藤黃酸調(diào)節(jié)PI3K/AKT信號(hào)通路對(duì)心肌缺血/再灌注損傷大鼠的心肌保護(hù)作用研究

摘要目的：探討藤黃酸（GA）對(duì)心肌缺血/再灌注損傷（MIRI）大鼠磷脂酰肌醇-3-激酶（PI3K）/蛋白激酶B（AKT）信號(hào)通路及心肌損傷的影響。

方法：將大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組（Sham組）、模型組（Model組）、GA組和GA＋PI3K抑制劑LY294002組（GLY組），Sham組僅穿線(xiàn)不結(jié)扎，其余組構(gòu)建MIRI模型，觀(guān)察心肌組織病理變化，并檢測(cè)MIRI大鼠心肌細(xì)胞凋亡率、心肌損傷標(biāo)志物［心肌肌鈣蛋白I（cTnI）、乳酸脫氫酶（LDH）、肌酸激酶同工酶（CK-MB）］和炎性因子［白細(xì)胞介素（IL）-1β、IL-18、IL-6、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）］及心肌組織中Bax、Bcl-2、cleaved-capase 3、PI3K、磷酸化PI3K（p-PI3K）、AKT、磷酸化AKT（p-AKT）蛋白表達(dá)。結(jié)果：GA組心肌纖維疏松排列，少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，心肌損傷減輕；與Model組比較，GA組大鼠細(xì)胞凋亡率、Bax、cleaved-capase 3、cTnI、LDH、CK-MB、IL-1β、IL-18、IL-6、TNF-α明顯降低（P＜0.05），Bcl-2、p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT蛋白表達(dá)明顯升高（P＜0.05）；與GA組比較，GLY組大鼠細(xì)胞凋亡率、Bax、cleaved-capase 3、cTnI、LDH、CK-MB、IL-1β、IL-18、IL-6、TNF-α明顯增加（P＜0.05），Bcl-2、p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT蛋白表達(dá)明顯降低（P＜0.05）。結(jié)論：GA通過(guò)激活PI3K/AKT信號(hào)通路抑制炎癥反應(yīng)，抑制心肌細(xì)胞凋亡，減輕大鼠MIRI，發(fā)揮心肌保護(hù)作用。

關(guān)鍵詞心肌缺血/再灌注損傷；心肌保護(hù)；藤黃酸；磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B；實(shí)驗(yàn)研究

doi：10.12102/j.issn.1672-1349.2024.24.009

Myocardial Protective Effect of Gambogic Acid on Rats with Myocardial "Ischemia/Reperfusion "Injury "by "Regulating PI3K/AKT Signaling Pathway

LI Mingfang， WANG Lizhen， HE Chengxiang， LIU Chaoquan

Hainan Western Central Hospital， Danzhou 571700， Hainan， China

AbstractObjective：To investigate the impacts of gambogic acid（GA） on the phosphatidylinositol-3-kinase/protein kinase B（PI3K/AKT） signaling pathway and myocardial injury in myocardial ischemia-reperfusion injury （MIRI） rats.Methods：Rats were randomly grouped into sham surgery group（Sham group），model group（Model group），GA group，and GA＋PI3K inhibitor LY294002 group（GLY group）.The rats in Sham group only threaded without ligation，while the rats in other groups constructed MIRI models，the pathological changes of myocardial tissue were observed，and the apoptosis rate of myocardial cells，myocardial injury markers［cardiac troponin I（cTnI），lactate dehydrogenase（LDH），creatine kinase-MB（CK-MB）］，inflammatory factors［interleukin（IL）-1β，IL-18，IL-6，tumor necrosis factor-α（TNF-α）］，and the expression of Bax，Bcl-2，cleaved-capase 3，p-PI3K，PI3K，p-AKT，and AKT proteins in myocardial tissue of MIRI rats were detected.Results：The GA group showed loose arrangement of myocardial fibers，infiltration of a small amount of inflammatory cells，and mild myocardial injury.Compared with Model group，the apoptosis rate，Bax，cleaved-capase 3，cTnI，LDH， CK-MB，IL-1β，IL-18，IL-6，and TNF-α in GA group reduced obviously（P＜0.05），the expression of Bcl-2，p-PI3K/PI3K，and p-AKT/AKT proteins increased obviously（P＜0.05）.Compared with GA group，the apoptosis rate，Bax，cleaved-capase 3，cTnI，LDH，CK-MB， IL-1β，IL-18，IL-6，and TNF-α in GLY group increased obviously（P＜0.05），the expression of Bcl-2，p-PI3K/PI3K，and p-AKT/AKT proteins reduced obviously（P＜0.05）.Conclusion：GA inhibits inflammatory response，inhibits cardiomyocyte apoptosis，reduces MIRI in rats，and exerts myocardial protective effects by activating the PI3K/AKT signaling pathway.

