基于單細(xì)胞測(cè)序探究去勢(shì)抵抗性前列腺癌腫瘤微環(huán)境及細(xì)胞間通訊相關(guān)信號(hào)分子

［摘要］目的：探究去勢(shì)抵抗性前列腺癌（castration-resistant prostate cancer，CRPC）的腫瘤微環(huán)境中相關(guān)信號(hào)分子，并分析其與腫瘤發(fā)生發(fā)展之間的關(guān)系。方法：通過(guò)基因表達(dá)綜合數(shù)據(jù)庫(kù)（Gene Expression Omnibus，GEO）中CRPC患者的單細(xì)胞RNA測(cè)序（scRNA-seq）數(shù)據(jù)（GSE137829），分析CRPC腫瘤微環(huán)境的主要組成成分；通過(guò)CellPhoneDB分析微環(huán)境中不同細(xì)胞間的相互作用，重點(diǎn)揭示腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞（cancer-associated fibroblasts，CAFs）與惡性上皮細(xì)胞之間的聯(lián)系；應(yīng)用CellChat分析CAFs與惡性上皮細(xì)胞通訊相關(guān)的信號(hào)分子，結(jié)合腫瘤基因組圖譜前列腺癌（TCGA-PRAD）的數(shù)據(jù)，尋找與CRPC患者預(yù)后密切相關(guān)的信號(hào)分子。使用siRNA在CRPC細(xì)胞中敲低相關(guān)信號(hào)分子Delta樣經(jīng)典Notch配體3（DLL3），并通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR、蛋白質(zhì)印跡實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證敲低效率。通過(guò)CCK8法、EdU實(shí)驗(yàn)以及Transwell和含有基質(zhì)膠的Transwell實(shí)驗(yàn)，探究DLL3對(duì)CRPC細(xì)胞增殖、遷移、侵襲等生物學(xué)行為的影響。單基因差異分析以及過(guò)表征富集分析（ORA）、基因集富集分析（GSEA）尋找DLL3相關(guān)差異表達(dá)基因富集的通路。結(jié)果：?jiǎn)渭?xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果表明，CRPC腫瘤微環(huán)境的主要細(xì)胞組成包括惡性上皮細(xì)胞、CAFs以及免疫細(xì)胞等。CAFs與惡性上皮細(xì)胞之間通過(guò)通訊相關(guān)信號(hào)分子相互作用實(shí)現(xiàn)緊密的通訊，共篩選出CAFs與惡性上皮細(xì)胞通訊密切相關(guān)的信號(hào)分子63個(gè)；單因素Cox回歸分析顯示關(guān)鍵信號(hào)分子腫瘤壞死因子相關(guān)配體超家族成員12（TNFSF12）以及DLL3轉(zhuǎn)錄本的表達(dá)與CRPC患者預(yù)后顯著相關(guān)，其中DLL3高表達(dá)與CRPC患者不良預(yù)后顯著相關(guān)。體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，敲低DLL3顯著抑制CRPC細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖、遷移和侵襲能力。KEGG和GSEA富集分析表明，DLL3相關(guān)差異表達(dá)基因在代謝相關(guān)通路中顯著富集。結(jié)論：腫瘤微環(huán)境中CAFs與惡性上皮細(xì)胞之間通過(guò)細(xì)胞間通訊相關(guān)信號(hào)分子實(shí)現(xiàn)緊密通訊，其中DLL3的表達(dá)與患者預(yù)后呈負(fù)相關(guān)，且影響CRPC細(xì)胞生物學(xué)行為，DLL3或是人CRPC惡性進(jìn)展的關(guān)鍵信號(hào)分子。

［關(guān)鍵詞］去勢(shì)抵抗性前列腺癌；單細(xì)胞測(cè)序；腫瘤微環(huán)境；細(xì)胞通訊；DLL3

［中圖分類號(hào)］R737.25［文獻(xiàn)標(biāo)志碼］A［文章編號(hào)］1671-7783（2024）06-0497-10

DOI： 10.13312/j.issn.1671-7783.y240003

［引用格式］朱孝仁，陳敏斌，姜鑒倬，等. 基于單細(xì)胞測(cè)序探究去勢(shì)抵抗性前列腺癌腫瘤微環(huán)境及細(xì)胞間通訊相關(guān)信號(hào)分子［J］. 江蘇大學(xué)學(xué)報(bào)（醫(yī)學(xué)版），2024，34（6）：497-506.

