QuEChERS-高效液相色譜串聯質譜法測定豬肉中氟苯尼考殘留量

摘 要：目的：建立QuEChERS凈化結合高效液相色譜串聯質譜法測定豬肉中氟苯尼考殘留量的分析方法。方法：樣品經搗碎均質化后用乙腈提取，提取液經QuEChERS凈化，使用C18柱分離，以乙腈和超純水為流動相進行洗脫，采用全掃描、多反應監測模式檢測，內標法定量。結果：在0～50 μg·L-1濃度范圍內氟苯尼考具有良好的線性關系，相關系數R2≥0.999，定量限為0.02 μg·kg-1，檢出限為0.01 μg·kg-1；在10 μg·kg-1、20 μg·kg-1、50 μg·kg-1 3個添加濃度水平下，加標回收率為98.2%～108.5%，RSD為3.24%～5.75%。結論：該方法前處理操作簡單，準確度和靈敏度高，滿足豬肉中氟苯尼考殘留量的檢測要求。

關鍵詞：氟苯尼考；QuEChERS；高效液相色譜串聯質譜法；豬肉

Determination of Florfenicol Residues in Pork by QuEChERS-HPLC-MS/MS

LUO Jiaer， OU Jialing

（Guangdong Huizhou Quality and Measuring Supervision Testing Institute， Huizhou 516000， China）

Abstract： Objective： To establish a method for the determination of florfenicol residue in pork by QuEChERS cleanup combined with high performance liquid chromatography tandem mass spectrometry. Method： The sample was crushed and homogenized and then extracted with acetonitrile. The extract was cleaned up by QuEChERS and separated by C18 column. Acetonitrile and ultrapure water were used as mobile phases for elution. Full scan and multiple reaction monitoring mode were used for detection and internal standard method for quantification. Result： Florfenicol had a good linear relationship in the concentration range of 0～50 μg·L-1， with correlation coefficient R2≥0.999， limit of quantification of 0.02 μg·kg-1， and limit of detection of 0.01 μg·kg-1. At the three spiked concentration levels of 10 μg·kg-1， 20 μg·kg-1， and 50 μg·kg-1， the recoveries were 98.2%～108.5%， and the RSD were 3.24%～5.75%. Conclusion： This method has simple pretreatment operation， high accuracy and sensitivity， and meets the requirements for the detection of florfenicol residues in pork.

Keywords： florfenicol; QuEChERS; high performance liquid chromatography tandem mass spectrometry; pork

氟苯尼考別名氟甲砜霉素，是第三代氯霉素抗生素產品，分子式為C12H14Cl2FNO4S，為白色或類白色結晶性粉末。氟苯尼考具有抗菌譜廣、高效、價格低等特點，對巴氏桿菌、大腸桿菌等都有較強的抗菌作用。氟苯尼考適用于治療對氟喹諾類等抗菌藥物有耐藥性的細菌感染，被廣泛應用于豬傳染性胸膜肺炎、豬肺疫等疾病的治療。然而，氟苯尼考在體內分布廣、半衰期長，且具有胚胎毒性和耐藥性，用于動物疾病防治時使用不當可能導致藥物殘留，最終危害人類健康[1]。

氟苯尼考殘留量的常用檢測方法包括酶聯免疫法、液相色譜法、氣相色譜串聯質譜法及液相色譜串聯質譜法。相比較而言，液相色譜-串聯質譜聯用法具有靈敏度高、選擇性好、定性定量準確、無須衍生化等優點，成為檢測氟苯尼考的首選方法[2-4]。在前處理環節，常用凈化方式有固相萃取凈化法、分子印跡凈化法等，該類凈化方式存在試劑消耗量大、耗時長、操作復雜、損失大等問題[5]。與常用凈化方式相比，QuEChERS具有操作簡單快速、安全可靠、能有效去除脂肪、有機酸等雜質的優點[6-9]。本文通過優化前處理條件，建立了一種靈敏度高、高效、成本低、回收率好的QuEChERS結合高效液相色譜-串聯質譜法檢測豬肉中氟苯尼考殘留量的方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

豬肉，市售；氟苯尼考標準品（CAS：73231-34-2，99.7%）壇墨質檢；氯霉素-D5（CAS：202480-68-0，100.9 μg·mL-1），BePure；甲醇、乙腈（色譜純），默克；一級水。

1.2 儀器與設備

API 4000超高效液相色譜-質譜聯用儀，AB SCIEX；ZORBAX Extend-C18柱，安捷倫；萬分之一天平，塞多利斯科學儀器（北京）有限公司；H1750R冷凍離心機，湖南湘儀實驗儀器開發有限公司；DC-24型氮吹儀，上海安譜科學設備有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 標準溶液的配制

標準儲備液：準確稱取氟苯尼考標準品0.010 0 g，置于10 mL容量瓶，用甲醇溶解并稀釋至刻度，配制成氟苯尼考標準儲備液，濃度為1 000 μg·mL-1，置于-18 ℃保存。臨用前用甲醇稀釋為100 μg·L-1的標準中間液。氯霉素-D5內標儲備溶液：準確吸取氯霉素-D5內標溶液0.1 mL，置于10 mL容量瓶，以甲醇定容后搖勻，配制成濃度為1 μg·mL-1內標標準儲備溶液，置于-18 ℃保存。系列標準工作溶液：量取標準中間液和氯霉素-D5內標儲備溶液，用10%乙腈稀釋，配制成氟苯尼考濃度為0 μg·L-1、1 μg·L-1、2 μg·L-1、10 μg·L-1、20 μg·L-1和50 μg·L-1，氯霉素-D5濃度為10 μg·L-1的系列標準溶液。