Keywordsmyocardial ischemia/reperfusion injury; myocardial protection; gambogic acid; phosphatidylinositol 3-kinase/protein kinase B; experimental study

心肌缺血再灌注損傷（MIRI）是發(fā)生急性心肌梗死時(shí)，心臟血液流動(dòng)受阻，導(dǎo)致心肌缺血、缺氧壞死，而心肌再灌注加重原有心肌損傷［1］。在治療MIRI中常采用急診溶栓、介入治療和冠狀動(dòng)脈搭橋手術(shù)，很大程度上降低了急性心肌梗死發(fā)生率［2］。然而，MIRI發(fā)生機(jī)制較復(fù)雜，長(zhǎng)期缺血再灌注易引起細(xì)胞損傷，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡和壞死［3］。因此，研究MIRI的細(xì)胞凋亡機(jī)制可為臨床治療提供新的治療靶點(diǎn)。藤黃酸（gambogic acid，GA）是一種藤黃分泌的干燥樹(shù)脂，具有抗癌、抗炎、抗氧化、抗菌等作用［4］。越來(lái)越多的證據(jù)表明，GA能誘導(dǎo)凋亡、自噬、細(xì)胞周期停滯以及抑制侵襲、轉(zhuǎn)移、血管生成［5］。據(jù)報(bào)道，GA可顯著降低心肌炎性因子水平，緩解急性心肌梗死［6］。GA還可緩解脂多糖誘導(dǎo)的心肌損傷，具有抗炎作用［7］。磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B（PI3K/AKT）通路是細(xì)胞內(nèi)重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，參與調(diào)控細(xì)胞增殖和凋亡等多種生物學(xué)活動(dòng)，其通路激活與MIRI的改善密切相關(guān)［8］。據(jù)報(bào)道，激活PI3K/AKT通路可阻斷線(xiàn)粒體通透性轉(zhuǎn)換孔打開(kāi)并增強(qiáng)心肌存活，對(duì)MIRI心臟具有保護(hù)作用［9］。此外，GA顯著增加了PI3K/AKT蛋白表達(dá)，減輕對(duì)乙酰氨基酚誘導(dǎo)的大鼠肝毒性［10］。然而，PI3K/AKT通路是否介導(dǎo)GA對(duì)MIRI的心肌保護(hù)作用尚不清楚。因此，本研究通過(guò)構(gòu)建大鼠MIRI模型，探討PI3K/AKT通路是否介導(dǎo)GA對(duì)MIRI的心肌保護(hù)作用。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

無(wú)特定病原體（SPF）級(jí)雄性大鼠，8周齡，體質(zhì)量（200±20 ）g，購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海藥物研究所，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（滬）2020-0005。所用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均按照《中國(guó)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物護(hù)理使用指南》和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理方法進(jìn)行，并經(jīng)過(guò)海南西部中心醫(yī)院倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)（倫理批號(hào)：2022-0122）。

