超高效液相色譜-質譜聯用法測定豬肉中4種喹諾酮類藥物殘留

摘 要：建立超高效液相色譜-質譜聯用法測定豬肉中恩諾沙星、環丙沙星、氧氟沙星、沙拉沙星4種喹諾酮類藥物殘留的分析方法。試樣經EDTA-Mcllvaine緩沖溶液提取，用HLB固相萃取柱凈化，氮吹濃縮后用1 mL甲酸水溶液（0.1%）復溶，上機測定。結果表明，4種喹諾酮類藥物殘留組分在2.5～100.0 μg·L-1線性關系良好，方法檢出限為1.0～2.5 μg·kg-1，定量限為3.0～8.0 μg·kg-1，加標回收率在90.0%～109.2%，相對標準偏差（Relative Standard Deviation，RSD）為1.01%～5.74%，適用于豬肉中4種喹諾酮類藥物殘留的檢測。

關鍵詞：超高效液相色譜-質譜聯用法；豬肉；喹諾酮

Determination of Four Quinolone Residues in Pork by Ultra-High Performance Liquid Chromatography-Mass Spectrometry

CHEN Meina

（Shenzhen Academy of Metrology amp; Quality Inspection， Shenzhen 518000， China）

Abstract： Establish an analytical method for the determination of residues of four quinolone drugs， including enrofloxacin， ciprofloxacin， ofloxacin， and sarafloxacin， in pork using ultra-high performance liquid chromatography-mass spectrometry. The sample was extracted with EDTA Mcllvaine buffer solution， purified with HLB solid-phase extraction column， concentrated with nitrogen blowing， and then dissolved in 1 mL formic acid aqueous solution （0.1%） for measurement on the machine. The results showed that there was a good linear relationship between the residual components of the four quinolone drugs in the range of 2.5～100.0 μg·L-1. The detection limit of the method was 1.0～2.5 μg·kg-1， and the quantification limit was 3.0～8.0 μg·kg-1. The recovery rate was in the range of 90.0%～109.2%， and the relative standard deviation （RSD） was 1.01%～5.74%. It is suitable for the detection of four quinolone drug residues in pork.

Keywords： ultra high performance liquid chromatography-mass spectrometry; pork; quinolone

喹諾酮類藥物是由人工合成的一類人畜通用的抗菌藥物，其憑借高效低毒、抗菌譜廣、無交叉耐藥性等優點而廣泛用于動物疾病治療[1-2]。然而，動物、水產養殖過程中過量或超范圍使用該類藥物，通過食物鏈進入人體后容易產生耐藥菌株，且有潛在的致癌和遺傳毒性[3-4]。豬肉是公眾最常食用的肉類之一，加強豬肉中的獸藥殘留監管對公眾的身體健康非常重要。本研究參照《動物源性食品中14種喹諾酮藥物殘留檢測方法 液相色譜-質譜/質譜法》（GB/T 21312—2007）[5]，建立了超高效液相色譜-質譜聯用法（Ultra High Performance Liquid Chromatography-Mass Spectrometry，UPLC-MS）測定豬肉中4種喹諾酮類藥物殘留的方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

豬肉，來源于深圳市轄區內抽檢樣品。

恩諾沙星標準溶液（CDAA-S-550003-AD-1 mL）、環丙沙星標準溶液（CDAA-S-550001-AD-1.2 mL）、氧氟沙星標準溶液（CDAA-S-550006-AD-1.2 mL）、沙拉沙星標準溶液（CDAA-S-530219-AD-1.2 mL），濃度均為1 000 μg·mL-1，由上海安譜璀世標準技術服務有限公司提供；甲醇，德國默克公司提供；甲酸（99%），山東旭晨化工科技有限公司。

Mcllvaine緩沖溶液：將1 000 mL檸檬酸（0.1 mol·L-1）與625 mL磷酸氫二鈉（0.2 mol·L-1）混合，調節緩沖溶液pH值為4.0±0.05。

EDTA-Mcllvaine緩沖溶液：稱取60.5 g乙二胺四乙酸二鈉，加入1 625 mL Mcllvaine緩沖溶液，振蕩搖勻。

1.2 儀器與耗材

TSQ Quantis高效液相色譜-質譜聯用儀，美國賽默飛公司；GL2202-1SCN分析天平（精度0.01 g），德國賽多利斯公司；HT190R高速臺式冷凍離心機，湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司；PHS-3E pH計，上海儀電科學儀器股份有限公司；ASE-12固相萃取裝置，天津奧特賽恩斯儀器有限公司；SelectCore HLB固相萃取柱，納譜分析技術（蘇州）有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 樣品前處理

準確稱取5.00 g（精確至0.01 g）均質過的豬肉試樣于50 mL螺口離心管中，加入20 mL EDTA-Mcllvaine緩沖溶液（0.1 mol·L-1），用渦旋混合儀渦旋混合1 min，置于超聲波清洗器中超聲10 min，再于4 ℃、10 000 r·min-1的離心機中離心5 min，反復提取3次，合并上清液于試管中。

將HLB固相萃取柱置于固相萃取裝置上，先用6 mL甲醇沖洗，再用6 mL超純水活化，然后將提取得到的上清液倒入固相萃取小柱，控制以3 mL·min-1的速度過柱，棄去過濾液，再用2 mL甲醇水溶液（5%）淋洗，棄去淋洗液，抽干萃取小柱，用6 mL甲醇洗脫，收集洗脫液于試管中，置于氮吹儀中通入氮氣直至吹干，加入1 mL甲酸水溶液（0.1%）溶解，渦旋混合，轉移入進樣小瓶中上機測定。

