補腎中藥通過AMPK-mTOR通路提高腎精虧虛大鼠睪丸間質細胞自噬能力

摘 要：為了探究補腎中藥提高腎精虧虛大鼠睪丸間質細胞自噬能力的機制，采用單因素電刺激法建立腎精虧虛大鼠模型，免疫組化及Western blot檢測各組睪丸細胞自噬標志蛋白Beclin1、p62、LC3B表達水平以及AMPK和mTOR表達變化.基于腎精虧虛與衰老的密切聯系，通過自由基氧化損傷法建立睪丸間質細胞（Leydig細胞）衰老模型，聯合AMPK抑制劑，探究何首烏飲激活細胞自噬的分子機制.結果顯示：何首烏飲可上調睪丸組織Beclin1蛋白、LC3B表達，下調p62蛋白表達，促進AMPK磷酸化并抑制mTOR激活（P＜0.05）;細胞實驗表明，何首烏飲可通過激活AMPK-mTOR信號通路提高Leydig細胞自噬能力（P＜0.05），促進腎精虧虛大鼠睪丸Leydig細胞自噬進程.

關鍵詞：何首烏飲；腎精虧虛；睪丸組織；自噬；AMPK-mTOR

中圖分類號：Q291"" 文獻標志碼：A"" 文章編號：10001565（2024）06063310

Kidney-tonifying Chinese medicine improves autophagy of Leydig cells in rats with kidney essence deficiency through AMPK-mTOR pathway

LI Chaoying1， LI Sirui2， ZHANG Wei3， MA Haofei2， NIU Shuang2， DUAN Yulei2， NIU Siyun2

（1. Department of Neonatology， Affiliated Hospital of Hebei University， Baoding 071000， China;2. School of Basic Medical Sciences， Hebei University， Baoding 071000， China;3. Medical Engineering Center， Affiliated Hospital of Hebei University， Baoding 071000， China）

Abstract： In order to explore the mechanism of kidney-tonifying Chinese medicine in improving autophagy of testicular mesenchymal cells in rats with kidney-essence deficiency， a rat model of kidney-essence deficiency was established by single-factor electrical stimulation. Immunohistochemistry and Western blot were used to detect the expression levels of autophagy marker proteins Beclin1， p62， LC3B， AMPK and mTOR in testicular cells of each group. Based on the close relationship between kidney essence deficiency and aging， Leydig cell aging model of testicular mesenchymal cells was established by free radical oxidative damage method， and AMPK inhibitor was combined to explore the molecular mechanism of Heshouwuyin activating autophagy. The results showed that Heshouwuyin could up-regulate the expression of Beclin1 protein and LC3B in testicular tissue， down-regulate the expression of p62 protein，promote AMPK phosphorylation and inhibit mTOR activation （Plt;0.05）. Cell experiments showed that Heshouwuyin could affect the autophagy ability of Leydig cells by activating AMPK-mTOR signaling pathway （Plt;0.05）.Therefore， Heshouwuyin may promote the autophagy process of Leydig cells in rats with kidney essence deficiency by activating AMPK-mTOR signaling pathway.

Key words： Heshouwuyin; kidney essence deficiency; testicular tissue; autophagy; AMPK-mTOR

收稿日期：2024 0219;修回日期：20240508

基金項目：

國家自然科學基金資助項目（82374180）；河北省中醫藥管理局科研項目（2020234）；河北省重點研發計劃項目-中醫藥創新專項（223777134D）；河北大學醫學學科培育項目（2023B10）;河北省高等學校科學技術研究項目（ZD2022060）