［基金項(xiàng)目］國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（82273055，82072712）

［作者簡(jiǎn)介］朱孝仁（1996—），男，博士研究生；劉媛媛（通訊作者），助理研究員，碩士生導(dǎo)師，E-mail： liuyuanyuansz@hotmail.com

Identification of tumor microenvironment and

intercellular communication-related signaling molecules of

castration-resistant prostate cancer based on single cell RNA sequencing

ZHU Xiaoren^1，2， CHEN Minbin^1，2， JIANG Jianzhuo^2，3， XUE Mengen⁴， LIU Yuanyuan^2，3

（1. Department of Radiotherapy and Oncology， Affiliated Kunshan Hospital of Jiangsu University， Kunshan Jiangsu 215300; 2. School of Medicine， Jiangsu University， Zhenjiang Jiangsu 212013; 3. Clinical Research amp; Lab Center， Affiliated Kunshan Hospital of Jiangsu University， Kunshan Jiangsu 215300; 4. Gusu School， Nanjing Medical University， Suzhou Jiangsu 215000， China）

［Abstract］Objective：To explore intercellular communication-related signaling molecules in tumor microenvironment （TME） of castration-resistant prostate cancer （CRPC） and analyze their relationship with tumor occurrence and development. Methods：The main components of the TME in CRPC was analyzed using single-cell RNA sequencing （scRNA-seq） data （GSE137829） from CRPC patients found in the Gene Expression Omnibus （GEO） database. CellPhoneDB was used to examine interactions between different cells within the microenvironment， with a focus on revealing the connections between cancer-associated fibroblasts （CAFs） and malignant epithelial cells. CellChat was applied to analyze signaling molecules involved in communication between CAFs and malignant epithelial cells. Data from The Cancer Genome Atlas Prostate Adenocarcinoma （TCGA-PRAD） were integrated to identify signaling molecules closely related to the prognosis of CRPC patients. siRNA was used to knock down the expression of the signaling molecule Delta-like canonical Notch ligand 3 （DLL3） in CRPC cells， and the knockdown efficiency was validated by real-time quantitative PCR and Western blotting. The effects of DLL3 on the biological behaviors of CRPC cells， including proliferation， migration， and invasion， were investigated using CCK8 assays， EdU assays， and Transwell assays with Matrigel， respectively. Single-gene differential analysis， over-representation analysis （ORA）， and gene set enrichment analysis （GSEA） were also performed to identify pathways enriched with DLL3-related differential expression genes. Results：The results of single-cell transcriptomic sequencing indicated that the main cellular components of the TME in CRPC include malignant epithelial cells， CAFs and immune cells. Close communication between CAFs and malignant epithelial cells was mediated by interaction-related signaling molecules， with 63 signaling molecules identified as closely related to the communication between CAFs and malignant epithelial cells. Univariate Cox regression analysis identified key signaling molecules， including tumor necrosis factor-related ligand superfamily member 12 （TNFSF12） and DLL3， whose transcriptional expression were significantly associated with the prognosis of CRPC patients. Notably， high expression of DLL3 was significantly associated with poor prognosis in CRPC patients. In vitro experimental results demonstrated that knockdown of DLL3 significantly inhibited the growth， proliferation， migration and invasion capabilities of CRPC cells. KEGG and GSEA enrichment analyses indicated that differentially expressed genes related to DLL3 were significantly enriched in metabolic pathways. Conclusion：In the TME， CAFs and malignant epithelial cells communicate closely through intercellular signaling molecules. Among these signaling molecules， the expression of DLL3 is negatively correlated with cancer prognosis and affects the biological behavior of CRPC cells， suggesting that DLL3 may be a key signaling molecule in the malignant progression of human CRPC.

［Key words］castration-resistant prostate cancer; scRNA-seq; tumor microenvironment; cell communication; DLL3

前列腺癌是全球范圍內(nèi)的主要惡性腫瘤，并在男性中位列第二大常見(jiàn)癌癥^［1］。隨著我國(guó)人口老齡化的快速進(jìn)展，前列腺癌的發(fā)病率逐年上升且多數(shù)患者確診時(shí)已處于中晚期，預(yù)后較差。去勢(shì)抵抗性前列腺癌（castration-resistant prostate cancer，CRPC）屬于激素非依賴性前列腺癌，是指經(jīng)傳統(tǒng)的雄激素剝奪治療（ADT）后仍繼續(xù)進(jìn)展的疾病形態(tài)^［2］。近年來(lái)新型ADT藥物如CYP17抑制劑（阿比特龍）和新一代雄激素受體拮抗劑（恩雜魯胺），以及其他治療方案如化學(xué)療法（多西他賽、卡培他賽、順鉑等），免疫療法和放射療法等顯著改善了CRPC患者的5年生存期，但是進(jìn)展期患者的長(zhǎng)期生存依然不容樂(lè)觀^［3-4］。

