人臍帶間充質干細胞源小細胞外囊泡通過抑制THBS1減輕糖尿病腎病大鼠腎臟損傷

［摘要］目的：探究人臍帶間充質干細胞來源小細胞外囊泡（hucMSCs derived small extracellular vesicles，hucMSC-sEVs）對糖尿病腎病（diabetic kidney disease，DKD）大鼠腎臟損傷的修復作用及可能機制。方法：分離培養hucMSCs并從培養上清液中提取hucMSC-sEVs。高脂聯合鏈脲佐菌素構建DKD大鼠模型，將大鼠隨機分為對照組、DKD組和hucMSC-sEVs組，每組6只，hucMSC-sEVs組在造模8周后進行尾靜脈注射hucMSC-sEVs，24周后收集腎組織。腎臟組織切片進行HE染色、過碘酸雪夫（PAS）染色和天狼星紅染色，觀察大鼠腎組織病理學改變和纖維化樣改變；蛋白質印跡檢測腎組織中凋亡相關蛋白Bcl-2和Bax表達；免疫組織化學染色、免疫熒光染色和蛋白質印跡檢測大鼠腎組織血小板反應蛋白1（THBS1）及其受體CD36和CD47的表達水平。結果：與對照組相比，DKD組大鼠腎臟發生明顯的病理改變，如腎小球基底膜增厚和系膜增生，腎小管擴張伴有空泡變性，間質發生明顯纖維化改變伴炎癥細胞浸潤，腎組織中Bax表達明顯增加（Plt;0.05），Bcl-2表達顯著下降（Plt;0.01），THBS1及其受體CD36和CD47的表達水平明顯增加（Plt;0.001）；與DKD組相比，hucMSC-sEVs組大鼠腎組織病理損傷和纖維化水平明顯緩解，Bax表達顯著下降（Plt;0.01），Bcl-2表達顯著增加（Plt;0.01），腎臟中THBS1及其受體CD36和CD47的表達水平顯著降低（Plt;0.001）。結論：HucMSC-sEVs可明顯減輕DKD腎組織損傷發揮保護作用，其機制可能與靶向抑制THBS1的表達有關。

［關鍵詞］人臍帶間充質干細胞；小細胞外囊泡；糖尿病腎病；血小板反應蛋白1

［中圖分類號］R587.2［文獻標志碼］A［文章編號］1671-7783（2024）06-0469-07

DOI： 10.13312/j.issn.1671-7783.y240087

［引用格式］單云潔，于洋，尹思琪，等. 人臍帶間充質干細胞源小細胞外囊泡通過抑制THBS1減輕糖尿病腎病大鼠腎臟損傷［J］. 江蘇大學學報（醫學版），2024，34（6）：469-475，484.

［基金項目］國家自然科學基金面上項目（82172102）；江蘇省重點研發計劃（社會發展）重點項目（BE2021689）

［作者簡介］單云潔（1999—），女，碩士研究生；錢暉（通訊作者），教授，博士生導師，E-mail： lstmmmlst@163.com

Human umbilical cord mesenchymal stem cell-derived small extracellular vesicles attenuate kidney damage in rats with diabetic nephropathy by inhibiting THBS1