第一作者： 李朝英（1980—），女，河北大學附屬醫院主治醫師，主要從事早產兒營養評估.E-mail：lizhaoying725@126.com

通信作者：段豫磊（1994—），男，河北大學實驗師，主要從事中藥藥理方向研究.E-mail：dyl15771@163.com

牛嗣云（1967—），女，滿族，河北大學教授，博士，博士生導師，主要從事生殖衰老方向研究.E-mail：nsy1688@163.com

不孕不育是威脅人類健康的第三大類疾病^［1］，其中男性因素占50%^［2］.晚婚晚育已成為普遍的社會現象，高齡是生殖功能下降的重要因素之一.Leydig細胞合成睪酮能力隨著增齡而顯著降低，進而導致血清睪酮水平下降^［3］，且睪酮水平降低與糖尿病、骨質疏松、心血管疾病和睡眠障礙等老年疾病密切相關^［4］.目前，常使用睪酮替代療法干預男性血清睪酮下降，但其帶來的副作用會超過其潛在的健康益處^［5］.因此，新的增加內源性睪酮分泌的策略有待開發.中醫臨床中，“補腎益精”提高男性生殖能力療效顯著，但作用機制不明.研究證明，細胞自噬在調節Leydig細胞睪酮合成過程中起著重要作用，并與Leydig細胞功能呈正相關^［6-7］.而本課題組前期研究表明，補腎中藥何首烏飲可促進生精細胞增殖^［8］、促進Leydig細胞睪酮分泌^［9］，提高衰老大鼠精子質量^［10］.基于此，本文探討了補腎中藥提高腎精虧虛大鼠睪丸細胞自噬能力可能的分子機理，為“補腎益精”中藥的臨床應用提供了科學依據.

1 材料與方法

1.1 實驗動物

2月齡SPF級Wistar雄性大鼠（220～260 g）50只，購于北京維通利華實驗動物技術有限公司，動物許可證號：SCXK（京）2016-0006.適應性飼養1周，控制溫度在22 ℃左右，正常給予食物和水.

1.2 試劑與儀器

Beclin1、p62一抗（中國生工生物工程股份有限公司）；LC3B一抗（美國abcam公司）；p-AMPK、AMPK、p-mTOR、mTOR、GAPDH一抗（中國abways公司）；細胞衰老β-半乳糖苷酶染色試劑盒（中國碧云天生物有限公司）；免疫組化SP兩步法試劑盒、DAB顯色試劑盒（中國中杉金橋生物技術有限公司）；50×檸檬酸鈉抗原修復液、BCA蛋白濃度測定試劑盒、蛋白Marker（中國索萊寶科技有限公司）；EASYspin Plus 組織/細胞RNA快速提取試劑盒（中國艾德萊生物科技公司）；PrimeScript RT reagent Kit with Gdna Eraser試劑盒、TB GreenTM Premix Ex TaqTM Ⅱ試劑盒（Tli RNaseH Plus）（日本 TaKaRa 公司）.

1.3 實驗藥物

何首烏飲組方：制首烏、懷牛膝、肉蓯蓉、丹參、茯苓、淫羊藿，以生藥質量比3∶3∶2∶5∶3∶2混合.本實驗采用廣東一方公司中藥飲片速溶成品，成品與生藥質量比為：制首烏1∶10，懷牛膝1∶5，肉蓯蓉1∶10，丹參1∶10，茯苓1∶5，淫羊藿1∶20.前期研究表明，大鼠灌胃的最佳給藥量（生藥）為48 g/kg，換算為成品顆粒為6.13 g/kg^［11］，現用現配.

1.4 造模與給藥

2月齡Wistar大鼠分為正常組、模型組和何首烏飲組（n=10）.模型組和何首烏飲組大鼠模擬“房勞”法建立“腎精虧虛”大鼠模型，通過單因素電刺激，使用電針療儀（華佗，SDZ-Ⅱ）電針接觸大鼠大腿內側部，采用連續電波模式，脈沖頻率40 Hz，電流2 mA.刺激支配大腿內側和會陰部的生殖股神經，使精囊、提睪肌、大腿內側皮膚興奮，引起射精神經的興奮，進而陰莖勃起，最后射精，達到人工耗精的目的.每日刺激時間為20∶00，連續刺激7 d，休息3 d，10 d為1個周期，連續進行3個周期，共30 d；而后于每個月的后10 d重復刺激，耗精至10月齡.正常組不做處理.何首烏飲組5月齡開始灌胃何首烏飲，一日2次，正常組和模型組灌等量的生理鹽水，連續60 d.7、8月不做任何處理，從9月齡開始，何首烏飲組繼續灌胃30 d，正常組和模型組連續灌胃生理鹽水30 d.