當(dāng)前治療方案面臨的最大挑戰(zhàn)是隨著治療的進(jìn)行多數(shù)患者最終會(huì)對(duì)ADT及其他治療手段耐受^［5］。藥物耐受性的發(fā)展導(dǎo)致了治療效果的減弱，且極大地限制了治療的持久性和有效性。因此，有必要深入研究并理解藥物耐受性的潛在機(jī)制，以便開(kāi)發(fā)出更加有效的治療策略。

在研究耐藥性的過(guò)程中，腫瘤微環(huán)境（tumor microenvironment，TME）的作用日益受到關(guān)注^［6］。前列腺癌具有高度異質(zhì)性，不同類型的前列腺癌患者腫瘤和TME中的細(xì)胞組成表現(xiàn)出顯著的差異，并參與腫瘤的進(jìn)展和藥物耐受^［7］。TME由多種細(xì)胞類型組成，包括上皮細(xì)胞、間質(zhì)細(xì)胞和免疫細(xì)胞等^［8］。腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞（cancer-associated fibroblasts，CAFs）及惡性上皮細(xì)胞是TME的重要組成部分，在協(xié)調(diào)腫瘤惡性生物學(xué)特性中起關(guān)鍵作用^［9］。研究表明，CAFs可通過(guò)細(xì)胞間通訊相關(guān)信號(hào)分子相互作用與其他細(xì)胞尤其是惡性細(xì)胞發(fā)生聯(lián)系，這種細(xì)胞間通訊與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及藥物耐受等有關(guān)^［10-11］。

本研究應(yīng)用生物信息學(xué)分析與體外實(shí)驗(yàn)相結(jié)合，分析了CRPC患者TME中關(guān)鍵的調(diào)控分子，并且初步探索了Delta樣經(jīng)典Notch配體3（DLL3）在CRPC細(xì)胞惡性生物學(xué)行為中的作用，旨在為進(jìn)一步研究和開(kāi)發(fā)CRPC新的治療策略提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 生物信息學(xué)分析

1.1.1 數(shù)據(jù)獲取 CRPC的單細(xì)胞RNA測(cè)序（scRNA-Seq）數(shù)據(jù)GSE137829來(lái)自基因表達(dá)綜合數(shù)據(jù)庫(kù)（GEO），該數(shù)據(jù)子集包括6個(gè)CRPC患者的6個(gè)組織樣本^［12］。此外，從TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//portal.gdc.cancer.gov/）中獲得553例前列腺癌患者的RNA測(cè)序數(shù)據(jù)及相應(yīng)的臨床信息（癌旁組織樣本52例，前列腺癌組織樣本501例）^［13］。GTEx項(xiàng)目是一個(gè)全面的公共資源庫(kù)，旨在研究人類基因表達(dá)和調(diào)控及其與遺傳變異之間的關(guān)系^［14］。TCGA-GTEx樣本數(shù)據(jù)來(lái)源于XENA數(shù)據(jù)庫(kù)經(jīng)Toil流程統(tǒng)一處理，共獲得癌旁及正常組織樣本152例，前列腺癌組織樣本496例^［15］。

1.1.2 scRNA-seq數(shù)據(jù)分析 采用R軟件（版本4.1.3）以及Seurat R包（版本4.2.0）對(duì)scRNA-Seq數(shù)據(jù)進(jìn)行處理與分析。首先，利用CreateSeuratObject函數(shù)（參數(shù)設(shè)置：最少表達(dá)細(xì)胞數(shù)為3；每個(gè)細(xì)胞最少表達(dá)基因數(shù)為250）針對(duì)每個(gè)細(xì)胞-基因計(jì)數(shù)矩陣樣本創(chuàng)建Seurat對(duì)象。將線粒體基因含量高于15%、紅細(xì)胞基因含量高于5%、檢測(cè)到的基因數(shù)量少于300或大于7 000的細(xì)胞視為低質(zhì)量細(xì)胞并予以剔除。進(jìn)一步檢測(cè)線粒體基因百分比與所有基因表達(dá)量的關(guān)系，以及表達(dá)的基因種類與所有基因表達(dá)量的關(guān)系，并將相關(guān)數(shù)據(jù)可視化。