1.3.2 標準系列溶液配制

分別吸取1.0 mL濃度均為1 000 μg·mL-1的恩諾沙星、環丙沙星、氧氟沙星、沙拉沙星標準溶液于100 mL容量瓶中，用甲醇稀釋并定容至刻度，配制成4種喹諾酮類藥物組分濃度均為10 μg·mL-1的混合標準儲備液。

將混合標準儲備液用甲酸水溶液（0.1%）逐漸稀釋成4種喹諾酮類藥物組分濃度分別為2.5 μg·L-1、5.0 μg·L-1、10.0 μg·L-1、20.0 μg·L-1、40.0 μg·L-1、80.0 μg·L-1、100.0 μg·L-1的混合標準工作系列。稱取5.0 g陰性基質樣品，依次加入1.0 mL混合標準工作系列溶液，按1.3中試樣處理過程提取并凈化。

1.3.3 儀器分析條件

（1）液相色譜條件。色譜柱：ZORBAX SB-C18（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）；柱溫：40 ℃；流速：0.3 mL·min-1；進樣量：2 μL；流動相：A甲酸水溶液（0.1%）、B甲醇；梯度洗脫程序：0～0.2 min，10%B；0.2～2.5 min，10%B→50%B；2.5～3.2 min，50%B→85%B；3.2～4.5 min，85%B保持1min；4.5～5.0 min，85%B→10%B；5.0～6.0 min，10%B。

（2）掃描方式：選擇反應監測（Selected Reaction Monitoring，SRM）模式；毛細管電壓：3 500 V；離子源溫度：300 ℃；鞘氣壓力：55 bar；監測離子：恩諾沙星360.3＞316.4（定量），360.3＞342.3（定性）；環丙沙星332.2＞314.3（定量），332.2＞288.3（定性）；氧氟沙星362.2＞318.3（定量），362.2＞261.2（定性）；沙拉沙星386.3＞342.3（定量），386.3＞299.3（定性）。

2 結果與分析

2.1 線性方程與相關系數

以混合標準工作系列中恩諾沙星、環丙沙星、氧氟沙星、沙拉沙星的濃度（X）為橫坐標，相對應測得的定量離子峰面積（Y）為縱坐標，由儀器工作站自動繪制標準工作曲線，計算線性回歸方程與相關系數，見表1。由表1中數據可知，4種喹諾酮類藥物組分在2.5～100.0 μg·L-1線性關系良好，相關系數r均大于0.99，滿足相關標準對線性的要求。

2.2 方法檢出限與定量限

稱取5.00 g經檢測不含恩諾沙星、環丙沙星、氧氟沙星、沙拉沙星的陰性豬肉試樣，添加適量4種喹諾酮類藥物組分混合標準中間液進行測試，以4種喹諾酮類藥物組分的定性離子的重構離子色譜峰的信噪比S/N≥3對應濃度來確定方法檢出限，以定量離子的重構離子色譜峰的信噪比S/N≥10對應濃度來確定方法定量限，見表1。由表1中數據可知，4種喹諾酮類藥物組分的方法檢出限為1.0～2.5 μg·kg-1，方法定量限為3.0～8.0 μg·kg-1，檢出限與定量限均符合方法標準《動物源性食品中14種喹諾酮藥物殘留檢測方法 液相色譜-質譜/質譜法》（GB/T 21312—2007）中的規定。

2.3 加標回收率及精密度

稱取18份經檢測不含上述4種喹諾酮類藥物組分的陰性豬肉試樣，每6份為一組，分別添加低（2.5 μg·kg-1）、中（20.0 μg·kg-1）、高（80.0 μg·kg-1）3個濃度水平的4種喹諾酮類藥物混合標準溶液，按照1.3.1樣品前處理過程進行提取、凈化，1.3.3儀器分析條件進行測試，計算加標回收率與精密度（以相對標準偏差表示），見表2。由表2數據可知，恩諾沙星加標回收率為99.1%～108.8%，相對標準偏差（Relative Standard Deviation， RSD）為1.01%～2.95%；環丙沙星加標回收率為90.0%～109.2%，RSD為3.07%～5.74%；氧氟沙星加標回收率為97.7%～109.1%，RSD為1.99%～2.59%；沙拉沙星加標回收率為95.6%～106.7%，RSD為1.18%～2.73%，回收率與精密度均符合《動物源性食品中14種喹諾酮藥物殘留檢測方法 液相色譜-質譜/質譜法》（GB/T 21312—2007）中關于回收率和RSD的要求。

3 結論

本研究參照GB/T 21312—2007，建立了UPLC-MS法測定豬肉中4種喹諾酮類藥物殘留的方法，恩諾沙星、環丙沙星、氧氟沙星、沙拉沙星等組分在2.5～100.0 μg·L-1線性關系良好，方法檢出限為1.0～2.5 μg·kg-1，定量限為3.0～8.0 μg·kg-1，加標回收率在90.0%～109.2%，RSD為1.01%～5.74%，可用于檢驗檢測機構對豬肉中4種喹諾酮類藥物殘留的抽檢檢測。

參考文獻

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[5]中華人民共和國國家質量監督檢驗檢疫總局，中國國家標準化管理委員會.動物源性食品中14種喹諾酮藥物殘留檢測方法 液相色譜-質譜/質譜法：GB/T 21312—2007[S].北京：中國標準出版社，2007.