腹腔注射戊巴比妥鈉溶液（50 mg/kg）麻醉，取出雙側睪丸組織，左側快速置于-80 ℃冰箱保存，右側于40 mg/mL多聚甲醛溶液固定、脫水、石蠟包埋.

1.5 含藥血清制備

選取2月齡Wistar雄性大鼠20只，分別灌胃何首烏飲（n=10）與等量生理鹽水（n=10），給藥劑量同“1.3實驗藥物”部分，連續7 d，第7 天給藥1 h后麻醉內眥取血.將收集到的血靜置30 min，低溫離心機3 000 r/min離心10 min，分離血清.分別獲得何首烏飲大鼠含藥血清與大鼠空白血清，通過0.22 μm過濾器過濾，并無菌分裝，-80 ℃保存待用.

1.6 Leydig細胞分離培養及處理

采用Ⅰ型膠原酶處理17～25 d Wistar大鼠睪丸分離原代Leydig細胞^［12］，將細胞接種于含體積分數10%胎牛血清的DMEM/F12培養液中，以1×107個/mL的密度鋪勻，1 h換液.Leydig細胞80％融合度時傳代，第3代接種密度為1×106個/mL，通過自由基氧化損傷法建立Leydig細胞衰老模型^［13］.

1.7 CCK8實驗

上述獲得的大鼠Leydig細胞，通過CountStart細胞計數儀計數后，以8 000個/孔的密度接種于96孔板中.將AMPK抑制劑Compound C濃度梯度設置為0、1、5、10、20、30 μmol/L，每個濃度梯度設置6個復孔.共設置3個作用時間：24、48、72 h.作用完成后，每孔加入10 μL CCK8試劑，37 ℃孵育2 h，采用酶標儀450 nm檢測吸光度，計算細胞活力.

細胞活力=A樣/A0×100％，

式中：A樣為各濃度下的吸光度；A0為0 μmol/L時的吸光度.

1.8 石蠟切片免疫組織化學染色

免疫組化法檢測睪丸組織p16、Beclin1蛋白表達.睪丸石蠟切片脫蠟水化，檸檬酸鈉抗原修復，體積分數10% H2O2溶液室溫封閉10 min.切片上滴加50 μL配置好的p16一抗（1∶300）、Beclin1一抗稀釋液（1∶500）.為消除假陽性結果，設置陰性對照組切片，陰性對照切片只滴加相等體積的p16、Beclin1一抗稀釋液.4 ℃孵育過夜后，羊抗兔二抗 37 ℃孵育30 min.DAB顯色液孵育3 min，蘇木素染色、封片.正置顯微鏡下觀察切片并進行拍照.Image J 軟件IHC Profiler 插件進行免疫組化分析，根據不同的DAB染色強度進行評分，規則為強陽性3分，陽性2分，弱陽性1分，陰性0分.每個視野的得分指數=各等級細胞所占的百分比×相應評分.IHC評分為各組中所有視野的得分指數平均值.

1.9 β-半乳糖苷酶染色

各組大鼠睪丸組織切片脫蠟，復水.使用β-半乳糖苷酶（β-Gal）對kit染色處理.固定液固定組織切片15 min， PBS清洗3次，每次5 min；將試劑盒內自帶的染液A 10 μL、染液B 10 μL、染液C 930 μL以及X-Gal 50 μL混合后滴加于組織切片上，37 ℃避光，靜置16 h；為消除假陽性結果設置陰性對照組切片，陰性對照組切片只滴加相等體積的生理鹽水.PBS清洗3次，每次3 min，蘇木素染色5 min，稀鹽酸乙醇浸泡1 s，淡氨水返藍30 s，流水沖洗10 min，染色完成后脫水，中性樹脂封片.每組切片選取5個組織，選擇相同部位3張連續切片，隨機在每個切片中取10個視野，拍照（200×），統計陽性細胞數.

1.10 細胞處理及分組

Leydig細胞分為正常組、模型組、何首烏飲組、正常+抑制劑組、模型+抑制劑+何首烏飲組，處理方式見表1.

