基于分子動力學模擬的超高壓聯合天然抑制劑鈍化多酚氧化酶活性的機制解析

摘 要：超高壓處理（high-pressure processing，HPP）是食品非熱加工的常用技術，但由于該技術難以鈍化多酚氧化酶（polyphenol oxidase，PPO）等食品品質相關內源酶，導致產品貨架期易發生酶促劣變。本文探究了HPP處理分別聯合表沒食子兒茶素沒食子酸酯（epigallocatechin gallate，EGCG）、阿魏酸（ferulic acid，FA）和矢車菊素-3-O-葡萄糖苷（cyanidin-3-O-glucoside，C3G）對PPO活性的影響，并使用分子動力學模擬揭示了可能的分子結合機制。結果表明，3種抑制劑均能以濃度性依賴抑制PPO活性，但是相比于FA，EGCG和C3G更為高效。相比于單獨HPP處理，不同抑制劑與HPP的聯合處理均顯著降低了PPO活性，尤其是添加4.5×10-4 mol/L EGCG的樣品在經過600 MPa、20 min處理后殘余酶活僅剩（12.98±0.24）%，幾乎實現了PPO完全滅活。分子動力學模擬結果顯示，HPP與EGCG聯合處理加劇了PPO的去折疊與水合，穩定了EGCG與PPO之間的結合，并可能造成活性中心的掩埋，最終導致其活性下降。綜上，HPP與天然抑制劑的聯合處理表現出充分鈍化PPO的潛力，有望彌補其應用短板。

關鍵詞：分子動力學模擬；超高壓；天然抑制劑；多酚氧化酶；機制

中圖分類號：TS255.3 文獻標志碼：A 文章編號：1008-1038（2024）12-0013-07

DOI：10.19590/j.cnki.1008-1038.2024.12.003

Mechanism Analysis of Passivation of Polyphenol Oxidase Activity

by Ultra-high Pressure Combined with Natural Inhibitors

Based on Molecular Dynamics Simulation

TIAN Xuezhi1， GONG Chaoyun2， YAN Fuquan2， WANG Yongtao1*

（1. College of Food Science and Nutritional Engineering， China Agricultural University， National Engineering Research Center for Fruit amp; Vegetable Processing， Key Laboratory of Fruit amp; Vegetable Processing， Ministry of Agriculture and Rural Affairs， Beijing Key Laboratory for Food Nonthermal Processing， Beijing 100083， China;

2. Guizhou Tianci Guibao Food Co.， Ltd， Anshun 561000， China）

Abstract： High-pressure processing （HPP） is a common technology of non-thermal food processing technology. However， it is challenging to inactivate endogenous enzymes related to food quality， such as polyphenol oxidase （PPO）， which leads to enzymatic deterioration of products during their shelf life. In this study， the effects of HPP treatment combined with epigallocatechin gallate （EGCG）， ferulic acid （FA）， and cyanidin-3-O-glucoside （C3G） on PPO activity were investigated， and molecular dynamics simulations （MD） was used to elucidate potential molecular binding mechanisms. Results indicated that all three inhibitors could inhibit PPO activity in a concentration-dependent manner， with EGCG and C3G demonstrating greater efficacy than FA. Compared to HPP treatment alone， the combined treatment of various inhibitors with HPP all significantly reduced PPO activity. Notably， the residual activity of sample treated with 4.5×10-4 mol/L EGCG exhibited only （12.98±0.24）% after treatment at 600 MPa for 20 minutes， indicating an near-complete inactivation. Molecular dynamics simulation results revealed that the combined treatment of HPP and EGCG enhanced the unfolding and hydration of PPO， stabilized the binding between EGCG and PPO， and might result in the burial of the active site， ultimately leading to a decrease in its activity. In conclusion， the combined treatment of HPP and natural inhibitors shows promise for completely inactivating PPO， which is expected to address the application limitations of HPP.