在控制平均表達(dá)和分散關(guān)系之后，篩選出單細(xì)胞中的所有高變異基因。然后，對(duì)這些高變異基因的主成分進(jìn)行分析，借助“jackstraw”函數(shù)鑒別細(xì)胞的主成分。針對(duì)不同樣本混合的情況，識(shí)別高變異基因并按照線粒體基因進(jìn)行基于Seurat的典型相關(guān)分析以校正批次效應(yīng)。在此基礎(chǔ)上，將細(xì)胞投影至二維映射圖中，并利用t分布隨機(jī)鄰域嵌入（tSNE）方法進(jìn)行可視化^［16］。將分辨率（resolution）設(shè)定為0.3，運(yùn)用“findclusters”函數(shù)將細(xì)胞聚類為18個(gè)不同的細(xì)胞群（簇編號(hào)0～17）。接著，運(yùn)用“FindAllMarkers”功能確定每個(gè)簇中的差異表達(dá)基因（differential expression genes，DEGs）。參考Cellmarker 2.0數(shù)據(jù)庫(kù)獲取若干經(jīng)典的細(xì)胞亞集定義標(biāo)志基因^［17］，并根據(jù)這些標(biāo)志基因的表達(dá)進(jìn)行細(xì)胞類型手動(dòng)注釋標(biāo)注。

1.1.3 細(xì)胞間通訊分析 使用CellPhoneDB（版本為v.3.0）^［18］探尋不同細(xì)胞間通訊相關(guān)信號(hào)分子的相互作用。設(shè)定以下條件使相關(guān)信號(hào)分子滿足分析要求：在所考慮的細(xì)胞群中至少有10%的細(xì)胞表達(dá)；相關(guān)配對(duì)信號(hào)分子中至少有一個(gè)成員為DEGs（經(jīng)Wilcoxon秩和檢驗(yàn)）。信號(hào)分子之間的交互作用基于當(dāng)前研究中數(shù)據(jù)庫(kù)的注釋；受體-受體相互作用以及未被定義的信號(hào)分子之間相互作用被排除在分析之外。

1.1.4 識(shí)別與預(yù)后相關(guān)的細(xì)胞間通訊分子 通過(guò)運(yùn)用單細(xì)胞數(shù)據(jù)集CellChat的研究結(jié)果，篩選CAFs與惡性上皮細(xì)胞通訊相關(guān)信號(hào)分子。接著，整合TCGA-PRAD數(shù)據(jù)集中的患者生存數(shù)據(jù)，并借助survival R包對(duì)篩選出的相關(guān)信號(hào)分子進(jìn)行單因素Cox分析，以識(shí)別與預(yù)后相關(guān)的分子。

1.1.5 DLL3相關(guān)DEGs分析 將前列腺癌樣本高通量測(cè)序數(shù)據(jù)根據(jù)DLL3表達(dá)中位數(shù)分為高表達(dá)組及低表達(dá)組，采用DESeq2 R包對(duì)兩組間DEGs進(jìn)行分析鑒定。篩選閾值設(shè)置為log₂（fold change，F(xiàn)C）gt;1和校正后的P值lt;0.05，使用火山圖可視化篩選后的DEGs，并在熱圖中顯示與DLL3相關(guān)的DEGs。

1.1.6 ORA及GSEA富集分析 采用clusterProfiler軟件包（3.14.3版本）對(duì)DLL3相關(guān)DEGs進(jìn)行過(guò)表征富集分析（over representation analysis，ORA），分析DLL3相關(guān)DEGs主要參與的信號(hào)通路，并映射成氣泡圖。基因集富集分析（gene set enrichment analysis，GSEA）是基于TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中前列腺癌組織的轉(zhuǎn)錄本數(shù)據(jù)，使用clusterProfiler包（3.14.3版本）進(jìn)行富集分析，設(shè)定標(biāo)準(zhǔn)：錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率（1 discovery rate，F(xiàn)DR）lt;0.25及校正后的P值lt;0.05。