1.11 熒光定量PCR

睪丸組織100 mg或Leydig細胞1×107個，北京艾德萊生物科技公司生產的RNA快速提取試劑盒提取總RNA，超微量分光光度計測定RNA純度和濃度.PrimeScript RT reagent 試劑盒進行普通PCR反轉錄cDNA.使用熒光染料SYBR，熒光定量PCR儀進行RT-qPCR，β-acting為內參基因.利用SPSS 19.0 軟件、2^-△△Ct 法對各組閾值循環數（Cydethreshold，Ct值）進行統計學分析.Beclin1、β-acting基因引物序列（表2）由Thermo Fisher公司合成.

1.12 免疫印跡法

將睪丸組織100 mg或Leydig細胞1×107個，1 mL RIPA（含1 μL PMSF），勻漿后冰上靜置裂解10 min， 4 ℃ 13 000 r/min 離心 10 min.吸取上清液，用考馬斯亮藍對蛋白裂解液進行蛋白定量.用裂解液以及loading buffer將所有蛋白裂解液統一稀釋成4 mg/mL蛋白樣品溶液，在100 ℃ 煮沸5 min變性后分裝.電泳采用體積分數10% 分離膠體系，進樣體積20 μL，恒壓90 V 30 min轉120 V 60 min.電泳后切膠，恒流280 mA 2 h轉PVDF膜.質量分數5% 脫脂奶粉的 PBST 溶液 37 ℃ 封閉 2 h.PBST溶液稀釋Beclin1（1∶1 000）、p62（1∶500）、LC3B（1∶2 000）、AMPK（1∶500）、p-AMPK（1∶1 000）、mTOR（1∶1 000）、p-mTOR（1∶1 000）、GAPDH（1∶2 000），一抗稀釋液 4 ℃ 孵育過夜.PBST溶液清洗3次，每次5 min.PBST配制的羊抗小鼠二抗（1∶200 00）孵育 2 h，PBST溶液清洗3次，每次5 min.ECL化學發光液（現用現配）孵育PVDF膜，凝膠成像系統顯影并拍照.Image J軟件對目的條帶與內參條帶進行灰度值測定，重復3次獨立實驗.

1.13 統計分析

實驗數據用平均值±標準差表示.各實驗數據采用正態性檢驗，數據分布滿足正態進行單因素方差分析，Plt;0.05有統計學意義.若方差齊則采用最小顯著差法兩兩比較，若不齊則用Dunnett’s T3法.

2 結果

2.1 何首烏飲對腎精虧虛大鼠睪丸組織細胞β-Gal和p16蛋白表達的影響

通過檢測睪丸組織衰老標記物β-Gal和衰老標記蛋白p16表達，分析了何首烏飲對腎精虧虛大鼠睪丸組織衰老的影響（圖1）.結果顯示：β-Gal陽性產物為藍綠色，主要定位于間質細胞細胞質中，模型組β-Gal明顯高于正常組（Plt;0.05）；何首烏飲干預后β-Gal表達明顯低于模型組（Plt;0.05），免疫組化結果顯示：p16蛋白于各級生精細胞和Leydig細胞細胞核中表達，陽性細胞核呈黃色.模型組中p16 IHC評分明顯高于正常組（Plt;0.05）；何首烏飲組p16的表達水平顯著下降，IHC評分顯著低于模型組（Plt;0.05）.

2.2 何首烏飲對腎精虧虛大鼠睪丸Beclin1蛋白和mRNA表達的影響

為探討何首烏飲對腎精虧虛大鼠睪丸自噬的影響，檢測了自噬標志因子Beclin1蛋白和mRNA表達情況，免疫組化結果顯示：Beclin1蛋白主要定位于細胞質，表達于各級生精細胞及間質細胞中，同時通過染色發現，模型組中睪丸結構松散、生精細胞脫落（圖2a），何首烏飲干預可改善這一現象.分析顯示：與正常組相比，模型組Beclin1 蛋白和mRNA轉錄水平均顯著降低（Plt;0.05），何首烏飲可顯著提高Beclin1蛋白表達和轉錄水平（Plt;0.05）（圖2b、c）.