Keywords： Molecular dynamics simulation; ultra-high pressure; natural inhibitors; polyphenol oxidase; mechanism

多酚氧化酶（polyphenol oxidase，PPO）是一種III型銅蛋白，廣泛存在于動物、植物、真菌和細菌中[1-2]。在果蔬采后，PPO主要催化新鮮果蔬發生酶促褐變，不僅直接導致色澤劣變，還會引起加工和貯藏過程中的風味惡化和營養成分損失[3-5]。此外，發生酶促褐變的產品會大大降低消費者的接受度，由此導致食物浪費和較大的經濟損失[5]。因此，如何充分抑制PPO的活性，一直是食品領域的研究重點。

超高壓處理（high pressure processing，HPP）是當今最具商業前景的非熱處理技術，已被廣泛應用于果蔬制品、奶制品以及水產品等的殺菌與保藏上[3，6-7]。由于具有壓縮效應，HPP主要影響蛋白質等大分子的非共價鍵，而對一些食品質量屬性密切相關的低分子量化合物（如顏色物質和香氣成分）的影響有限，因此能充分保持產品的新鮮品質[8]。在HPP下，由氫鍵維持的酶的高級結構變性并展開，伴隨著內部疏水基團的暴露和構象的變化，從而影響活性中心的可及性[9]。盡管如此，許多文獻報道了PPO的耐壓性[9-12]。在800 MPa下處理1 min后，蘑菇PPO的殘余活性仍然高達84.9%[10]。

近年來，考慮到清潔標簽和環保的趨勢，一些天然植物化學物質，如阿魏酸（ferulic acid，FA）[13]、矢車菊素-3-O-葡萄糖苷（cyanidin-3-O-glucoside，C3G）[14]和表沒食子兒茶素沒食子酸酯（epigallocatechin gallate，EGCG）[2]等被發現具有PPO抑制效應，并被用于抗酶促褐變試驗。但在實際生產中，為保證食品在貯藏過程中的安全性和質量穩定性，在添加抑制劑后仍然需要對產品執行后續的滅菌工藝。因此，在實際工業生產中單用HPP處理難以滿足滅活PPO的要求，通過HPP與抑制劑聯合處理來降低酶活性是理想的選擇。目前，很少有研究探討 HPP與抑制劑聯合處理對PPO抑制能力的影響。鑒于分子動力學模擬可以提供傳統實驗難以直接觀測的分子甚至原子尺度發生變化的信息，為了進一步揭示HPP與EGCG聯合處理鈍化PPO的分子機制，本研究采用分子動力學模擬考察了在EGCG存在時不同壓力條件下PPO結構的變化，旨在為今后類似研究提供參考，從而推動HPP技術的進一步推廣應用與產業升級。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蘑菇多酚氧化酶（PPO，119 kDa），美國Sigma公司；表沒食子兒茶素沒食子酸酯（純度＞98%）、矢車菊素-3-O-葡萄糖苷（純度＞95%）和阿魏酸（純度＞99%），上海源葉生物科技有限公司；鄰苯二酚及其他分析純試劑，北京索萊寶試劑公司。

1.2 儀器與設備

CQC30L-600超高壓處理設備，北京速原中天科技股份公司；HH-2數顯恒溫水浴鍋，江蘇省金壇市宏華儀器廠；UV-1800可見分光光度計，日本島津有限責任公司；PFS-300快速熱封口機，德清拜杰電器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 樣品制備

溶液的制備參考Tian等[2]的方法并稍作修改。將PPO粉末和抑制劑分別溶解到磷酸鹽緩沖液（50 mmol/L，pH=6.8）中，然后將PPO溶液與抑制劑溶液按比例混合，使得混合液的終體積為5 mL，不足的體積以緩沖液補足。在37 ℃下孵育20 min后立即進行酶活檢測。其中，EGCG的濃度分別為（0.125～4.5００）×10-4 mol/L，C3G濃度為（0.20～9.0）×10-5 mol/L，FA濃度為（0.25～7.2０）×10-4 mol/L。PPO終濃度為0.83×10-6 mol/L。

1.3.2 樣品處理

參考Zhou等[9]的方法，將5 mL混合好的酶液裝入聚乙烯透明袋（8 cm×12 cm）內，在冰浴下迅速完成熱封。隨后將樣品置于超高壓處理設備中，在室溫（20±2）℃ 下進行處理。設置處理壓強分別為200、400、550 MPa，保壓時間為20 min。設備的升壓速率約為280 MPa/min，卸壓時間小于3 s。

