基于前列腺癌骨轉移BMP相關差異表達基因預測前列腺癌患者的轉移復發

［摘要］目的：基于生物信息學方法構建預測前列腺癌（PCa）骨轉移的預后風險模型，探究風險評分對預后和免疫浸潤的影響。方法：從基因表達公共數據庫（GEO）下載PCa患者的臨床資料和微陣列表達數據，分子特征數據庫（MSigDB）下載骨形成蛋白（BMP）通路相關基因。通過差異分析篩選出PCa骨轉移樣本與原發性PCa樣本的差異表達基因（differential expression genes，DEGs），與BMP通路相關基因取交集得到BMP相關DEGs，通過LASSO回歸分析篩選風險基因構建預后風險模型，多因素Cox回歸分析篩選PCa獨立預后因素。根據風險模型計算患者的風險評分，并以中位值分為高危組和低危組，識別DEGs進行功能富集分析，比較高危、低危組間的免疫浸潤差異。結果：從3 055個PCa骨轉移樣本中的DEGs與BMP相關基因集取交集后得到13個BMP相關DEGs，通過LASSO回歸篩選出4個基因標簽構建預后風險模型，其中分泌型卷曲相關蛋白2（SFRP2）、內皮糖蛋白（ENG）、卵泡素樣蛋白1（FSTL1）是風險基因，脊索素樣蛋白1（CHRDL1）是保護基因。根據風險評分中位值（7.3）將PCa患者分為高危和低危組，Kaplan-Meier分析顯示高危組患者無轉移生存期及無生化復發生存期明顯低于低危組患者。高危組患者更容易發生骨轉移和生化復發，且風險評分與前列腺特異性抗原（PSA）值、Gleason評分及T分期呈正相關。高危組上調基因主要參與WNT/BMP信號通路的激活，明顯富集在上皮細胞增殖、細胞外基質等生物過程；GSEA分析顯示，差異基因在間充質轉化、炎癥反應、血管生成以及多個腫瘤轉移基因集中上調。免疫浸潤分析顯示高危組患者擁有更高的免疫細胞浸潤程度、腫瘤相關成纖維細胞（CAFs）、巨噬細胞、Estimate評分、基質評分及免疫評分，而腫瘤純度低于低危組。結論：基于LASSO回歸分析構建的BMP相關DEGs預后風險模型能夠有效預測PCa骨轉移發生，且高風險評分與PCa患者預后和免疫浸潤密切相關。

［關鍵詞］前列腺癌；骨轉移；BMP信號通路；預后風險模型；免疫浸潤

［中圖分類號］R737.25［文獻標志碼］A［文章編號］1671-7783（2024）06-0522-10

DOI： 10.13312/j.issn.1671-7783.y240031

［引用格式］邱蘜，胡建鵬. 基于前列腺癌骨轉移BMP相關差異表達基因預測前列腺癌患者的轉移復發［J］. 江蘇大學學報（醫學版），2024，34（6）：522-531，541.

［基金項目］江蘇省衛生健康委科研項目（M2021038）

［作者簡介］邱蘜（1998—），男，碩士研究生；胡建鵬（通訊作者），副主任醫師，E-mail： 249056614@qq.com

Prediction of metastatic and recurrence in prostate cancer patients based on

BMP-related differential gene in prostate cancer bone metastases

QIU Ju， HU Jianpeng

（Department of Urology， the Affiliated People’s Hospital of Jiangsu University， Zhenjiang Jiangsu 212002， China）