2.3 何首烏飲對腎精虧虛大鼠睪丸Beclin1、p62、LC3B蛋白表達的影響

為進一步探討何首烏飲對腎精虧虛大鼠睪丸組織自噬的影響，免疫印跡檢測自噬標志蛋白Beclin1、p62以及LC3B的表達情況，結果如圖3所示：與正常組相比，模型組Beclin1蛋白表達和LC3-Ⅱ/ LC3-Ⅰ水平顯著降低（Plt;0.05），p62蛋白表達顯著增高（Plt;0.05）；何首烏飲可顯著提高模型組大鼠睪丸Beclin1蛋白表達和LC3-Ⅱ/ LC3-Ⅰ水平（Plt;0.05），顯著降低p62蛋白水平（Plt;0.05）.

2.4 何首烏飲對腎精虧虛大鼠睪丸AMPK、mTOR蛋白磷酸化水平的影響

Western blot檢測了AMPK及mTOR蛋白磷酸化情況，結果如圖4所示：與正常組相比，模型組p-AMPK水平降低（Plt;0.05），何首烏飲治療可顯著提高p-AMPK水平（Plt;0.05）；模型組p-mTOR水平高于正常組（Plt;0.05），何首烏飲可顯著抑制p-mTOR水平（與模型組比較Plt;0.05）.基于此，推測何首烏飲通過調節AMPK和mTOR的活性，影響睪丸組織細胞自噬，進而以Leydig細胞為研究對象，探討了何首烏飲通過AMPK-mTOR通路調節自噬的分子機制.

2.5 Compound C濃度與作用時間的選擇

為驗證何首烏飲是否通過AMPK-mTOR通路調節自噬，采用AMPK抑制劑Compound C作用Leydig細胞進行機制驗證，首先篩選其最佳作用濃度與時間.CCK8結果（圖5）顯示：當Compound C濃度為30 μmol/L時，細胞出現大量死亡;濃度為20 μmol/L時，在各作用時間下，細胞活力為50%以下，對細胞的生存活性產生影響；濃度為10 μmol/L時，作用24 h，細胞活力較好，達到80％以上.故確定Compound C的最佳作用濃度為10 μmol/L，作用時間為24 h.

2.6 何首烏飲對大鼠Leydig細胞Beclin1、p62、LC3B蛋白表達的影響

Western blot結果如圖6所示：Leydig細胞衰老模型組中Beclin1蛋白和LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ水平低于正常組（Plt;0.05），p62蛋白水平高于正常組（Plt;0.05）.與模型組相比，何首烏飲組中Beclin1蛋白表達和LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ水平顯著升高（Plt;0.05），p62蛋白表達水平顯著降低（Plt;0.05）.同時，與何首烏飲組相比，何首烏飲+抑制劑組Beclin1蛋白和LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ水平降低（Plt;0.05），p62蛋白表達升高（Plt;0.05），表明抑制劑可明顯抑制何首烏飲對細胞自噬的調控作用.

2.7 何首烏飲對大鼠Leydig細胞AMPK、mTOR蛋白磷酸化水平的影響

為了驗證何首烏飲是否通過AMPK-mTOR通路激活自噬途徑，Western Blot檢測了p-AMPK、AMPK、p-mTOR、mTOR在大鼠Leydig細胞的表達水平.結果如圖7所示：模型組p-AMPK表達水平低于正常組（Plt;0.05），p-mTOR表達水平高于正常組（Plt;0.05）.與模型組相比，何首烏飲組p-AMPK水平顯著升高（Plt;0.05），p-mTOR水平顯著降低（Plt;0.05）.同時，與何首烏飲組相比，何首烏飲+抑制劑組中p-AMPK水平顯著降低（Plt;0.05），p-mTOR水平顯著升高（Plt;0.05），表明抑制劑可抑制何首烏飲的干預作用.