1.3.3 多酚氧化酶（PPO）活性測定

根據Tian等[2]的方法，準確吸取0.5 mL酶液于石英比色皿中，加入2 mL鄰苯二酚溶液（50 mmol/L，以pH=6.8的磷酸緩沖液配制）后搖勻，立即使用紫外分光光度計進行吸光度測定。設定檢測波長為420 nm，檢測間隔為1 s，數據采集60次。PPO的酶活性定義為在1 min反應時間內每1 mL酶促反應體系吸光度變化0.01為1個活性單位（U/mL）。未添加任何抑制劑的酶液被用作空白對照，各樣品的最終結果以相對殘余酶活RA表示，計算公式見式（1）。

RA/%＝■×100（1）

式中，RA為相對殘余酶活，%；A為處理后樣品中酶活性，U/mL；A0為處理前樣品中酶活性，U/mL。

1.3.4 分子動力學模擬

參考Tian等[2]的方法，在顯式溶劑化條件下，使用GROMACS 2019.6程序進行分子動力學模擬。使用PDB數據庫（https：//www.rcsb.org）中的PPO晶體結構（PDB ID：2Y9X），并采用constrain方法對雙核銅與6個組氨酸殘基的配位鍵進行限制。通過PubChem數據庫（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov）下載EGCG的3D立體化學結構，并使用Multiwfn重新計算RESP電荷[15]。力場設置為Amber99sb-ildn，使用TIP3P 水模型。使用Parrinello-Rahman方法將壓力耦合條件設置為200、400、600 MPa。在所有模擬中，短程非鍵合相互作用的截止值設置為1.0 nm，并使用PME方法計算長程靜電相互作用。應用LINCS算法來約束所有包含氫原子的鍵長度，對每個模擬體系均進行100 ns的運算。

1.4 數據處理

所有試驗均進行3次以上重復，試驗結果用“平均值±標準偏差”的形式來表示。應用SPSS 25對數據進行方差分析，P＜0.05表示差異顯著。使用Origin 2021繪圖。2 結果與分析

2.1 不同天然抑制劑對多酚氧化酶活性的影響

由圖1可知，EGCG、FA和C3G均表現出對PPO的抑制能力，而且抑制效果具有濃度依賴性。在研究的濃度范圍內，隨著EGCG或FA濃度的增加，PPO活性呈現先快速下降，后逐漸趨于平緩的趨勢。而隨著C3G濃度的增加，PPO活性始終維持線性下降趨勢，這與Zhou等[14]報道的結果一致。這些結果反映了以上3種抑制劑具有不同的PPO抑制機理。已有研究表明EGCG和FA是PPO的混合型抑制劑，而C3G則屬于不可逆抑制劑[2，13-14，16]。然而，EGCG可以直接與PPO的底物競爭活性位點，而FA只能結合在PPO的非活性區域，這可能是導致它們表現出類似的抑制趨勢，但是抑制能力不同的原因[2，17]。當EGCG的濃度為4.5×10-4 mol/L時，PPO的殘余酶活僅剩（22.96±0.46）%，而當FA濃度為9.0×10-4 mol/L時，PPO殘余酶活仍高達（66.34±0.76）%。此外，在7.2×10-5 mol/L的添加濃度下，C3G的存在使得PPO殘余酶活降低至（43.93±0.27）%。另一項研究發現，僅需添加1.8×10-4 mol/L的C3G即可使PPO幾乎完全滅活[14]。綜上，3種抑制劑均能有效地鈍化PPO活性，但是抑制機理和效力有所差異。由于3種抑制劑的抑制趨勢幾乎均在添加1/3最高濃度時發生明顯轉變，為了進一步研究不同抑制劑與HPP聯合處理的鈍酶效果，對于不同的抑制劑，分別選取了其最高添加濃度與1/3最高濃度這兩個濃度進行后續試驗。