SHAN Yunjie， YU Yang， YIN Siqi， QIAN Hui

（School of Medicine， Jiangsu University， Zhenjiang Jiangsu 212013， China）

［Abstract］Objective： To investigate the effect of human umbilical cord mesenchymal stem cell derived small extracellular vesicles （hucMSC-sEVs） in attenuating the damage of diabetic kidney disease （DKD） in rats. Methods： HucMSCs were isolated and cultured， and hucMSC-sEVs were extracted from the culture media supernatant. The DKD rat model was established by high fat diet combined with injection of streptozocin， rats were randomly divided into control group， DKD group， and hucMSC-sEVs group， with 6 rats in each group. The hucMSC-sEVs group received tail vein injection of hucMSC-sEVs 8 weeks after modeling， and kidney tissues were collected at week 24. Renal tissue pathology and fibrotic changes in rats were assessed using HE staining， PAS staining and Sirius Red staining. The expression of apoptosis-related proteins Bcl-2 and Bax in kidney tissues was evaluated using Western bloting. Additionally， the expression levels of THBS1 and its receptors CD36 and CD47 in rat renal tissues were determined using histochemical staining， immunofluorescence staining， and Western bloting. Results： Compared with the control group， the DKD group exhibited significant pathological changes in the kidneys， such as thickening of the glomerular basement membrane and mesangial proliferation， dilation of renal tubules accompanied by vacuolar degeneration， and marked interstitial fibrosis with infiltration of inflammatory cells. The expression of the apoptosis marker Bax in kidney tissues showed a significant increase （Plt;0.05）， while the expression of the anti-apoptotic marker Bcl-2 exhibited a significant decrease （Plt;0.01）. The expression levels of THBS1 and its receptors CD36 and CD47 were also significantly elevated （Plt;0.001）. In contrast， compared with the DKD group， the hucMSC-sEVs group demonstrated marked alleviation of renal tissue pathological damage and fibrosis. The expression of Bax significantly decreased （Plt;0.01）， while the expression of Bcl-2 significantly increased （Plt;0.01）. Additionally， the expression levels of THBS1 and its receptors CD36 and CD47 in the kidneys were significantly reduced （Plt;0.001）. Conclusion： HucMSC-sEVs can significantly reduce the renal tissue injury in DKD， which may be related to the targeted inhibition of THBS1 expression.

［Key words］human umbilical cord mesenchymal stem cells; small extracellular vesicles; diabetic kidney disease; THBS1

糖尿病腎病（diabetic kidney disease，DKD）是糖尿病微血管并發癥之一，也是導致終末期腎病（end-stage renal disease，ESRD）的主要原因，對個人和公共衛生系統造成巨大的經濟負擔^［1］。目前，DKD的治療主要依賴于改變生活方式以及藥物控制血糖、血壓和血脂。然而，長期服用這些藥物可能誘發嚴重的不良反應。因此，開發新的治療策略變得尤為重要。人臍帶間充質干細胞（human umbilical cord mesenchymal stem cells，hucMSCs）相較于其他來源的間充質干細胞（mesenchymal stem cells，MSCs），具有易獲取、無倫理爭議、增殖能力強、免疫原性低和多向分化潛能等特點^［2］。此外，hucMSCs來源的小細胞外囊泡（hucMSCs derived small extracellular vesicles，hucMSC-sEVs）富含多種生物活性物質，包括蛋白、核酸和脂質等，已成為細胞間通訊的重要介質^［3］。本研究團隊已經證實hucMSC-sEVs在心、肝、皮膚、腎、眼和胰腺等組織損傷中發揮良好的修復作用^［4-10］。前期研究發現hucMSC-sEVs在DKD大鼠模型中起到良好的降血糖作用，并促進足細胞自噬抑制Yes相關蛋白（Yes-associated protein，YAP）活性緩解DKD^［11］。然而，hucMSC-sEVs緩解DKD的潛在機制仍需進一步探索。

血小板反應蛋白1（thrombospondin-1，THBS1）是一種細胞外基質糖蛋白，它在細胞與基質間的相互作用中扮演著重要角色，尤其在細胞的黏附、遷移和凋亡等多種生物過程中發揮關鍵作用^［12］。過去關于THBS1的研究大多數集中在癌癥與炎癥中，近年研究發現其在代謝性疾病中也起到關鍵作用^［13］。然而，THBS1在DKD中的作用如何，hucMSC-sEVs能否通過調控THBS1發揮治療作用尚不清楚。因此，本研究聚焦于THBS1在DKD中的作用及其作為hucMSC-sEVs介導的治療效應的潛在靶點，探討其作用機制，為開發DKD治療新策略提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料