［Abstract］Objective： To construct a prognostic risk model for predicting bone metastasis in prostate cancer （PCa） based on bioinformatics approach， and to investigate the effect of risk score on prognosis and immune infiltration. Methods： Clinical information and microarray expression data of PCa patients were downloaded from the Gene Expression Omnibus （GEO）， and genes related to the bone morphogenetic protein （BMP） pathway were downloaded from the Molecular Signature Database （MSigDB）. The differential expression genes （DEGs） of PCa bone metastasis samples and primary PCa samples were screened by differential analysis， and the intersection with BMP pathway-related genes was taken to obtain BMP-related DEGs， and the prognostic risk model was constructed by screening risk genes through LASSO regression analysis， and independent prognostic factors of PCa were screened by multifactorial regression analysis. The risk scores of patients were calculated according to the risk model and subsequently divided into two groups of high and low risk scores by corresponding score median values， and DEGs were identified for functional enrichment analysis to compare the differences in immune infiltration between high and low risk groups. Results： After the intersection of DEGs and BMP-related gene sets in 3 055 differentially expressed genes of PCa bone metastasis samples， 13 BMP-related DEGs were obtained. Four gene were screened by LASSO regression to construct a prognostic risk model， in which secreted frizzled-related proteins 2 （SFRP2）， endoglin （ENG）， and follistatin-like protein 1 （FSTL1） were risk genes and chordin like 1 （CHRDL1） was a protective gene. Kaplan-Meier analysis showed that metastasis-free survival and biochemical recurrence-free survival of patients in the high-risk group were significantly lower than that of patients in the low-risk group. Multifactorial regression analysis identified risk score as an independent prognostic factor for PCa bone metastasis， and patients in the high-risk group were more likely to develop bone metastasis and biochemical recurrence， and the risk score was positively correlated with the PSA value， the Gleason score， and the T stage. The DEGs of high-risk group were mainly involved in the activation of the WNT/BMP signaling pathway， and were significantly enriched in the proliferation of epithelial cells and extracellular matrix bioprocesses. GSEA analysis showed that， the differentially expressed genes were up-regulated in the gene sets of mesenchymal transition， inflammatory response， angiogenesis， and multiple tumor metastasis gene sets. Immune infiltration analysis showed that PCa bone metastasis samples and patients in the high-risk group possessed a higher degree of immune cell infiltration， cancer associated fibroblasts （CAFs）， macrophages， Estimate scores， stromal scores， and immune scores than the low-risk group， and lower tumor purity than the low-risk group. Conclusion： The prognostic risk model of BMP-related DEGs constructed based on the LASSO regression analysis can effectively predict the occurrence of PCa bone metastasis， and the high-risk score is closely related to the prognosis and immune infiltration of PCa.

［Key words］prostate cancer; bone metastasis; BMP signaling pathway; prognostic risk model; immune invasion

前列腺癌（prostate cancer，PCa）是美國男性中最常見的惡性腫瘤，死亡率排名第二^［1］。中國PCa的發病率以每年12%的增速逐漸上升。早期局限性PCa預后通常較好，而晚期PCa預后較差，經常在化療、手術和放療后轉移，5年生存率僅為32%^［2］。每年死于PCa的患者中大多數表現出轉移性疾病，骨骼是最常見的轉移部位。10%～20%的PCa患者在診斷時就已經發生骨轉移，晚期PCa患者骨轉移的發生率高達90%。PCa骨轉移可引起破壞性的并發癥，包括病理性骨折、脊柱壓迫和骨痛等骨骼相關事件，不僅嚴重影響患者生活質量，還會導致死亡風險升高^［3］。PCa骨轉移患者目前主要治療方法包括雄激素剝奪療法、抗骨吸收劑、放療和化療，以幫助控制癌癥的擴散，但幾乎沒有干預措施可用于治療PCa導致的成骨性病變。除轉移外，PCa生化復發也是影響預后的重要因素，生化復發會導致PCa發生臨床轉移、進展和死亡的風險增加，早發現生化復發可以盡早進行干預，進而降低死亡風險^［4］。

雖然骨形態發生蛋白（bone morphogenetic proteins，BMPs）的許多腫瘤抑制功能已被發現，但在PCa中，BMPs在腫瘤和周圍間質中起腫瘤促進因子的作用。近年來有研究發現靶向BMP通路可誘導PCa成骨性病變^［5］。已有許多研究報道了基于鐵死亡相關基因^［6］、炎癥相關基因^［7］、自噬相關基因^［8］等建立PCa的預后風險模型，但目前尚未有基于BMP相關基因構建模型預測PCa骨轉移的相關報道。本研究通過生物信息學方法分析BMP相關基因表達與PCa骨轉移之間的關系，構建基于BMP相關基因PCa骨轉移預后風險模型，預測PCa骨轉移，為晚期PCa的治療提供新思路。

