敲低TMCO1對肝癌細胞增殖和侵襲的影響

摘 要：為探討跨膜和卷曲螺旋結構域 1 （transmembrane and coiled-coil domains 1，TMCO1）對肝癌細胞的增殖和侵襲的影響，構建肝癌細胞HuH-7和Li-7的過表達和敲低TMCO1細胞模型，采用Transwell、細胞克隆、線粒體通透性轉換孔（mPTP）探針、線粒體膜電位（JC-1）探針、Actin-Tracker Green-488染色、 Western blot和免疫共沉淀實驗檢測敲低TMCO1對肝癌細胞增殖、侵襲、線粒體功能、骨架重塑及VDAC1表達的影響.結果顯示：敲低TMCO1可抑制肝癌細胞的增殖、侵襲，影響線粒體功能和骨架重塑，并下調VDAC1的表達.

關鍵詞：肝癌細胞；TMCO1；VDAC1；mPTP；增殖

中圖分類號：R735.7"" 文獻標志碼：A"" 文章編號：10001565（2024）06064310

Effects of TMCO1 knockdown on the proliferation， invasion of hepatocellular carcinoma cells

LENG Junzhi， LIU Di， WANG Genwang， LIU Kejun， JIN Dong， WANG Qi， HUI Yongfeng

（Department of Hepatobiliary Surgery，General Hospital of Ningxia Medical University， Yinchuan 750004，China）

Abstract： To explore the effects of transmembrane and coiled-coil domains 1 （TMCO1） knockdown on the proliferation and invasion of hepatocellular carcinoma cells， overexpression and knockdown cell models of TMCO1 in hepatocellular carcinoma cell lines HuH-7 and Li-7 were constructed. Transwell， colony formation， mitochondrial permeability transition pore （mPTP） probes， mitochondrial membrane potential （JC-1） probes， Actin-Tracker Green-488 staining， Western blotting and co-immunoprecipitation tests were used to detect the effects of TMCO1 knockdown on hepatocellular carcinoma cells proliferation， invasion， mitochondrial function， cytoskeletal remodeling， and VDAC1 expression. The results indicated that TMCO1 knockdown inhibited the proliferation and invasion of hepatocellular carcinoma cells， affected mitochondrial function and cytoskeletal remodeling， and downregulated VDAC1 expression.

Key words： hepatoma cells; TMCO1; VDAC1; mPTP; proliferation

收稿日期：20240522;修回日期：20240914

基金項目：

寧夏回族自治區重點研發計劃項目（2021BEG03067）;寧夏自然科學基金資助項目（2022AAC03545）

第一作者：冷君志（1987—），男，寧夏醫科大學總醫院主治醫師，主要從事肝癌細胞轉移機制研究.E-mail：lengjunzhi@163.com

通信作者：惠永峰（1977—），男，寧夏醫科大學總醫院主任醫師，主要從事肝膽胰腫瘤機制及微創治療的研究.E-mail：huiyf0951@163.com

原發性肝癌的早期誤診率高達40%，肝癌患者的平均生存期不足2年^［1-2］.肝癌早、中期治療以手術為主，晚期主要為全身治療.隨著分子病理和靶向治療技術取得顯著成果^［3］，靶向治療已成為新的輔助治療方案，使晚期肝癌治療取得了突破性進展^［4-5］，因此，尋找肝癌細胞轉移中的關鍵基因成為靶向治療的關鍵.

Ca²⁺作為細胞的第二信使，調控基因轉錄、細胞周期、細胞增殖等多種生理活動，Ca²⁺介導的信號通路在細胞增殖、細胞凋亡、基因轉錄和遷移的調節中至關重要^［6-7］，Ca²⁺濃度的異常升高可以激活癌細胞的活性，促進癌細胞的增殖和遷移^［8］.跨膜和卷曲螺旋結構域1（transmembrane and coiled-coil domains 1，TMCO1）又稱內質網鈣過載激活的Ca²⁺通道，是一種內質網跨膜蛋白，在維持Ca²⁺穩態中起著關鍵作用^［9］.TMCO1參與多種生物功能的調節^［10］，并與人類多種疾病有關，包括青光眼、畸形和腫瘤發生等^［11-13］.有研究報道顯示，抑制TMCO1表達可顯著抑制肺腺癌細胞的增殖和遷移能力，并影響細胞凋亡^［14］.文獻［15］表明，TMCO1 在膠質瘤中過表達，上調TMCO1 可通過促進上皮間質轉化 （EMT）誘導膠質瘤細胞遷移和侵襲，敲低TMCO1 可抑制 U87 和 U251 細胞的增殖并誘導細胞凋亡.然而，目前鮮見TMCO1與肝癌關系的相關研究報道.