圖1 EGCG（A）、C3G（B）和FA（C）的添加濃度對

PPO活性的影響

Fig.1 Effect of the add concentrations of EGCG （A）， C3G（B）， FA（C） on the activity of polyphenol oxidase

2.2 HPP與不同天然抑制劑聯合處理對多酚氧化酶活性的影響

由圖2可知，在不添加抑制劑的情況下，隨著處理壓力的增加，PPO殘余酶活先下降后上升，在600 MPa、20 min的處理條件下，殘余活性仍高達（83.87±1.40）%。田學智等[12]在使用超高壓處理渾濁蘋果汁的實驗中同樣發現，經550 MPa、5 min處理后樣品的PPO殘余酶活高達82.70%。

在不同濃度的C3G或FA存在時，隨著處理壓力的增加，PPO活性均表現出先下降后上升的趨勢。經200 MPa處理后，添加C3G或FA的4組聯合處理樣品的酶活均降至最低。此時，當C3G添加濃度為2.4×10-5 mol/L時，酶活最低值為（51.43±1.17）%，當濃度增加至7.2×10-5 mol/L時，酶活最低值顯著下降至（32.40±0.88）%。而在相同HPP處理條件下，不同濃度FA組的酶活差異很小，最低酶活數值也相近，分別為（48.05±2.40）%和（45.06±1.05）%。不同的是，高濃度的EGCG存在時，隨著處理壓力的增加，PPO殘余酶活整體保持下降趨勢。在600 MPa處理條件下，添加1.5×10-4 mol/L EGCG的樣品殘余酶活為（226.62±0.58）%，而添加4.5×10-4 mol/L EGCG的樣品殘余酶活僅剩（12.98±0.24）%，幾乎實現了對PPO的完全滅活?？紤]到EGCG早在2010年已被列入新資源食品名單，未來在食品領域具有廣泛的應用前景，因此有必要對其機理進行深入解析。

圖2 HPP與不同天然抑制劑聯合處理對PPO活性的影響

Fig.2 Effect of HPP treatments combined with different natural inhibitors on the activity of polyphenol oxidase

2.3 HPP與EGCG聯合處理影響PPO的分子動力學模擬分析

2.3.1 不同壓力條件下PPO回轉半徑、自由體積和疏水表面積的變化

回轉半徑代表了蛋白質結構的整體緊湊性[18]。如圖3A所示，在未加壓的條件下，EGCG的存在使得PPO的回轉半徑出現了顯著的下降，這表明了二者間存在強烈的相互作用。當施加200 MPa的壓力時，PPO的回轉半徑有所回升，隨著壓力增加至400 MPa以上時，PPO的回轉半徑顯著下降。這說明此時PPO發生了去折疊，內部高度折疊的疏水核空腔部分暴露在溶劑環境中。此時，PPO的活性中心可能會受到波及，導致空腔發生變形甚至被掩埋，進而影響與底物的結合[9]。由圖3B可知，PPO的自由體積不會受到EGCG的影響，但是會隨著壓力的升高逐漸降低。這同樣證實了HPP的壓縮效應導致PPO發生了去折疊。表面溶劑可及面積是描述蛋白質疏水性的重要參數。類似地，PPO的疏水表面積在EGCG存在時減少（圖3C），并且在壓力存在時，隨著壓力的增加持續下降，這可能與PPO發生去折疊后體積縮減有關。

2.3.2 不同壓力條件下PPO內部氫鍵、與水分子間氫鍵數量的變化

氫鍵在蛋白質折疊中起著核心作用。由圖4A可知，在常壓狀態下（0.1 MPa），PPO的內部氫鍵數目約為250個，單個EGCG分子的存在對整體氫鍵數目的影響不大。然而，當壓力提升至200～400 MPa時，PPO內部的氫鍵數目呈現降低的趨勢。這與黃業傳等[19]報道的木瓜蛋白酶內氫鍵在200 MPa下氫鍵數量減少的結果一致。當壓力繼續增加到600 MPa時，氫鍵數量回升。如圖4B所示，常壓下EGCG的存在同樣對PPO與水分子間的氫鍵數量影響有限。當環境壓力為200 MPa時，PPO與水分子間的氫鍵數目顯著增加。當壓力提升至400 MPa時，PPO與水分子間的氫鍵數目再次增加，但是在600 MPa下未出現更多變化。這說明壓力條件促進了PPO分子的去折疊和“溶劑化”，增強了PPO與水分子間的相互作用[9]。此時，PPO內部的氨基酸殘基暴露在水中，導致了內部氫鍵的破壞，并與水分子形成了新的氫鍵。