1 資料與方法

1.1 數據來源

基于基因表達公共數據庫（Gene Expression Omnibus，GEO）獲取PCa微陣列表達數據集GSE116918、GSE77930、GSE32269的基因表達和臨床相關數據，其中GSE116918包含PCa骨轉移樣本22例，原發性PCa樣本226例；GSE77930包含PCa骨轉移樣本20例，原發性PCa樣本22例；GSE32269包含PCa骨轉移樣本22例，原發性PCa樣本55例。從MSigDB數據庫獲得GOBP_REGULATION_OF_BMP_SIGNALING_PATHWAY基因集，其中包含了118個BMP相關基因。

1.2 篩選BMP通路相關差異表達基因

通過R studio軟件（4.0.3版）中的Limma包對GSE116918、GSE77930、GSE32269芯片的原始數據進行標準化處理，獲得基因表達矩陣和相關臨床信息。GSE77930包含PCa骨轉移樣本20例，原發性PCa樣本22例，以假陽性發現率（1 positive discovery rate，FDR）校正后Plt;0.05，|log₂（FC）|gt;1（FC為差異倍數）為標準，篩選出符合條件的差異表達基因（different expression genes，DEGs），進一步提取BMP相關基因與骨轉移樣本DEGs取交集得到BMP相關 DEGs，最后通過pheatmap、ggplot2數據包進行可視化處理。

1.3 基于BMP相關DEGs骨轉移風險模型構建與評估

應用glmnet數據包基于BMP相關DEGs進行LASSO回歸分析，以骨轉移事件發生作為結局指標，得到4個關鍵基因及其風險系數，包括卵泡素樣蛋白1（follistatin-like protein 1，FSTL1）、分泌型卷曲相關蛋白2（secreted frizzled-related proteins 2，SFRP2）、內皮糖蛋白（endoglin，ENG）、脊索素樣蛋白1（chordin like 1，CHRDL1）。基于LASSO回歸分析結果構建風險預測模型，風險評分=exp（FSTL1）×β_FSTL1+exp（SFRP2）×β_SFRP2+exp（ENG）×β_ENG+exp（CHRDL1）×β_CHRDL1；其中，exp為基因表達矩陣中每個樣本對應基因的表達水平，β為LASSO回歸系數。根據風險評分的中位值將數據集GSE116918中的PCa患者分為高危組和低危組，使用Kaplan-Meier方法進行生存分析，評估無轉移生存、無生化復發生存與風險評分的相關性。在數據集GSE116918中，利用pROC數據包評估風險預測模型對PCa患者骨轉移和生化復發的診斷效能，通過timeROC數據包進行1、3、5年無轉移生存時間的ROC分析以評估風險預測模型的效能。最后在外部數據集GSE32269和GSE77930中，通過pROC數據包評估風險預測模型對PCa患者發生骨轉移的診斷效能。

1.4 骨轉移風險模型臨床價值分析

將BMP相關DEGs、風險評分及臨床特征納入多因素Cox回歸分析，識別與PCa骨轉移相關的獨立風險因素。通過ggplot數據包將風險評分與不同臨床特征間的關系進行可視化處理，兩組間差異采用兩獨立樣本t檢驗進行分析。

1.5 風險評分差異基因功能富集分析

利用Limma包進一步識別高危組與低危組間的DEGs，通過clusterprofiler包對高危組上調DEGs進行基因本體（gene ontology，GO）富集分析。隨后，基于DEGs進行基因富集分析（gene set enrichment analysis，GSEA），利用從分子特征數據庫（http：//www.gsea-msigdb.org）中獲得的HALLMARK、C2基因集進行注釋。