電壓依賴性陰離子通道蛋白 （voltage-dependent anion channel 1，VDAC1）是線粒體外膜上含量極為豐富的孔狀蛋白，是形成線粒體和細胞質之間代謝物交換的共同途徑，控制著線粒體代謝產物的進出，進而對調節線粒體Ca²⁺水平也至關重要^［16］.研究認為，VDAC1在內質網和線粒體Ca²⁺穩態調節機制中發揮著關鍵作用^［17］.乳腺癌研究中，敲低VDAC1抑制了乳腺癌細胞的增殖和遷移，促進了乳腺癌細胞的死亡^［18］.MCU 與 VDAC1 相互作用，MCU敲低抑制了VDAC1 過表達誘導的初級小腦顆粒神經元細胞死亡^［19］.在肝癌細胞研究中，VDAC1可介導線粒體膜通透性轉換孔（mPTP）開放影響線粒體功能^［20］.TMCO1與VDAC1是否存在調節關系并不清楚.

本研究通過分析TMCO1對肝癌細胞增值、侵襲的影響，檢測線粒體功能、骨架重塑及VDAC1表達的變化.表明TMCO1可通過調節線粒體膜電位水平及mPTP開放影響線粒體功能和細胞骨架，敲低TMCO1抑制肝癌細胞增殖和侵襲，這種作用可能與下調VDAC1表達有關.

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞培養及處理

肝癌細胞系 HuH-7和Li-7均購自中國科學院細胞庫（https：//www.cellbank.org.cn）.HuH-7細胞培養于含10%（體積分數，下同）胎牛血清和1%青霉素/鏈霉素以及1% L-alanyl-L-glutamine和1% Sodium Pyruvate的DMEM培養液中；Li-7細胞培養于含10%胎牛血清和1%青霉素/鏈霉素的RPMI-1640培養液中，所有細胞均在37 ℃、5%CO2恒溫培養箱中培養.本實驗分為4組，shRNA-NC組（敲低TMCO1的陰性對照），OE-NC組（轉染過表達空載體），shRNA-TMCO1組（敲低TMCO1），OE-TMCO1組（轉染TMCO1過表達質粒）.

1.1.2 主要試劑

培養細胞用的胎牛血清、體積分數1%青霉素/鏈霉素、DMEM培養液和RPMI-1640購自美國Gibco公司；線粒體膜電位（貨號：M8650）購自北京索萊寶科技有限公司；Lipofectamine 8000轉染試劑（貨號：C0533FT）、線粒體通透性轉換孔（mPTP）檢測試劑盒（貨號：C2009S）、Actin-Tracker Green-488（貨號：C2201S）均購自上海碧云天生物技術有限公司；Transwell細胞培養小室購自美國Corning公司；TMCO1 （貨號：27757-1-AP）和VDAC1（貨號：55259-1-AP）均購自Proteintech公司；Western blot的二抗購自北京中杉金橋公司；TMCO1慢病毒及其陰性對照以及TMCO1過表達質粒均由上海生工生物工程股份有限公司設計合成；BCA 蛋白定量試劑盒（貨號：PT0001）購自北京雷根生物技術有限公司.

1.2 方法

1.2.1 TMCO1過表達質粒和沉默序列模型的構建

上海生工生物工程股份有限公司合成TMCO1沉默序列（shRNA）和陰性對照： shRNA-TMCO1#2（TRCN0000062125：5’-CCCTAATGGGAATGTTCAATT-3’），shRNA-NC（TRCN0000072243：5’-CTTCGAAATGTCCGTTCGGTT-3’）.將TMCO1全長克隆到pcDNA3.1載體上，以空載體（OE-NC）作為對照.Control組為正常培養細胞，沒有進行轉染.

