與不同來源無性系的遺傳多樣性比較分析［J］.江西農業大學學報，2021，43（3）：630-639.

［6］ MILLER M R，DUNHAM J P，AMORES A，et al.Rapid and cost-effective polymorphism identification and genotyping using restriction site associated DNA（RAD）markers［J］.Genome research，2007，17（2）：240-248.

［7］ RODRGUEZ-EZPELETA N，BRADBURY I R，MENDIBIL I，et al.Population structure of Atlantic mackerel inferred from RAD-seq-derived SNP markers：Effects of sequence clustering parameters and hierarchical SNP selection［J］.Molecular ecology resources，2016，16（4）：991-1001.

［8］ 劉學鋒，李小梅，張國武，等.基于RAD高通量測序的藍花楹群體遺傳分析［J］.熱帶亞熱帶植物學報，2022，30（5）：613-622.

［9］ 潘文婷，孫建軍，原勤勤，等.RAD-seq技術研究鵝掌楸屬種源遺傳多樣性和遺傳結構［J］.林業科學，2022，58（4）：74-81.

［10］ 陸葉，龍曉飛，王鵬凱，等.基于RAD-seq技術的鵝掌楸基因組SNP標記開發［J］.南京林業大學學報（自然科學版），2019，43（4）：1-7.

［11］ DURSTEWITZ G，POLLEY A，PLIESKE J，et al.SNP discovery by amplicon sequencing and multiplex SNP genotyping in the allopolyploid species Brassica napus［J］.Genome，2010，53（11）：948-956.

［12］ 王富強，樊秀彩，張穎，等.SNP分子標記在作物品種鑒定中的應用和展望［J］.植物遺傳資源學報，2020，21（5）：1308-1320.