1.2 細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證DLL3的生物學(xué)功能

1.2.1 細(xì)胞系及試劑 人CRPC細(xì)胞22RV1（貨號(hào)CX0041）、DU145（貨號(hào)CX0116）以及人正常前列腺基質(zhì)永生化細(xì)胞WPMY-1（貨號(hào)CX0314）均由武漢博士德生物公司提供。DMEM（貨號(hào)C11965500BT）、MEM（貨號(hào)C11095500BT）、RPMI 1640培養(yǎng)基（貨號(hào)C11875500BT）、胎牛血清（貨號(hào)10091148）和胰蛋白酶（貨號(hào)25200056）均為美國(guó)Gibco公司產(chǎn)品。基因敲低小干擾試劑盒（貨號(hào)SIGS0009647-1）、EdU細(xì)胞增殖試劑盒為廣州銳博生物有限公司產(chǎn)品（貨號(hào)C10310-3）；Transwell細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)用板由美國(guó)Corning公司生產(chǎn)（貨號(hào)10091148）；PVDF膜購(gòu)自德國(guó)Millipore公司（貨號(hào)0000242823）；多功能酶標(biāo)儀由瑞士TECAN公司制造（型號(hào)NNRO7274）；熒光顯微鏡為日本Olympus公司產(chǎn)品（型號(hào)IX73SC）。抗體：兔抗人DLL3和GAPDH均為美國(guó)Abcam公司產(chǎn)品（DLL3貨號(hào)ab229902，GAPDH貨號(hào)ab8245）；山羊抗兔IgG二抗則為美國(guó)ABclonal公司產(chǎn)品（貨號(hào)AS014）。蛋白定量實(shí)驗(yàn)采用美國(guó)Thermo Fisher公司生產(chǎn)的BCA蛋白定量試劑盒（貨號(hào)23227）。

1.2.2 qRT-PCR檢測(cè)CRPC細(xì)胞及前列腺基質(zhì)永生化細(xì)胞中DLL3 mRNA表達(dá)水平 使用高效的RNA快速提取試劑盒從22RV1、DU145以及WPMY-1細(xì)胞中提取總RNA，隨后逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。qRT-PCR反應(yīng)采用SYBR Green PCR Master Mix進(jìn)行，其中混合物的配方包括10 μL的2×Ultra SYBR Mixture、DLL3特異性上游和下游引物各0.4 μL、合成cDNA 0.8 μL以及雙蒸水8.4 μL，以達(dá)到總體積20 μL。反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性10 min，95 ℃變性15 s，60 ℃退火1 min，共40個(gè)循環(huán)。β-肌動(dòng)蛋白作為內(nèi)參基因。DLL3引物序列上游5′-GAGCACGACCTGGACGACT-3′，下游5′-CGGAGAA-GTGGGCGTAGC-3′；β-肌動(dòng)蛋白引物序列上游5′-TCAAGATCATTGCTCCTCCTGAG-3′，下游5′-ACAT-CTGCTGGAAGGTGGACA-3′。

1.2.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染及蛋白質(zhì)印跡實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證轉(zhuǎn)染效果 于6孔板中以3×10⁴個(gè)/孔密度接種CRPC細(xì)胞（22RV1和DU145），采用兩種不同類型的siRNA（si-DLL3#1：GATGCACTCAACAACCTAA和si-DLL3#2：CAAGGCTCCAACTGTGAGA）分別轉(zhuǎn)染22RV1和DU145細(xì)胞，并以非特異性siRNA（si-con）作為陰性對(duì)照。轉(zhuǎn)染48 h，當(dāng)匯合率達(dá)80%～90%時(shí)，加入裂解緩沖液，在冰上裂解約30 min。然后，將裂解后的細(xì)胞液在4 ℃、12 000 r/min的條件下離心15 min。離心完成后，將上清液轉(zhuǎn)移至預(yù)冷的1.5 mL EP管中，用BCA方法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度，并在95 ℃下變性8 min。通過(guò)10%的SDS-PAGE分離每個(gè)處理樣品中等量的20 μg蛋白質(zhì)，然后采用蛋白質(zhì)印跡實(shí)驗(yàn)對(duì)轉(zhuǎn)染效率進(jìn)行驗(yàn)證。

1.2.4 CCK8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)CRPC細(xì)胞生長(zhǎng)能力 將3×10³個(gè)轉(zhuǎn)染后CRPC細(xì)胞（100 μL）懸浮液接種于含有10%胎牛血清的MEM及RPMI 1640培養(yǎng)液中，并在37 ℃、5% CO₂條件下孵育24、48和72 h。之后，棄去培養(yǎng)基、PBS清洗3次，加入100 μL稀釋（完全培養(yǎng)基1∶9）的CCK8試劑，繼續(xù)孵育1 h。最后，測(cè)定在450 nm處的光密度（D）值，得出細(xì)胞增殖曲線。每組設(shè)有5個(gè)復(fù)孔。