1.6 腫瘤免疫微環境分析

通過免疫浸潤及免疫檢查點分析來評估PCa患者腫瘤免疫微環境（tumor immune microenvironment，TIME），首先通過單樣本基因集富集分析（single sample gene set enrichment analysis，ssGSEA）評估高、低危組的免疫細胞浸潤豐度，進一步分析免疫檢查點基因在兩組中的表達。GSE116918的TIME參數使用EPIC（estimate the proportion of immune and cancer cells）算法和ESTIMATE（estimation of stromal and immune cells in malignant tumor tissues using expression data）算法進行評分。研究流程如圖1所示。

2 結果

2.1 PCa骨轉移DEGs篩選

基于GSE77930數據集識別人骨轉移與原發性PCa樣本之間的DEGs，共篩選得到3 055個DEGs，其中1 916個為上調基因，1 139個為下調基因，通過火山圖展現上調最顯著和下調最顯著的各10個DEGs分布（圖2A），標注出了差異表達最顯著的前20個基因，并繪制DEGs熱圖（圖2B）。將118個BMP相關基因與DEGs取交集，得到13個BMP相關DEGs（圖2C），分別為FSTL1、GATA結合蛋白6（GATA6）、SFRP2、腫瘤壞死因子α誘導蛋白6（TNFAIP6）、骨硬化蛋白（SOST）、泛素結合酶E2O（UBE2O）、CHRDL1、長鏈非編碼RNA KCNQ1重疊轉錄物1（KCNQ1OT1）、SMAD家族成員4（SMAD4）、多重剪接RNA結合蛋白2（RBPMS2）、ENG、核有絲分裂器蛋白1（NUMA1）、神經源性基因Notch同源蛋白1（NOTCH1），見圖2D。

2.2 BMP相關DEGs構建風險模型與驗證

為發現與PCa患者骨轉移風險相關的基因，基于GSE116918數據集對BMP相關DEGs進行LASSO回歸分析。將是否出現骨轉移事件設置為二進制相應變量，得到選擇懲罰系數λ的最佳值和納入風險模型的基因。其中風險基因包括FSTL1、SFRP2、ENG以及CHRDL1，風險評分的計算公式為：風險評分=0.332 903×exp（FSTL1）+0.643 426×exp（SFRP2）+0.579 216×exp（ENG）－0.466 973×exp（CHRDL1），通過4個風險基因在GSE116918數據集PCa患者中的表達水平計算每個PCa患者的風險評分（圖3A、B）。根據風險評分值將GSE116918數據集中的PCa患者排序并繪制散點圖，圖3C展示了248例PCa患者風險評分分布情況及風險評分中位值（7.3）。

根據風險評分中位值7.3將GSE116918數據集中的PCa患者分為高危、低危組，每組包含124例患者，其中高危組患者發生骨轉移及生化復發的風險較高（Plt;0.05，圖4A-B）。風險評分對骨轉移和生化復發有一定的診斷準確性（圖5A）。通過時間依賴性ROC分析計算了風險模型第1、第3和第5年無轉移生存期的AUC值分別為0.995、0.969、0.783，證明風險模型對PCa骨轉移的預測效果良好（圖5B）。使用外部數據集GSE32269和GSE77930分別繪制ROC曲線，提示風險模型在這兩個數據集中預測骨轉移發生具有一定的準確性（圖5C-D）。結果表明通過LASSO回歸分析構建的PCa骨轉移風險預測模型可以有效預測PCa骨轉移和生化復發風險。

2.3 風險評分臨床預后價值分析

進一步對GSE116918數據集中的248例PCa患者進行多因素Cox回歸分析，提示FSTL1、SFRP2及CHRDL1是PCa患者骨轉移的獨立預測因子（Plt;0.05，圖6A）。將風險評分與臨床預后特征納入多因素Cox分析，分析結果顯示風險評分是PCa患者骨轉移的獨立影響因素（圖6B）。使用小提琴圖展示風險評分與臨床特征的關系，結果顯示發生生化復發的患者擁有更高的風險評分，格里森評分和T分期越高的患者往往擁有更高的風險評分；與低危組相比，高危組患者擁有更高的PSA水平；見圖7。