3 討論與結論

中醫理論認為，腎精虧虛是生殖功能下降和機體衰老的主要病機，“房勞”是腎精虧虛的主要誘因.有研究者^［14］對老年人有“腎精虧虛”癥患者進行全基因組基因芯片篩查，發現“腎精虧虛”癥與老年性疾病之間存在多種共性基因.本課題組采用單因素電刺激法刺激大鼠過度排精模擬“房勞”建立腎精虧虛大鼠模型.發現腎精虧虛大鼠睪丸組織各級生精細胞層數減少且排列紊亂，生精小管內出現空泡，連接松散等現象.同時已有研究表明，“腎精虧虛”鼠精神萎靡、毛色暗沉、反應遲鈍，同時出現生育力降低、精液質量下降、精子密度和活力降低，精子DNA損傷加劇等現象^［15-16］.本研究補腎復方何首烏飲方包括制首烏、肉蓯蓉、懷牛膝、淫羊藿、丹參、茯苓6味中藥.前期基因芯片篩查發現，何首烏飲可調控衰老大鼠睪丸組織912個基因的表達，其中包括調節細胞自噬進程的AMPK和mTOR蛋白基因^［17］，但機制尚不清楚.

AMPK與mTOR是調節細胞自噬的重要因子^［18］，其中，AMPK蛋白激酶起到調節細胞能量穩態和調節自噬的重要作用，可調節mTORC1磷酸化.mTOR是組成mTORC1復合體的關鍵蛋白，mTORC1磷酸化介導自噬蛋白的失活，從而抑制細胞自噬以及多種細胞功能.磷酸化的AMPK可抑制mTOR及mTORC1復合體，進而上調細胞自噬進程^［19］.細胞自噬與男性生殖功能密切相關，自噬進程不僅參與男性性腺軸的調節，亦對精原干細胞的分化、更新、精母細胞的減數分裂以及精子發生進程起重要調節作用^［20］.基于此，筆者檢測了各組睪丸組織自噬標志性蛋白Beclin1、p62、LC3B的表達情況以及AMPK和mTOR蛋白的磷酸化水平^［21］，來評估何首烏飲對腎精虧虛大鼠睪丸自噬的影響和可能的作用機制.結果顯示，過度排精誘導的腎精虧虛大鼠睪丸組織中自噬水平表現出明顯的下調，而何首烏飲可顯著改善這一情況，同時發現其可激活AMPK蛋白磷酸化水平并抑制mTOR的激活，初步證明了何首烏飲可通過AMPK-mTOR途徑調控腎精虧虛大鼠睪丸自噬.

自噬不僅調控生精細胞的精子發生進程，同樣對調控Leydig細胞的睪酮的產生和維持至關重要^［22］：激活Leydig細胞中自噬進程可增加類固醇生成急性調節蛋白的表達并促進睪酮生成^［23］；阻礙自噬可增強氧化應激并抑制睪酮的產生^［24］.同時，Leydig細胞的衰老在男性性腺功能衰退機制中起核心作用，隨著年齡的增長，Leydig 細胞的睪酮合成能力降低，從而導致血清睪酮水平與年齡相關的下降^［25］.而自噬與細胞衰老之間關系密切，伴隨著衰老進程，細胞自噬功能逐漸減弱，自噬小體形成減少，自噬溶酶體的融合也發生錯誤^［26］.同樣，作為細胞的自身保護性機制，自噬的增強可維持蛋白穩定性并調節代謝，減少衰老特征的發生，延緩細胞衰老進程^［27］.因此推測細胞自噬在男性Leydig 細胞衰老中起重要調控作用.筆者前期研究發現，何首烏飲可調控衰老大鼠睪丸組織衰老標志物 p53、p16 蛋白的表達；提高睪酮合成關鍵酶 p450scc 和 StAR 表達，促進睪酮合成；提高衰老大鼠精子質量^{［10，28］}；延緩Leydig 細胞衰老進程^［29］，但具體干預機制尚不明確.基于此，筆者采用自由基氧化損傷法建立原代Leydig細胞衰老模型，并給與何首烏飲含藥血清進行干預，同時采用AMPK抑制劑Compound C^［30］作用Leydig細胞，進一步探究何首烏飲是否通過激活Leydig細胞中AMPK-mTOR通路誘導自噬發揮功效.結果表明：何首烏飲可激活衰老Leydig細胞AMPK、抑制mTOR、上調自噬進程，但Compound C可明顯逆轉何首烏飲的作用功效，表明何首烏飲可能通過激活AMPK-mTOR通路介導細胞自噬，延緩間質細胞衰老進程.

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（責任編輯：梁俊紅）