1.2.5 EdU實(shí)驗(yàn)檢測(cè)CRPC細(xì)胞增殖能力 將5×10⁴個(gè)轉(zhuǎn)染后CRPC細(xì)胞（100 μL）懸浮液接種于24孔板中，在37 ℃、5% CO₂條件下培養(yǎng)至細(xì)胞匯合率達(dá)到70%～80%后，將EdU溶液按照1∶1 000稀釋后加入每孔中，孵育2 h。之后，加入Appolo染色液（按說(shuō)明書配制）避光孵育30 min，細(xì)胞核用1×Hoechst-33342染色30 min，最后在熒光顯微鏡下隨機(jī)選擇3個(gè)細(xì)胞視野并拍照，計(jì)算平均EdU陽(yáng)性比例（EdU/Hoechst%）。

1.2.6 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)CRPC細(xì)胞遷移、侵襲能力 在24孔板中加入0.5 mL 20%的完全培養(yǎng)基，用空培養(yǎng)基重懸轉(zhuǎn)染的CRPC細(xì)胞（22RV1和DU145），鋪在上室中（每孔約4×10⁴個(gè)細(xì)胞），置于細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育24 h后，使用2.5%結(jié)晶紫染色30 min。在相位對(duì)比顯微鏡（Olympus，日本）下隨機(jī)選擇3張染色細(xì)胞的圖像，并用Image J計(jì)數(shù)細(xì)胞。含基質(zhì)膠的Transwell實(shí)驗(yàn)（Matrigel Transwell）需要在小室上室預(yù)先包被（空培養(yǎng)基1∶9）基質(zhì)膠，其余步驟同上。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

生物信息學(xué)分析使用R Studio（v.4.1.2）軟件進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的分析和制圖則采用SPSS 23.0軟件和GraphPad Prism 7.0軟件。計(jì)量數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組均數(shù)比較采用兩樣本t檢驗(yàn)，多組均數(shù)比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步組間比較采用Dunnett-t檢驗(yàn)；采用Wilcoxon秩和檢驗(yàn)比較DLL3在癌旁組織和癌組織中的表達(dá)差異。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CRPC單細(xì)胞數(shù)據(jù)注釋及TME可視化

對(duì)來(lái)自數(shù)據(jù)集GSE137829的單細(xì)胞測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行再分析，經(jīng)過(guò)過(guò)濾、降維聚類，在CRPC患者TME中共得到18個(gè)亞群。使用Cellmarker 2.0的經(jīng)典標(biāo)志基因?qū)?8個(gè)亞群進(jìn)行細(xì)胞注釋（圖1A），亞群2為T細(xì)胞，表達(dá)細(xì)胞分化抗原3E（CD3E），白介素7受體（IL7R），CC趨化因子5（CCL5）；亞群15為B細(xì)胞，表達(dá)細(xì)胞分化抗原79A（CD79A），膜結(jié)構(gòu)域家族4成員A1（MS4A1）；亞群7為單核細(xì)胞，表達(dá)溶菌酶基因（LYZ），細(xì)胞分化抗原14（CD14），S100鈣結(jié)合蛋白A9（S100A9）；亞群9為內(nèi)皮細(xì)胞，表達(dá)馮·威爾布蘭因子（VWF），血小板內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子1（PECAM1）；亞群11為肥大細(xì)胞，表達(dá)鈦酪氨酸激酶受體（KIT），胰蛋白酶A3（CPA3）；亞群14為漿細(xì)胞，表達(dá)連接鏈基因（JCHAIN），重鏈γ1免疫球蛋白（IGHG1）；亞群3，6為成纖維細(xì)胞，表達(dá)軟骨蛋白聚糖（LUM），平滑肌肌動(dòng)蛋白（ACTA2），血小板源生長(zhǎng)因子受體β（PDGFRB），纖維蛋白酶（FAP），Notch3蛋白（NOTCH3）；亞群0，1，4，5，8，10，12，13，16，17為上皮細(xì)胞，表達(dá)上皮細(xì)胞黏附分子（EPCAM），角蛋白7（KRT7），角蛋白19（KRT19），其中亞群4，5，8，10，12為惡性上皮細(xì)胞，表達(dá)E-鈣黏蛋白（CDH1），WFDC蛋白家族的蛋白2（WFDC2），泛素結(jié)合酶E2T（UBE2T），ATP依賴的染色質(zhì)裝配因子2（ATAD2）。TME細(xì)胞類型如圖1B所示，其中，上皮細(xì)胞構(gòu)成了TME的主體，約占TME總細(xì)胞數(shù)的59%（圖1C）。6個(gè)CRPC樣本在TME各細(xì)胞類型中所占的比例，見(jiàn)圖1D。此外，尋找每個(gè)細(xì)胞類型前5個(gè)標(biāo)志基因用于驗(yàn)證細(xì)胞類型，可視化該部分結(jié)果于氣泡圖及熱圖中，見(jiàn)圖1E-F。