2.4 高危與低危組間DEGs功能富集分析

對高危組上調的DEGs進行GO富集分析，結果顯示這些DEGs顯著富集在上皮細胞增殖、細胞外基質（extra cellular matrix，ECM）組織、細胞外結構組織、跨膜受體蛋白/蘇氨酸激酶信號通路、軟骨發育等生物學過程（圖8A）。使用GSEA進行KEGG富集分析，結果顯示高危組上調的DEGs與原發性免疫缺陷、移植物抗宿主病、同種異體移植排斥反應、抗原處理和呈遞、細胞黏附分子、細胞周期、細胞因子受體相互作用、Toll樣受體信號通路及ECM受體相互作用等通路正相關（圖8B）。在HALLMARK基因集中，高危組上調的DEGs與異體移植排斥反應、上皮間充質轉化、G2m檢查點、E2f靶點、炎癥反應及血管生成等基因集正相關（圖8C）。在C2基因集中，高危組上調的DEGs與許多轉移相關基因集正相關，如繼發性結直腸肝轉移瘤、遠處轉移黑色素瘤、肝內轉移性肝細胞癌及源于前列腺組織的轉移性基質細胞基因集中的上調基因（圖8D）。

2.5 腫瘤免疫微環境探究

為了探究高危、低危組的TIME差異，首先利用ssGSEA算法評估PCa骨轉移患者各種免疫細胞的浸潤程度，結果表明，與低危組相比，高危組患者TIME中活化CD4T細胞、活化CD8T細胞、活化樹突狀細胞、CD56dim自然殺傷細胞、中央記憶CD8T細胞、效應記憶CD8T細胞、嗜酸粒細胞、γ-δT細胞、未成熟B細胞、巨噬細胞、髓系抑制性細胞、記憶B細胞、自然殺傷T細胞、漿細胞樣樹突狀細胞、調節性T細胞、濾泡輔助T細胞、17型T輔助細胞免疫浸潤程度更高，而肥大細胞浸潤程度較低（圖9A）。免疫檢查點分析顯示高危組和骨轉移組的PDCDILG2（即PD-L2）mRNA表達明顯升高（圖9B-C）。進一步基于EPIC及ESTIMATE算法評估PCa患者TIME相關參數，并探討這些參數與風險評分之間的相關性。如圖10所示，高危組中腫瘤相關成纖維細胞（cancer associated fibroblasts，CAFs）、巨噬細胞、基質評分、免疫評分、ESTIMATE評分顯著高于低危組，而腫瘤純度則顯著低于低危組。

3 討論

骨骼是PCa最常見的轉移部位，一旦發生骨轉移，患者的生存率就會明顯降低^［9］。一方面，目前骨轉移的診斷多需要結合全身骨顯像檢查^［10］，PSA水平較低的患者往往不能夠全面檢查^［11］；另一方面，目前PCa骨轉移的治療主要為姑息性治療，并無針對骨轉移的特異性療法^［12］。鑒于鑒別轉移狀態的重要性以及目前臨床和放射學指標的局限性，開發一種風險預測模型早期評估判定骨轉移并進行干預對于提高PCa患者預后及降低死亡率具有重要作用。生物信息學的廣泛應用，為研究PCa骨轉移的發生機制，尋找新的診斷預測因子及治療靶點提供了快速而有效的方法^［13］。