1.2.2 線粒體膜電位實驗

將HUH-7和Li-7細胞接種于6孔板，加入1 mL細胞培養液和提前配制好的1 mL JC-1 染色工作液，混勻后在細胞培養箱中37 ℃孵育20 min，在孵育期間根據說明書配置適量的JC-1染色緩沖液.孵育結束后，吸除上清， 使用 JC-1染色緩沖液洗滌細胞.在熒光顯微鏡下觀察.綠色熒光表明線粒體膜電位下降，紅色熒光表明線粒體膜電位正常，通過紅色熒光強度和綠色熒光強度的比值來表示線粒體膜電位.并用IPP6.0軟件進行分析.

1.2.3 細胞克隆

Li-7和HuH-7細胞接種于3.5 cm板中，然后按照各組要求，將處理后的細胞培養15 d至形成可見菌落.去除上清液，用PBS洗滌細胞2次.隨后，用質量分數4%多聚甲醛在室溫下固定細胞15 min，用質量分數0.1%結晶紫在室溫下放置20 min，用PBS洗滌2次，風干.拍照并計數.

1.2.4 線粒體通透性轉換孔（mPTP）檢測

取各組處理后的HuH-7和Li-7細胞，先用PBS洗滌2次，加入提前配置好的熒光探針鈣黃綠素乙酰甲酯（calcein acetoxymethyl ester，Calcein AM）染色液及熒光淬滅工作液，Ionomycin作為對照.在37 ℃避光孵育40 min，孵育結束后，更換為37 ℃預熱的培養液，在37 ℃避光孵育30 min.用PBS清洗2～3次，熒光顯微鏡下觀察，并拍照.

1.2.5 Transwell實驗

Transwell實驗檢測細胞的侵襲能力，在Transwell上室中預涂50 μL Matrigel基質膠，然后在室溫下進行風干.將細胞在無血清培養基中饑餓24 h，用無血清培養基重懸至細胞濃度1×105個/mL.在上室加入200 μL細胞懸液，下室加入600 μL的培養液，在37 ℃，體積分數5%CO2常規培養48 h.孵育結束后，用質量分數4%多聚甲醛溶液固定10 min，結晶紫染色20 min，隨機取中央及四周5個視野計數.

1.2.6 Western blot實驗

從細胞中提取蛋白質，通過BCA 蛋白質，抗體與抗體稀釋液的體積比，并利用BCA試劑盒進行蛋白定量.用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺（SDS-PAGE）進行電泳，分離蛋白質至PVDF膜上.將膜與質量分數5%脫脂奶粉封閉2 h，加入一抗TMCO1 （1∶500）、VDAC1（1∶2000），在4 ℃下分別孵育過夜.第2天加入山羊抗兔IgG辣根酶（1∶5 000）標記的二抗，室溫孵育1 h，再用TBST洗膜3次，使用ECL試劑盒顯影，利用Image-J軟件分析蛋白質的灰度值.

1.2.7 細胞骨架

按照Actin-Tracker Green-488的說明書進行操作.Li-7和HuH-7細胞（5×105個/孔）進行爬片處理.室溫下，用質量分數3.7%甲醛在PBS中固定20 min，然后與Actin-Tracker Green-488溶液孵育30 min，熒光顯微鏡下觀察.最后用DAPI染色液在室溫下重新染色5 min.使用Image-Pro Plus Software 6.0軟件進行定量.

1.2.8 免疫共沉淀

先將細胞裂解，并在4 ℃下以13 000g離心20 min，收集上清液，50 μL作為Input陽性對照組，2 μL用于測定濃度，其余上清液備用.分別使用3 μgTMCO1抗體和VDAC1抗體，并使用相應量的正常IgG作為陰性對照組.加入100 μL Protein A+G瓊脂糖珠，并在4 ℃下旋轉2 h，然后在4 ℃下，1 000g離心5 min，收集沉淀物.將細胞裂解物分別加入抗體或正常IgG的Protein A+G瓊脂糖珠中，在4 ℃下旋轉過夜，使蛋白與抗體結合.將樣品在4 ℃下1 000g離心5 min，除去上清液.將沉淀物用PBS洗滌4次，每次1 mL.在沉淀中加入負載緩沖液，將細胞裂解后的沉淀物和50 μL上清液煮沸5 min.再1 000g離心5 min，收集上清液，用于蛋白質印跡檢測.