2.2 TME細(xì)胞間通訊網(wǎng)絡(luò)

利用CellPhoneDB對(duì)細(xì)胞間通訊進(jìn)行分析（圖2A），分析結(jié)果表明在TME中CAFs與其他細(xì)胞存在強(qiáng)烈的通訊交互，特別是與惡性上皮細(xì)胞之間的交互尤為密切（圖2B-C）。此外，細(xì)胞間通訊通路熱圖進(jìn)一步證實(shí)了惡性上皮細(xì)胞和CAFs在TME相關(guān)通路中顯著富集（圖2D）。

2.3 CAFs參與細(xì)胞通訊的關(guān)鍵信號(hào)分子及其表達(dá)情況

使用CellChat工具，共篩選出CAFs與惡性上皮細(xì)胞間通訊密切相關(guān)的信號(hào)分子63個(gè)。使用survival R包對(duì)這63個(gè)相關(guān)基因進(jìn)行單因素Cox分析，發(fā)現(xiàn)腫瘤壞死因子相關(guān)配體超家族成員12（TNFSF12）和DLL3兩個(gè)基因與患者預(yù)后顯著相關(guān)（Plt;0.05）；其中，DLL3與預(yù)后的相關(guān)性更為顯著，DLL3表達(dá)越高，提示患者的預(yù)后更差（圖3A）。基于TCGA數(shù)據(jù)分析顯示，DLL3 mRNA在前列腺癌組織中的表達(dá)顯著高于癌旁組織（Plt;0.001，圖3B-C）。整合TCGA與GTEx數(shù)據(jù)進(jìn)一步探究，DLL3 mRNA在前列腺癌組織中的表達(dá)明顯高于癌旁及正常組織（Plt;0.001，圖3D）。為了進(jìn)一步驗(yàn)證上述發(fā)現(xiàn)，qRCR和蛋白質(zhì)印跡結(jié)果證實(shí)，DLL3 mRNA和蛋白的表達(dá)在CRPC細(xì)胞（22RV1和DU145）中明顯高于WPMY-1細(xì)胞（圖3E-G）。

2.4 敲低DLL3顯著抑制CRPC細(xì)胞惡性生長(zhǎng)

qRT-PCR及蛋白質(zhì)印跡結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染“si-DLL3#1”以及“si-DLL3#2”的兩株CRPC細(xì)胞中DLL3 mRNA和蛋白表達(dá)水平明顯降低（圖4A-B）。敲低DLL3后，22RV1與DU145細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖、遷移及侵襲能力均顯著下降（Plt;0.01和Plt;0.001），見(jiàn)圖4C-F。由此提示，敲低DLL3能顯著抑制CRPC細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為。

2.5 DLL3作用機(jī)制探索

依據(jù)CRPC樣本高通量測(cè)序數(shù)據(jù)，以DLL3表達(dá)的中位數(shù)為界，將腫瘤樣本分為高表達(dá)組和低表達(dá)組，應(yīng)用DESeq2 R包共鑒定出437個(gè)與DLL3表達(dá)顯著相關(guān)的DEGs。其中，在DLL3高表達(dá)樣本中167個(gè)基因上調(diào)，270個(gè)基因下調(diào)，火山圖見(jiàn)圖5A。DLL3相關(guān)的DEGs共表達(dá)熱圖見(jiàn)圖5B-C，其中包括與DLL3正相關(guān)的前10個(gè)基因和負(fù)相關(guān)的前10個(gè)基因。KEGG通路分析結(jié)果顯示，一系列信號(hào)通路與DLL3相關(guān)的DEGs顯著相關(guān)，特別是鈣信號(hào)通路、cGMP-PKG信號(hào)通路及催產(chǎn)素信號(hào)通路（圖5D）。此外，GSEA進(jìn)一步揭示，與DLL3協(xié)同高表達(dá)的基因參與的生物學(xué)過(guò)程主要包括真核翻譯延伸、SRP依賴的共轉(zhuǎn)錄蛋白質(zhì)向膜定位等（圖5E）。