α-MEM培養基（美侖生物有限公司）；MSCs表面標志檢測試劑盒、成骨和成脂誘導分化試劑盒（賽業公司）；小鼠/兔IgG免疫組化試劑盒（美國博士德生物公司）；鏈脲佐菌素（STZ，美國Sigma公司）；45%高脂飼料（江蘇美迪森生物醫藥有限公司）；熱休克蛋白70（HSP70）、程序性細胞死亡6β相互作用蛋白（Alix）和鈣黏合素（Calnexin）抗體（美國CST公司）；腫瘤易感基因101（TSG101）、CD36、B淋巴細胞瘤-2（Bcl-2）和Bcl-2相關X蛋白（Bax）抗體（美國Proteintech公司）；THBS1和β-肌動蛋白抗體（美國Abclonal公司）；CD47抗體（中國優品生物公司）；HRP標記的羊抗兔二抗和羊抗小鼠二抗（美國Invitrogen公司）；FITC標記的羊抗兔二抗（美國SAB公司）。

流式細胞分析儀（美國BD公司）；倒置熒光顯微鏡（德國Leica公司）；透射電子顯微鏡（日本日立HT-7800）；納米顆粒跟蹤分析儀（德國Particle Metrix）；LAS 4000化學發光曝光儀（美國GE公司）；血糖儀及血糖試紙（德國羅氏公司）。

1.2 HucMSCs與hucMSC-sEVs的分離與鑒定

1.2.1 HucMSCs的培養與鑒定 本研究經江蘇大學醫學倫理委員會（2020161）和鎮江市婦幼保健院醫學倫理委員會（201701）批準。新鮮臍帶標本來源于鎮江市婦幼保健院，按本課題組先前建立的方法從中分離獲得原代hucMSCs^［9］。用胰蛋白酶收集原代細胞，進一步擴增傳代。

成骨和成脂誘導：選擇第3代生長狀態良好的hucMSCs，以2×10⁵個/孔細胞接種于培養板中，按照成骨和成脂誘導分化試劑盒說明書操作，待鏡下觀察發現有大量鈣結節和脂滴時，分別進行茜素紅S和油紅O染色，鏡下觀察染色情況并拍照。

流式細胞術鑒定表面標志物：選擇第3代生長狀態良好的hucMSCs，消化細胞并重懸使其濃度為3×10⁶個/mL，按照MSCs表面標志檢測試劑盒說明書操作，最終將結合抗體的細胞重懸，使用流式細胞儀檢測細胞表面標志物。MSCs陽性標志物為CD166、CD73，陰性標志物為CD11b、CD34和CD45。

1.2.2 HucMSC-sEVs的提取與鑒定 收集第3～8代生長狀態良好的hucMSCs培養上清液，通過超濾聯合超速離心法從中提取hucMSC-sEVs。具體步驟如下：收集的上清液通過500×g離心10 min、2 000×g離心30 min和10 000×g離心30 min以去除完整細胞、死細胞和細胞碎片。將上清液轉移至超濾離心管，2 000×g離心30 min進行濃縮。將濃縮液于100 000×g超速離心3 h，沉淀即為sEVs，PBS重復洗滌一次，100 000×g超速離心3 h，適量PBS溶解sEVs沉淀，通過0.22 μm濾器過濾除菌后分裝并儲存在－80 ℃備用。

透射電子顯微鏡觀察sEVs的形態，納米顆粒追蹤分析儀檢測sEVs的大小和數量。蛋白質印跡實驗檢測sEVs的表面標志蛋白TSG101、Alix、HSP70和Calnexin等。抗體稀釋比例均為1∶500。