1.3 統計學分析

采用 SPSS17.0 軟件分析處理，所有數據以均數±標準差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析（One-Way ANOVA），兩組間比較采用獨立樣本t檢驗.以P＜0.05表示差異有統計學意義.

2 結果

2.1 Western blot法檢測TMCO1敲低和過表達效果及TMCO1對肝癌細胞侵襲的影響

構建并驗證3條shRNA-TMCO1（shRNA-TMCO1#1、shRNA-TMCO1#2、shRNA -TMCO1#3）序列轉染肝癌細胞HuH-7和Li-7效果，結果表明：TMCO1過表達組與OE-NC相比，轉染效果顯著（P＜0.001，圖1a-d）；與shRNA-NC組相比，shRNA-TMCO1#2轉染效果較為顯著（P＜0.001，圖1e-h），后續作為實驗序列.Tanswell侵襲實驗結果顯示：與OE-NC組相比，過表達TMCO1（OE-TMCO1）可促進肝癌細胞侵襲能力；敲低TMCO1（shRNA-TMCO1）顯著抑制肝癌細胞侵襲能力（P＜0.001圖1i-k）.表明TMCO1可調節肝癌細胞的侵襲能力.

2.2 TMCO1對線粒體膜電位的影響

線粒體膜電位（JC-1）實驗結果如圖2所示：與OE-NC組相比，過表達TMCO1可增強紅色熒光強度，減弱綠色熒光強度，表明過表達TMCO1可顯著上調肝癌細胞線粒體膜電位水平（P＜0.001）；與shRNA-NC組相比，敲低TMCO1可降低紅色熒光強度，增強綠色熒光強度，表明敲低TMCO1顯著降低肝癌細胞線粒體膜電位水平（P＜0.001）.CCCP作為線粒體膜電位缺失的對照組.

2.3 TMCO1調節mPTP的開放狀態

mPTP熒光探針實驗結果如圖3所示：過表達TMCO1可顯著抑制肝癌細胞mPTP開放（綠色熒光增強）；敲低TMCO1可顯著促進mPTP開放（綠色熒光降低）（P＜0.001）.表明TMCO1可調節mPTP的開放和關閉，進一步說明TMCO1可影響線粒體功能.Calcein AM作為mPTP關閉的對照組，而lonomycin作為mPTP開放的對照組.

2.4 TMCO1對肝癌細胞增殖的影響

細胞克隆實驗結果如圖4所示：與OE-NC組相比，過表達TMCO1組細胞集落形成數量增加；相反，敲低TMCO1，細胞集落數量顯著減少，與shRNA-NC組相比有統計學差異（P＜0.001）.表明TMCO1可調節肝癌細胞的增殖能力.

2.5 TMCO1對細胞骨架的影響

使用Actin-Tracker Green-488熒光探針檢測，結果如圖5所示：過表達TMCO1顯著促進肝癌細胞微絲（綠色）增多和偽足形成；相反，敲低TMCO1顯著抑制肝癌細胞微絲熒光強度和偽足形成（P＜0.001）.表明TMCO1可調節肝癌細胞骨架重塑.

2.6 TMCO1對VDAC1蛋白表達的影響

Western blot實驗結果如圖6所示：過表達TMCO1顯著上調VDAC1的蛋白表達水平；相反，敲低TMCO1顯著降低VDAC1的蛋白表達（P＜0.001，圖6a-f）.此外，免疫共沉淀結果顯示，TMCO1與VDAC1存在相互作用（圖6g、h）.表明TMCO1可調節線粒體外膜蛋白VDAC1的表達，推測TMCO1通過調節VDAC1影響線粒體功能.

3 討論與結論

探索和闡述肝癌進展中的關鍵基因作用是靶向治療的關鍵.Ca²⁺穩態調節機制一直是癌癥研究的熱點，尤其是內質網與線粒體之間的作用蛋白調節機制，有望成為靶向治療的關鍵點^［21］.本研究中，通過構建過表達和敲低TMCO1細胞模型，表明TMCO1可通過介導線粒體膜電位和mPTP開放影響線粒體功能；TMCO1可調節細胞骨架重塑、細胞增殖和細胞侵襲能力.上述實驗表明，敲低TMCO1可抑制肝癌細胞增殖和侵襲，這可能與下調VDAC1表達有關.