1.2藥品及試劑

GA（B21241）購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司；蘇木素-伊紅（HE）染色試劑盒（SL7070）購(gòu)自北京百奧曼科技有限公司；脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的缺口末端標(biāo)記（TUNEL）凋亡檢測(cè)試劑盒（T2130）購(gòu)自北京Solarbio科技有限公司；心肌肌鈣蛋白I（cTnI）（ml059510）、乳酸脫氫酶（LDH）（ml092995）、肌酸激酶同工酶（CK-MB）（ml059533）酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（ELISA）試劑盒購(gòu)自酶聯(lián)生物；白細(xì)胞介素（IL）-1β（SP12225）、IL-18（SP12234）、IL-6（SP12279）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）（SP12250）ELISA試劑盒購(gòu)自武漢賽培生物科技有限公司；Bax（ab32503）、Bcl-2（ab32124）、cleaved-capase 3（ab32042）、PI3K（ab302958）、磷酸化AKT（p-AKT）、AKT（ab38449）、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗（ab272685）、PI3K抑制劑LY294002（ab120243）均購(gòu)自英國(guó)Abcam公司。生物顯微鏡（日本尼康公司）；凝膠成像系統(tǒng)（美國(guó)伯樂(lè)公司）。

1.3方法

1.3.1模型構(gòu)建及分組

在37 ℃、55%相對(duì)濕度、光照/黑暗循環(huán)12 h環(huán)境下，將大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d。大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組（Sham組）、模型組（Model組）、GA組、GA＋LY294002組（GLY組），每組15只。造模前7 d，GA組給予腹腔注射6 mg/kg GA［7］，每日1次；GLY組大鼠每天腹腔注射6 mg/kg GA，并于造模前30 min腹腔注射0.3 mg/kg LY294002。參照蘭卓等［11］方法構(gòu)建大鼠MIRI模型：大鼠經(jīng)戊巴比妥鈉麻醉后，將大鼠氣管與人工呼吸機(jī)連接，行冠狀動(dòng)脈左前降支結(jié)扎手術(shù)，當(dāng)左心室前壁光澤度降低，顏色蒼白時(shí)，提示心肌缺血成功。心肌缺血30 min后，恢復(fù)血流再灌注2 h，Sham組僅穿線(xiàn)不結(jié)扎。再灌注結(jié)束后，抽取腹主動(dòng)脈血檢測(cè)cTnI、LDH、CK-MB、IL-1β、IL-18、IL-6、TNF-α含量；處死大鼠，剝離心臟組織，隨機(jī)選取5只用于HE染色，另取5只置于－80 ℃，用于細(xì)胞凋亡檢測(cè)；剩余5只用于ELISA和蛋白質(zhì)免疫印跡（Western Blot）檢測(cè)。

1.3.2血清心肌酶cTnI、LDH和CK-MB測(cè)定

采集腹主動(dòng)脈血液置于抗凝離心管中，3 500 r/min，4 ℃離心15 min，分離血清。按試劑盒說(shuō)明書(shū)測(cè)定cTnI、LDH和CK-MB含量。

1.3.3ELISA檢測(cè)血清IL-1β、IL-18、IL-6、TNF-α含量

按照ELISA試劑盒說(shuō)明，檢測(cè)血清中cTnI、IL-1β、IL-18、IL-6、TNF-α水平。

1.3.4心肌組織病理學(xué)觀(guān)察

心肌組織用4%多聚甲醛固定，石蠟包埋、切片，切片用甲苯脫蠟，梯度乙醇再水化。切片采用HE染色，并于顯微鏡下觀(guān)察、拍照。

1.3.5TUNEL染色檢測(cè)心肌細(xì)胞凋亡

心肌組織冷凍切片后，用蛋白酶κ處理，加入TUNEL染色液孵育1 h，DAPI反染后，于顯微鏡下觀(guān)察TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞，陽(yáng)性細(xì)胞為綠色熒光。Image Pro Plus軟件定量細(xì)胞凋亡率。