1.3 動物實驗

1.3.1 DKD大鼠模型構建 本研究獲得江蘇大學實驗動物倫理委員會的批準（2020161）。從江蘇大學實驗動物中心購買8周齡的雄性SD大鼠，體重200～250 g。高脂飲食聯合STZ建立DKD大鼠模型，將大鼠隨機分為對照組、DKD組和hucMSC-sEVs組，每組6只。對照組普通飼料喂養，而DKD組使用45%高脂飲食喂養5周后，尾靜脈注射STZ（35 mg/kg），3 d后空腹血糖超過16.7 mmol/L即造模成功。hucMSC-sEVs組在造模8周后進行尾靜脈注射hucMSC-sEVs（1×10¹¹粒子數/kg），配合血糖監測。在第24周處死各組大鼠收集腎組織備用，進行后續實驗。

1.3.2 HE、過碘酸雪夫（PAS）、天狼星紅染色 腎組織石蠟切片置于65 ℃烘片6～8 h；然后按照步驟依次浸泡二甲苯（Ⅰ和Ⅱ）30 min、乙醇（濃度由高至低）3 min進行脫蠟至水。行HE染色、PAS染色和天狼星紅染色。

1.3.3 免疫組織化學染色檢測腎組織THBS1、CD36和CD47的表達 腎組織石蠟切片脫蠟步驟同“1.3.2”。3%H₂O₂室溫孵育15 min，滅活內源性酶，組化PBS洗滌3次；0.01 mol/L枸櫞酸鹽緩沖液蒸煮30 min進行熱修復抗原，洗滌3次；5%BSA室溫封閉1 h，隨后孵育一抗，將THBS1、CD36和CD47抗體按照1∶100的稀釋比例孵育在腎組織區域，4 ℃孵育過夜；洗滌3次，滴加二抗，37 ℃ 30 min，洗滌；滴加鏈霉親和素-生物素-過氧化物酶復合物，37 ℃ 30 min，洗滌；最后，滴加DAB顯色液，待出現棕黃色陽性區域，蒸餾水洗滌以終止反應；蘇木素染核40 s，流水沖洗，脫水透明處理，中性樹脂封片，待晾干后顯微鏡下觀察并拍照。

1.3.4 免疫組織熒光染色檢測THBS1表達 腎組織石蠟切片脫蠟及孵育一抗同“1.3.3”，將THBS1抗體按照1∶100的稀釋比例孵育在腎組織區域，洗滌3次；FITC標記的羊抗兔熒光二抗按照1∶300的稀釋比例進行避光孵育1 h，洗滌3次；Hoechst按照1∶300的稀釋比避光染核10 min，洗滌3次；抗熒光淬滅劑封片后，倒置熒光顯微鏡下觀察并拍照。

1.3.5 蛋白質印跡法檢測腎組織凋亡相關指標、THBS1、CD36和CD47的表達 將腎組織液氮研磨并加入RIPA裂解液，渦旋振蕩1 min，冰上靜置10 min，重復操作3次。4 ℃ 12 000×g離心15 min，小心吸取上清液（即總蛋白樣本），加入1/3體積的4×蛋白緩沖液，混勻后煮沸10 min，冰上冷卻。配置12% SDS-PAGE分離膠，以180 μg上樣。80 V恒壓電泳，350 mA恒流轉膜2 h，5%脫脂奶粉封閉1 h后孵育一抗，4 ℃過夜，TBST洗滌。加入相應種屬的二抗室溫孵育1 h，洗滌。所用抗體及稀釋倍數：Bcl-2、Bax、THBS1和CD47（均1∶500），CD36（1∶1 000）和二抗（1∶4 000）。

1.4 統計學分析

應用GraphPad Prism 9.0軟件進行統計學分析。所有符合正態分布計量資料均采用均數±標準差表示，多組均數比較采用單因素方差分析，Turkey檢驗進行進一步兩兩比較。Plt;0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 HucMSCs的分離培養與鑒定