3 討論

CAFs是TME中重要組成部分，它們能夠通過(guò)分泌細(xì)胞因子、化學(xué)因子和胞外基質(zhì)蛋白與腫瘤上皮細(xì)胞進(jìn)行通訊，從而影響腫瘤的生長(zhǎng)、侵襲和轉(zhuǎn)移^［19-20］。盡管目前已有研究使用scRNA-seq數(shù)據(jù)探究細(xì)胞間通訊，但其重點(diǎn)往往是腫瘤細(xì)胞間的通訊，沒(méi)有關(guān)注于CAFs與腫瘤細(xì)胞間通訊并將這些通訊特征與生物學(xué)結(jié)果聯(lián)系起來(lái)^［21］。本研究整合了CRPC的高通量測(cè)序數(shù)據(jù)（Bulk-Seq）和scRNA-Seq數(shù)據(jù)，并通過(guò)數(shù)據(jù)質(zhì)控處理，分析了CRPC患者TME中的細(xì)胞類型，包括惡性上皮細(xì)胞、CAFs和免疫細(xì)胞等，進(jìn)一步分析表明CAFs與惡性上皮細(xì)胞間通訊密切，共篩選出63個(gè)CAFs與惡性上皮細(xì)胞通訊密切相關(guān)的信號(hào)分子，單因素Cox回歸分析顯示關(guān)鍵信號(hào)分子TNFSF12以及DLL3轉(zhuǎn)錄本的表達(dá)與CRPC患者預(yù)后相關(guān)。其中，DLL3與CRPC患者預(yù)后的關(guān)系更為顯著，且在CRPC中具有成為靶點(diǎn)的潛力。

DLL3是Delta/Serrate/Lag2（DSL）Notch配體家族的成員之一。DLL3作為Notch配體抑制劑，在腫瘤細(xì)胞中通過(guò)抑制Notch信號(hào)促進(jìn)癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移^［22］。TME中的Notch信號(hào)在調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)，特別是在抗腫瘤免疫中發(fā)揮重要作用。DLL3的異常表達(dá)可能會(huì)干擾這一過(guò)程，從而幫助腫瘤細(xì)胞逃避免疫監(jiān)視^［23］。研究發(fā)現(xiàn)，DLL3在胃癌、胰腺癌^［24］、乳腺癌^［25］以及神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤^［26-27］TME的惡性上皮細(xì)胞中均異常表達(dá)，而在非癌細(xì)胞中其表達(dá)通常很低或不存在，因此它成了一個(gè)潛在的治療靶標(biāo)。基于DLL3的治療方案，如針對(duì)DLL3的抗體藥物偶聯(lián)物（ADCs）已經(jīng)在臨床試驗(yàn)中進(jìn)行，旨在利用其在癌細(xì)胞上的特異性表達(dá)模式選擇性地殺傷癌細(xì)胞，同時(shí)盡量減少對(duì)正常細(xì)胞的影響^［28］。然而，在CRPC中關(guān)于DLL3的研究仍然較為少見(jiàn)。本研究通過(guò)TCGA數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)，DLL3在前列腺癌組織中的表達(dá)顯著高于癌旁及正常組織。體外功能實(shí)驗(yàn)表明，敲低DLL3可顯著抑制CRPC細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖、遷移和侵襲能力。進(jìn)一步通過(guò)ORA和GSEA進(jìn)行機(jī)制分析，發(fā)現(xiàn)DLL3相關(guān)的DEGs在與代謝相關(guān)的通路（如藥物代謝、花生四烯酸代謝、視黃醇代謝及硒氨基酸代謝等）顯著富集，提示DLL3可能在CRPC的代謝調(diào)控中起到關(guān)鍵作用，尤其是在腫瘤細(xì)胞的能量代謝和生物合成代謝中。

本研究存在一定的局限性。首先，樣本量有限，未能全面涵蓋CRPC的所有亞型。其次，DLL3與腫瘤代謝之間的關(guān)聯(lián)也需要進(jìn)一步的探索。最后，DLL3的功能以及在體內(nèi)模型中的作用和機(jī)制有待深入研究。

綜上所述，本研究結(jié)果表明通訊相關(guān)信號(hào)分子DLL3的表達(dá)與患者的預(yù)后呈負(fù)相關(guān)，并且顯著影響CRPC細(xì)胞的生物學(xué)行為，DLL3可能是CRPC惡性進(jìn)展的關(guān)鍵信號(hào)分子。未來(lái)的研究將重點(diǎn)揭示DLL3在CRPC中的詳細(xì)分子機(jī)制，特別是其在CRPC代謝調(diào)控中可能發(fā)揮的關(guān)鍵作用，并評(píng)估針對(duì)DLL3的干預(yù)策略在臨床治療中的應(yīng)用潛力。

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［收稿日期］2024-01-16［編輯］何承志