1.3.6Western Blot檢測(cè)心肌組織Bax、Bcl-2、cleaved-capase 3、p-PI3K、PI3K、p-AKT、AKT蛋白表達(dá)

取各組心肌組織，提取總蛋白，二喹啉甲酸（BCA）試劑盒測(cè)定蛋白濃度。蛋白經(jīng)變性處理，十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE），轉(zhuǎn)膜，TBST沖洗，5%脫脂牛奶阻塞1 h，加入一抗Bax、Bcl-2、cleaved-capase 3、p-PI3K、p-AKT，4 ℃孵育過(guò)夜，辣根過(guò)氧化物偶聯(lián)的二抗在室溫下孵育2 h。電化學(xué)發(fā)光（ECL）反應(yīng)，暗室曝光顯影，凝膠成像儀成像。以β-actin為內(nèi)參，用Image J軟件計(jì)算蛋白相對(duì)含量。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。符合正態(tài)分布的定量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1各組大鼠cTnI、LDH和CK-MB水平比較

與Sham比較，Model組大鼠血清cTnI、LDH和CK-MB含量明顯升高（P＜0.05）；與Model組比較，GA組大鼠血清cTnI、LDH和CK-MB含量明顯降低（P＜0.05）；與GA組比較，GLY組大鼠血清cTnI、LDH和CK-MB含量明顯升高（P＜0.05）。詳見(jiàn)表1。

2.2各組大鼠血清IL-1β、IL-18、IL-6、TNF-α水平比較

與Sham比較，Model組大鼠血清IL-1β、IL-18、IL-6、TNF-α水平明顯升高（P＜0.05）；與Model組比較，GA組大鼠血清IL-1β、IL-18、IL-6、TNF-α含量明顯降低（P＜0.05）；與GA組比較，GLY組大鼠血清IL-1β、IL-18、IL-6、TNF-α含量明顯升高（P＜0.05）。詳見(jiàn)表2。

2.3心肌組織病理變化

光鏡下Sham組心肌組織未見(jiàn)異常；Model組大鼠細(xì)胞形態(tài)紊亂、心肌纖維斷裂、壞死，間質(zhì)中大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；GA組、GLY組心肌纖維疏松排列，少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，且GA組減弱心肌組織病理效果優(yōu)于GLY組。詳見(jiàn)圖1。

2.4各組大鼠心肌細(xì)胞凋亡情況比較

與Sham組比較，Model組大鼠綠色熒光細(xì)胞明顯增多，心肌細(xì)胞凋亡率明顯增加（P＜0.05）；與Model組比較，GA組大鼠綠色熒光細(xì)胞明顯減少，細(xì)胞凋亡率明顯降低（P＜0.05）；與GA組比較，GLY大鼠綠色熒光明顯增多，細(xì)胞凋亡率明顯增加（P＜0.05）。詳見(jiàn)圖2和表3。

2.5各組大鼠心肌組織中Bax、Bcl-2、cleaved-capase 3含量比較

與Sham組比較，Model組大鼠心肌組織中Bcl-2明顯降低，Bax、cleaved-capase 3明顯升高（P＜0.05）；與Model組比較，GA組大鼠心肌組織中Bcl-2明顯升高，Bax、cleaved-capase 3明顯降低（P＜0.05）；與GA組比較，GLY組大鼠心肌組織中Bcl-2明顯降低，Bax、cleaved-capase 3明顯升高（P＜0.05）。詳見(jiàn)圖3、表4。

2.6各組大鼠心肌組織中PI3K、AKT蛋白表達(dá)及其磷酸化水平比較

與Sham組比較，Model組大鼠心肌組織中p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT明顯降低（P＜0.05）；與Model組比較，GA組大鼠心肌組織中p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT明顯增加（P＜0.05）；與GA組比較，GLY組大鼠心肌組織中p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT明顯降低（P＜0.05）。詳見(jiàn)圖4、表5。