在腫瘤細胞增殖過程中，Ca²⁺穩態與腫瘤細胞增殖以及腫瘤的發生發展有關，尤其是內質網Ca²⁺穩態可通過影響內質網蛋白質合成和膜脂質生物發生，直接參與細胞增殖^［16］.在膠質瘤研究中，TMCO1可促進U87和U251細胞上皮-間質轉化（EMT）誘導細胞遷移和侵襲，然而，敲低TMCO1可發揮抑制作用^［15］.本研究通過基因修飾TMCO1發現，TMCO1可調節HuH-7和Li-7細胞的增殖能力，同時觀察到敲低TMCO1可顯著抑制肝癌細胞的侵襲能力，該結果與齊順利等^［22］在結腸癌細胞中的研究結果相似.本實驗發現，TMCO1可通過調節線粒體膜電位水平和線粒體通透性轉換孔（mPTP）開放，影響肝癌細胞線粒體功能.揭示了TMCO1可能參與內質網-線粒體軸的調節作用機制.然而，本研究并沒有關注內質網應激的改變，主要關注線粒體相關內質網膜（MAM）結構，因為內質網-線粒體軸被認為是細胞器間系統的代表，參與多種細胞內信號通路，并增強癌細胞對抗癌藥物敏感性和調節免疫細胞活性^［23］.

VDAC1位于線粒體外膜，控制著大多數陰離子呼吸底物、ATP、ADP和少部分陽離子通量，維持線粒體功能^［24］.在胃癌細胞中BAP31通過影響VDAC1的寡聚化和泛素化調控細胞的增殖和鐵死亡^［25］.乳腺癌研究中，通過抑制VDAC1的泛素化降解，促進線粒體代謝，加速乳腺癌的發展^［26］.在肝癌細胞中，利用小分子抑制劑抑制VDAC1表達可降低肝癌細胞線粒體膜電位水平并抑制細胞增殖^［27］.結腸癌研究中，VDAC1表達與細胞骨架和細胞周期相關^［28］.綜上所述，VDAC1通過影響線粒體功能發揮抗癌作用.本實驗中，TMCO1可調節肝癌細胞VDAC1表達，與此同時，TMCO1影響肝癌細胞骨架重塑.本研究還采用免疫共沉淀方法驗證了TMCO1與VDAC1之間的相互作用關系，進一步證實這種作用可能與調節VDAC1表達密切相關.并推測TMCO1可能是VDAC1的上游調節因子，并且其通過調節VDAC1表達影響線粒體功能.

VDAC1參與mPTP的合成，mPTP是線粒體外膜上的一個關鍵孔，參與代謝產物的信號轉導和轉運^［29-30］ .在非腫瘤研究中，VDAC1通過調控mPTP的開閉治療帕金森病^［31］.丹參酮ⅡA通過VDAC1調節mPTP 開放改善缺氧/復氧對心肌細胞線粒體的損傷^［32］.在卵巢癌耐藥機制研究中，GRP75通過促進內質網肌醇1，4，5-三磷酸受體（IP3R）和VDAC1之間相互作用形成復合物，是促進MAM形成的關鍵系鏈，敲低GRP75破壞系鏈導致MAM完整性降低，減少了內質網向線粒體Ca²⁺轉移，促進mPTP開放，加速了順鉑誘導的線粒體功能障礙，增強了順鉑觸發的卵巢癌細胞凋亡^［33］.本實驗中TMCO1可以調節肝癌細胞mPTP開放和關閉，并且這種作用與調控VDAC1表達相反，這可能是除了IP3R與VDAC1作用外，又一內質網蛋白與VDAC1之間相互作用且影響癌細胞進展的作用路徑.由此推測，TMCO1可能通過線粒體外膜基因VDAC1表達介導mPTP開放，影響線粒體相關內質網膜結構的完整性.這為研究線粒體相關內質網膜結構提供了一些參考.當然，未來將通過膜片鉗實驗以及拯救實驗進一步驗證.

綜上，實驗證明了TMCO1通過介導線粒體膜電位、mPTP開放影響線粒體功能和細胞骨架重構.敲低TMCO1可下調VDAC1表達抑制肝癌細胞增殖和侵襲.這為肝癌開發靶點治療提供了新的參考.

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（責任編輯：梁俊紅）