貼壁法培養臍帶組織塊10 d后，顯微鏡下觀察組織塊附近可見長梭形細胞，此為第1代hucMSCs。消化傳代后，第3代細胞能穩定傳代并呈現魚群樣生長。取第3代hucMSCs進行成骨成脂誘導，茜素紅S染色可見細胞內出現大量紅色鈣結節，油紅O染色顯示細胞內出現典型的紅色脂滴，表明分離得到的hucMSCs具有多向分化潛能。流式細胞術結果顯示hucMSCs高表達典型的MSCs表面標志CD73和CD166，而低表達陰性標志物如CD11b、CD45和CD34。見圖1。

2.2 HucMSC-sEVs的提取與鑒定

差速超速離心法從hucMSCs培養上清液中分離純化得到hucMSC-sEVs。納米顆粒追蹤分析結果顯示，hucMSC-sEVs的平均粒徑為177.1 nm。透射電子顯微鏡觀察可見，hucMSC-sEVs形態呈圓盤狀，并有完整的膜性囊泡狀結構。蛋白質印跡結果顯示hucMSC-sEVs高表達sEVs的標志蛋白Alix、HSP70和TSG101，而不表達陰性標志物Calnexin。見圖2。

2.3 HucMSC-sEVs減輕DKD大鼠腎臟損傷和纖維化

為了鑒定DKD大鼠模型是否構建成功以及hucMSC-sEVs的干預效果，用HE染色、PAS染色和天狼星紅染色對腎組織切片的病理狀態進行評估。HE和PAS染色結果顯示，對照組大鼠腎組織結構正常，DKD組大鼠腎組織發生明顯的病理性改變，包括腎小球基底膜增厚和系膜基質增生，腎小管擴張伴明顯空泡樣變性，間質出現大量炎性細胞浸潤。天狼星紅染色結果顯示，DKD組大鼠腎組織中呈現大量紅色染色的膠原纖維沉積。而在hucMSC-sEVs干預后，DKD大鼠腎組織結構損傷得到明顯改善，腎組織間質的纖維化程度減輕。見圖3。

2.4 HucMSC-sEVs降低DKD大鼠腎臟組織中細胞凋亡水平

蛋白質印跡結果顯示，與對照組相比，DKD組大鼠腎臟細胞促凋亡指標Bax表達明顯增加（Plt;0.05），抗凋亡指標Bcl-2表達顯著下降（Plt;0.01）；而hucMSC-sEVs組較DKD組Bax顯著下降（Plt;0.01），Bcl-2顯著增加（Plt;0.01）。見圖4。

2.5 HucMSC-sEVs抑制DKD大鼠腎臟組織中THBS1的表達

分析課題組前期研究中對照組、DKD組和hucMSC-sEVs組大鼠腎臟組織的單細胞轉錄組測序數據，結果顯示DKD組大鼠腎小管上皮細胞中THBS1基因表達上調，而hucMSC-sEVs干預后THBS1基因表達下調。蛋白質印跡結果顯示DKD組大鼠腎臟中THBS1的蛋白表達顯著增加（Plt;0.001），hucMSC-sEVs干預后明顯降低（Plt;0.001）。此外，免疫組織化學染色與組織免疫熒光染色檢測結果顯示，DKD組大鼠腎組織THBS1表達較對照組增加，且主要表達在腎小管中，而hucMSC-sEVs干預后THBS1顯著下降。見圖5。

2.6 HucMSC-sEVs抑制DKD大鼠腎臟組織中CD36和CD47的表達

免疫組織化學染色結果顯示，與對照組相比，DKD組大鼠腎臟組織中CD36和CD47棕黃色顆粒明顯增多，而hucMSC-sEVs組中CD36和CD47棕黃色顆粒減少。蛋白質印跡結果顯示，DKD組大鼠腎臟組織中CD36和CD47的表達水平較對照組顯著增加（Plt;0.001），而hucMSC-sEVs干預后CD36和CD47的表達水平顯著下降（Plt;0.001）。見圖6。