2.3.3 不同壓力條件下EGCG與PPO活性中心距離的變化

現有的晶體學結構表明，PPO的活性中心口袋包含一對雙核銅結構，主要負責對底物的催化功能[20]。如圖5所示，在常壓條件下，EGCG與PPO活性中心的最小距離僅有約0.45 nm，這表明它可以直接結合在PPO的活性中心附近。之前報道的一些酶動力學實驗和分子對接，以及分子動力學的結果均證實了這一點[2，16]。然而，這種結合很可能不夠穩定，在模擬后期，即80 ns以后，可以發現EGCG與PPO活性中心發生了明顯分離，最小距離由約0.6 nm陡增至1.0 nm以上。當施加200～400 MPa的壓力時，可以發現EGCG與PPO活性中心的最小距離始終穩定在約0.45 nm，表明壓力條件可以穩定EGCG與PPO的結合，這可能是結合了EGCG的PPO在HPP處理后活性再次下降的原因。當壓力達到600 MPa時，兩者間的距離反而有所增加。這可能是因為PPO的疏水內核受到破壞，部分水分子甚至進入PPO內部，使其原本高度折疊的空間構象發生了劇烈變化，活性中心因此被掩埋[9]。此時，PPO與EGCG的結合受到了阻礙，同理，PPO也難以識別并催化底物氧化，最終導致活性降低。

圖5 不同HPP處理條件EGCG與PPO活性中心

的最小距離

Fig.5 The minimum distance between EGCG and PPO active center under different HPP treatment conditions

3 結論

HPP單獨處理很難充分鈍化PPO，經過600 MPa、20 min處理后，PPO的殘余活性仍高達（83.87±1.40）%。經過HPP與EGCG、FA或C3G的聯合處理后，PPO的酶活顯著下降，尤其是4.5×10-4 mol/L EGCG與600 MPa、20 min的聯合處理幾乎實現了對PPO的完全鈍化。壓力可以增強EGCG與PPO活性中心之間的相互作用，此外，二者的聯合處理可以誘導PPO發生去折疊和疏水空腔暴露，導致整體空間構象改變，進而影響其對底物的識別和催化，這可能是PPO活性下降的主要原因。綜上，HPP與天然抑制劑的聯合處理策略表現出有效鈍化PPO的巨大潛力，未來有必要對其進行更深入的機制探索和更廣泛的應用研究。

參考文獻：

[1] IQBAL A， MURTAZA A， HU W F， et al. Activation and inactivation mechanisms of polyphenol oxidase during thermal and non-thermal methods of food processing[J]. Food and Bioproducts Processing， 2019， 117： 170-182.

[2] TIAN X， RAO L， ZHAO L， et al. Multispectroscopic and computational simulation insights into the inhibition mechanism of epigallocatechin-3-gallate on polyphenol oxidase[J]. Food Chemistry， 2022， 393： 133415.

[3] BASAK S， CHAKRABORTY S. The potential of nonthermal techniques to achieve enzyme inactivation in fruit products[J]. Trends in Food Science amp; Technology， 2022， 123： 114-129.

[4] ROOBAB U， ABIDA A， AFZAL R， et al. Impact of high-pressure treatments on enzyme activity of fruit-based beverages： An overview[J]. International Journal of Food Science amp; Technology， 2022， 57（2）： 801-815.

[5] ZHOU L， LIAO T， LIU W， et al. Inhibitory effects of organic acids on polyphenol oxidase： From model systems to food systems[J]. Critical Reviews in Food Science and Nutrition， 2020， 60（21）： 3594-3621.

[6] MARTINEZ-RODRIGUEZ Y， ACOSTA-MUNIZ C， OLIVAS G I， et al. High hydrostatic pressure processing of cheese[J]. Comprehensive Reviews in Food Science and Food Safety， 2012， 11（4）： 399-416.