BMP通路是TGF-β信號家族的成員，在腫瘤的發生發展中具有復雜的作用。BMPs作為腫瘤啟動子還是抑制子發揮作用似乎主要基于癌細胞和周圍微環境的背景，包括巨噬細胞和中性粒細胞在內的髓樣細胞已被證明在受到BMP刺激時會促進腫瘤發展^［14］。在小鼠PCa模型中骨髓細胞內BMPR1a的條件性缺失限制了腫瘤的進展^［15］，這表明在PCa進展過程中骨髓細胞內BMP信號傳導的獨特必要性。因此，本研究首先篩選出在PCa骨轉移樣本中差異表達的BMP相關基因，并進一步通過LASSO回歸分析成功構建PCa患者骨轉移的風險預后模型，模型中包含的4個基因（SFRP2、ENG、FSTL1、CHRDL1）尚未在PCa中得到充分研究。SFRP2同時參與骨形態發生（GO：0060349）和成骨細胞分化（GO：0001649），可能是骨轉移的潛在調控因子。研究發現在PCa細胞系PC3中過表達SFRP2可誘導上皮間充質轉化，并促進成骨樣表型的轉錄組變化^［16］。有研究發現血漿可溶性ENG升高與PCa患者的無復發生存期有關，而患者血漿中的ENG水平與細胞ENG表達呈負相關，這證明了細胞ENG的促腫瘤能力^［17］。雄激素受體和黑色素瘤抗原A-11協同上調FSTL1，促進去勢抵抗性PCa的生長進展^［19］。CHRDL1是一種BMP拮抗劑^［20］，與乳腺癌^［21］、肺癌^［22］、胃癌^［23］和口腔鱗狀細胞癌^［24］等多種癌癥相關。

本研究基于風險評分中位值將PCa患者分為高危、低危兩組。生存分析結果顯示，高危組患者更容易發生骨轉移和生化復發，ROC分析表明預后風險模型具有良好且可靠的預測準確性。多因素Cox回歸分析提示風險評分是PCa患者骨轉移的獨立危險因素，進一步分析臨床特征發現，發生生化復發的患者擁有更高的風險評分，格里森評分和T分期越高的患者往往擁有更高的風險評分，高危組患者擁有更高的PSA水平。這表明風險評分與PCa患者不良預后密切相關。骨轉移是PCa患者死亡的主要原因，生化復發是PCa患者預后不良的標志，并且與遠處轉移密切相關^［25］。本研究的預后風險模型能有效地預測PCa患者骨轉移及生化復發，且根據模型計算而得的風險評分與PCa患者不良預后特征密切相關，因而有助于對PCa患者進行風險分層，為后續的臨床治療提供理論指導。

高危組上調基因GO富集分析結果顯示，這些DEGs顯著富集在上皮細胞增殖及ECM等生物學過程。GSEA分析表明，原發性免疫缺陷、異體移植排斥反應、上皮間充質轉化及血管新生可能參與了PCa的骨轉移。過去20年來，腫瘤領域一個令人驚訝的發現是腫瘤與其周圍環境之間的串擾，即TIME。TIME由周圍血管、免疫細胞、成纖維細胞、骨髓源性炎癥細胞、各種信號分子和ECM組成^［26］。在本研究中，我們發現高危組患者有更高的免疫細胞浸潤、CAFs和巨噬細胞浸潤水平以及基質評分，這些結果可能有助于確定不同的基質成分在PCa骨轉移中發揮作用的重要程度。在TIME中，一系列致癌改變促進反應性基質的形成，其特點是存在CAFs、ECM沉積改變、新生血管和免疫細胞浸潤^［27］。癌細胞轉移的起始與上皮間充質轉化過程的異常激活高度相關，上皮間充質轉化過程允許癌細胞從原發腫瘤擴散到周圍組織^［28］。值得注意的是，在CHRDL1沉默后的胃癌^［29］和乳腺癌細胞^［30］中也發現了上皮間充質轉化的激活。此外，本研究中在骨轉移組和高危組PD-L2表達均明顯升高，這提示PD-L2可能是PCa骨轉移的潛在免疫治療靶點。

本研究基于GEO及MSigDB數據庫，通過LASSO回歸分析建立了BMP相關基因的PCa患者骨轉移風險預測模型，進一步強調了CAFs、腫瘤相關巨噬細胞及TIME在PCa轉移過程中的重要性，為PCa骨轉移的早期識別和綜合治療提供了新思路。不可否認的是，基因表達特征受腫瘤內遺傳異質性造成的取樣偏差的影響；此外，不同腫瘤區域（如腫瘤核心區和浸潤邊緣區）的微環境特征也可能不同。本研究的所有發現還需要通過大樣本、多中心研究進一步進行外部驗證，從而探索更深層次的發病機制。

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［收稿日期］2024-03-01［編輯］何承志