3 討論

DKD是糖尿病患者的微血管并發癥之一，主要是由高血糖和腎小球高壓驅動多種致病過程，導致腎功能逐漸喪失，最終發展為ESRD^［14］。由于DKD的發病機制復雜，缺乏特異有效的干預目標，許多常規治療方法如阻斷腎素-血管緊張素-醛固酮系統和控制血糖血壓水平，在臨床實踐中往往不能產生令人滿意的結果^［15］。因此，尋找新的治療DKD的方法已迫在眉睫。

隨著再生醫學和組織工程技術的發展，無細胞療法掀開了醫學領域的新篇章。研究表明，MSCs通過旁分泌機制在組織損傷修復中起關鍵作用，在這一過程中，細胞外囊泡是MSCs釋放的核心成分，參與細胞存活、免疫調節、血管新生和組織再生等重要生理和病理過程^［16］。有研究表明，相比于牙髓源MSCs和脂肪組織來源MSCs，hucMSCs在糖代謝調節方面表現出更優異的療效^［17］。HucMSC-sEVs不僅繼承了hucMSCs的治療功能，如修復再生、抑制炎癥和免疫調節等，還避免了MSCs的致瘤和致畸風險，以及歸巢效率低下等問題^［18］。以sEVs為媒介的無細胞治療策略，攜帶治療性蛋白質和RNA分子，展現了在糖尿病及其并發癥治療領域中廣闊的前景和吸引力^［19］。在本研究中，我們成功從hucMSCs中分離純化得到高生物活性的hucMSC-sEVs，為進一步實驗奠定了基礎。同時，本研究成功建立了DKD大鼠模型，并觀察到hucMSC-sEVs能夠減輕基底膜增厚，緩解腎小球硬化，以及減少腎臟膠原纖維沉積和炎癥細胞浸潤，這些結果提示hucMSC-sEVs具有明顯緩解腎臟結構損傷和抗纖維化的作用，從而保護腎臟功能。

為了進一步探索hucMSC-sEVs緩解DKD的作用機制，我們分析了課題組前期研究中DKD大鼠腎臟組織的單細胞轉錄組測序數據，發現THBS1分子在hucMSC-sEVs保護DKD大鼠腎臟損傷中起到重要作用，很可能是hucMSC-sEVs介導的治療效應的潛在靶點，本研究通過體內實驗進行了驗證。THBS1在多種生理和病理過程中發揮重要作用，包括血栓形成、血管生成、腫瘤發生、炎癥、細胞凋亡和纖維化^［20］。最近的研究表明，THBS1及其受體與肥胖、糖尿病和心血管疾病等代謝性疾病聯系密切。THBS1能夠激活轉化生長因子-β（TGF-β），與受體CD36和CD47相互作用，在細胞代謝中發揮重要作用^［13］。有研究表明，THBS1-CD47信號傳導促進了長期脂質誘導的腎損傷纖維化^［21］。在飲食誘導的肥胖小鼠模型中，THBS1拮抗劑治療可以顯著減輕肥胖誘導的慢性炎癥和代謝紊亂^［22］。本研究結果顯示，相比于對照組，DKD組大鼠腎臟THBS1及其受體CD36和CD47的表達顯著增加，而hucMSC-sEVs干預后THBS1及其受體CD36和CD47的表達顯著下降；此外，hucMSC-sEVs抑制了腎臟細胞中的凋亡水平。由此提示hucMSC-sEVs可能通過調控THBS1-CD36和THBS1-CD47來緩解腎臟細胞凋亡和損傷，從而發揮治療作用。

綜上所述，本研究證實hucMSC-sEVs具有緩解DKD腎臟損傷和纖維化作用，可能是通過抑制THBS1表達實現的。hucMSC-sEVs是一種潛在的治療策略，可用于緩解長期高血糖環境引起的腎臟損傷，這為DKD的治療提供了新的方向。然而，THBS1在促進DKD進展中的具體作用以及hucMSC-sEVs靶向抑制THBS1的機制，仍需要進一步研究。

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［收稿日期］2024-05-10［編輯］何承志