[7] CHEN L H， WANG Y Y， ZHU C， et al. Effects of high-pressure processing on aquatic products with an emphasis on sensory evaluation[J]. International Journal of Food Science and Technology， 2022， 57（11）： 6980-6996.

[8] HUANG H W， WU S J， LU J K， et al. Current status and future trends of high-pressure processing in food industry[J]. Food Control， 2017， 72： 1-8.

[9] ZHOU H L， WANG F H， NIU H H， et al. Structural studies and molecular dynamic simulations of polyphenol oxidase treated by high pressure processing[J/OL]. Food Chemistry， 2022， 372， [2022-03-15]. https：//doi.org/10.1016/j.foodchem.2021.131243

[10]" YI J J， YI J Y， DONG P， et al. Effect of high-hydrostatic-pressure on molecular microstructure mushroom （Agaricus bisporus） polyphenol oxidase[J]. LWT-Food Science and Technology， 2015， 60（2）： 890-898.

[11]" 田學智， 劉一璇， 王芯媛， 等. 超高壓處理對新疆復合果汁貯藏期微生物及品質的影響[J]. 食品科技， 2022， 47（5）： 127-134.

[12]" 田學智， 曹智鴻， 江乃相， 等. 高靜壓聯合天然抑制劑處理對渾濁蘋果汁多酚氧化酶活性及相關品質的影響[J/OL]. 食品科學， 1-11， [2024-06-07]. http：//kns.cnki.net/kcms/detail/11.2206.TS.20240607.1131.014.html

[13]" YU Q， FAN L P. Understanding the combined effect and inhibition mechanism of 4-hydroxycinnamic acid and ferulic acid as tyrosinase inhibitors[J/OL]. Food Chemistry， [2021-08-01]. https：//doi.org/10.1016/j.foodchem.2021.129369

[14]" ZHOU L， XIONG Z Q， LIU W， et al. Different inhibition mechanisms of gentisic acid and cyaniding-3-O-glucoside on polyphenol oxidase[J]. Food Chemistry， 2017， 234： 445-454.

[15]" LU T， CHEN F W. Multiwfn： A multifunctional wavefunction analyzer[J]. Journal of Computational Chemistry， 2012， 33（5）： 580-592.

[16]" SONG X， NI M T， ZHANG Y， et al. Comparing the inhibitory abilities of epigallocatechin-3-gallate and gallocatechin gallate against tyrosinase and their combined effects with kojic acid[J/OL]. Food Chemistry， [2021-07-01]. https：//doi.org/10.1016/j.foodchem.2021.129172

[17]" YU Q， FAN L P， DUAN Z H. Five individual polyphenols as tyrosinase inhibitors： Inhibitory activity， synergistic effect， action mechanism， and molecular docking[J/OL]. Food Chemistry， [2019-11-01]. https：//doi.org/10.1016/j.foodchem.2019.05.184

[18]" GU Z H， LAI J L， HANG J H， et al. Theoretical and experimental studies on the conformational changes of organic solvent-stable protease from DS11 in methanol/water mixtures[J]. International Journal of Biological Macromolecules， 2019， 128： 603-609.

[19]" 黃業傳， 張喜才， 曾奕秀， 等. 高壓處理對木瓜蛋白酶活性的影響及分子動力學模擬 [J]. 食品工業科技， 2023， 44（12）： 102-107.

[20]" ISMAYA W T， ROZEBOOM H J， WEIJN A， et al. Crystal structure of Agaricus bisporus mushroom tyrosinase： Identity of the tetramer subunits and interaction with tropolone[J]. Biochemistry， 2011， 50（24）： 5477-5486.

收稿日期：2024-10-09

基金項目：貴州省科技計劃項目（黔科合成果〔2022〕一般024）

第一作者簡介：田學智（1997—），男，在讀博士，研究方向為果蔬非熱加工和果蔬內源酶活性調控

*通信作者簡介：王永濤（1983—），男，教授，博士，主要從事食品非熱加工和食品組分相互作用等研究工作