1.3.2 樣品處理

樣品制備：稱取約 600 g市售豬肉樣品，搗碎混勻后裝入潔凈容器中。

樣品提?。簻蚀_稱取制備好的豬肉樣品5 g（±0.01 g），置于50 mL離心管中，同時加入10 mL乙腈和10 μL內標儲備液，加入緩沖鹽包后渦旋振蕩10 min，再在6 000 r·min-1轉速下離心5 min，得到上清液。

凈化和濃縮：轉移上述上清液至凈化管中，渦旋混勻10 min，在13 000 r·min-1轉速下離心5 min，取5 mL上清液置于10 mL離心管中，在40 ℃下，氮氣吹至近干。加入1.0 mL 10%乙腈水溶液復溶，混勻過0.22 μm濾膜后，待檢測。

空白基質液：按上述方法處理后經檢定為陰性的樣液，為空白基質液。

1.3.3 測定條件

（1）色譜條件。色譜柱：ZORBAX Extend-C18柱（4.6 mm×150 mm，5 μm）；流動相：A為超純水，B為乙腈；流速：0.6 mL·min-1；進樣量：5 μL；柱溫：40 ℃；洗脫方式：等梯度洗脫（35%A，65%B）。

（2）質譜條件。電噴霧離子源負離子（ESI-）；離子源溫度：500 ℃；掃描方式：負離子掃描；檢測方式：多反應監測；離子化電壓：-4.5 kV；噴霧氣：50 psi；碰撞氣能量：6 V。

2 結果與分析

2.1 實驗條件優化

2.1.1 樣品提取劑優化

選擇乙腈、乙酸乙酯、3%氨化乙腈、3%氨化乙酸乙酯等4種提取劑對樣品中氟苯尼考進行提取，回收率結果見表1。使用乙腈為樣品提取劑時，回收率較高，滿足實驗需求。考慮氨水及乙酸乙酯具有揮發性和強刺激性，本實驗采用10%乙腈作為豬肉樣品的提取劑。

2.1.2 凈化方式優化

分別采用QuEChERS與MCX柱對樣品進行凈化處理。結果顯示，QuEChERS凈化，氟苯尼考的平均回收率為99.7%；MCX柱凈化，氟苯尼考的平均回收率為92.6%，QuEChERS凈化的回收率更高?？紤]MCX柱需要活化、洗脫，步驟煩瑣，使用的有機溶劑種類多，洗脫過程中人為操作難度較大、回收率不穩定、效率較低，本實驗采用QuEChERS法凈化樣品。

2.1.3 流動相的優化

在流動相A為10 mmol·L-1甲酸銨溶液、超純水的情況下，取氟苯尼考系列標準工作液進行檢測。結果顯示，流動相A為超純水可提高離子化效率和改善峰形，且氟苯尼考的響應值更高。

2.1.4 質譜條件優化

在多反應監測模式下，對碰撞電壓、碰撞能量進行優化；同時，以全掃描方式對濃度為

0.1 mg·L-1的氟苯尼考標準溶液進行掃描檢測，以確定定性離子對和定量離子對，最終確定質譜條件見表2。

2.2 方法驗證

2.2.1 專屬性

分別測定空白基質液（陰性樣品溶液）、

10 μg·kg-1標準溶液、陽性樣品溶液，記錄色譜圖，見圖1。可見，在測定條件下，氟苯尼考響應強度好，未受樣品基質及溶劑的干擾。

2.2.2 線性范圍、檢出限與定量限

測定1.3.1配制的系列標準工作溶液，以濃度為橫坐標、峰面積為縱坐標繪制標準曲線；線性方程為Y=0.131X+0.076 1，相關系數R2=0.999 5，表明線性關系良好。以3倍信噪比計算檢出限為

0.01 μg·kg-1、10倍信噪比計算定量限為0.02 μg·kg-1，方法檢出限與定量限較低，滿足測定要求。

2.2.3 加標回收率

對陰性樣品添加適量標準中間液，使加標濃度為0 μg·L-1、20 μg·L-1、50 μg·L-1，經前處理后測定。如表3所示，加標平均回收率為98.2%～108.5%，RSD為3.24%～5.75%，可見方法準確可靠。

2.3 樣品檢測

取市售的20份豬肉樣品，經樣品前處理后測定，對其中5份加標（加標量10 μg·L-1）進行質量把控。5份加標樣品測定值為（9.79±0.01）μg·kg-1，其余15份樣品均未檢出，檢測結果穩定可靠。

3 結論

本研究通過優化實驗條件，建立了QuEChERS凈化結合高效液相色譜串聯質譜法檢測豬肉中氟苯尼考殘留量的分析方法。該方法測定干擾小、準確度好、靈敏度高，適用于豬肉中氟苯尼考的測定。

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