3討論

MIRI是臨床上常見(jiàn)的疾病，減少再灌注損傷對(duì)病人的治療和預(yù)后至關(guān)重要［12］。藥物預(yù)處理是臨床上常見(jiàn)的MIRI損傷治療方案。GA是一種具有廣泛藥理特性的天然產(chǎn)物，具有抗癌、抗炎、抗凋亡、抗血管生成和抗氧化活性［13］。據(jù)報(bào)道，GA對(duì)MIRI損傷具有顯著的保護(hù)作用［6］。此外，GA通過(guò)促進(jìn)新血管形成而改善心肌梗死大鼠心功能［14］。MIRI導(dǎo)致不可逆的心肌損傷，影響心功能。心肌組織病理學(xué)檢查不僅是組織損傷最直觀(guān)的指標(biāo)，也是藥物治療缺血性損傷有效性的客觀(guān)證據(jù)［15］。本研究結(jié)果顯示，GA組大鼠心肌細(xì)胞形態(tài)和心肌纖維明顯改善，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)減少，提示GA可減輕MIRI大鼠心肌組織纖維化。

相關(guān)研究表明，急性心肌缺血時(shí)細(xì)胞膜受損，通透性增加，導(dǎo)致cTnI、LDH和CK-MB從細(xì)胞外溢到血清［15］。本研究發(fā)現(xiàn)，Model組大鼠血清LDH、cTnI和CK-MB水平明顯升高，而GA處理明顯降低了大鼠血清LDH、cTnI和CK-MB水平，提示GA能減輕心肌損傷。此外，MIRI也與炎性因子密切相關(guān)。有研究表明，MIRI是由IL-1β、IL-18、IL-6、TNF-α等炎性因子含量的增加引起［16］。本研究結(jié)果顯示，與Model組比較，GA組大鼠血清IL-1β、IL-18、IL-6、TNF-α水平明顯降低，與GA組比較，GLY組大鼠血清IL-1β、IL-18、IL-6、TNF-α水平增加，提示GA可抑制炎癥反應(yīng)，減輕心肌損傷。

PI3K/AKT信號(hào)通路在MIRI中發(fā)揮重要作用。AKT是PI3K重要的下游靶酶，當(dāng)PI3K被激活時(shí)能激活A(yù)KT，AKT磷酸化為p-AKT，p-AKT進(jìn)一步調(diào)控凋亡和生存相關(guān)的因子表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞存活并抑制細(xì)胞凋亡，發(fā)揮心肌保護(hù)作用［17］。細(xì)胞凋亡是細(xì)胞死亡的一種方式，即程序性細(xì)胞死亡，能加重再灌注過(guò)程［18］。Bcl-2是細(xì)胞凋亡抑制因子，能抑制細(xì)胞凋亡從而維持細(xì)胞存活，Bcl-2是Bax的拮抗因子，激活Bcl-2后能促進(jìn)細(xì)胞凋亡［19］。cleaved-capase 3是capase家族的關(guān)鍵蛋白酶，能被Bax激活引起細(xì)胞凋亡［20］。本研究結(jié)果顯示，與Model組比較，GA組Bcl-2、p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT明顯增加，Bax、cleaved-capase 3明顯降低，與GA組比較，GLY組Bcl-2、p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT明顯降低，Bax、cleaved-capase 3明顯增加，提示GA通過(guò)激活PI3K/AKT信號(hào)通路調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡因子并抑制細(xì)胞凋亡，從而減輕MIRI。

綜上所述，GA可通過(guò)激活PI3K/AKT信號(hào)通路抑制心肌細(xì)胞凋亡，減輕機(jī)體炎癥反應(yīng)，緩解MIRI，對(duì)心肌損傷具有保護(hù)作用。然而，關(guān)于GA通過(guò)激活PI3K/AKT信號(hào)通路對(duì)MIRI的研究較少。本研究方法作為MIRI治療的潛在選擇有待進(jìn)一步研究，且需要更多的機(jī)制證據(jù)。

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（收稿日期：2023-04-26）

（本文編輯王麗）