‘湘辣14號’辣椒葉綠體全基因組特征及進化關系分析

摘 要：以‘湘辣14號’辣椒幼嫩葉片為材料，采用Illumina NovaSeq 6000平臺對其進行測序，獲得‘湘辣14號’葉綠體全基因組序列，利用生物信息學對‘湘辣14號’葉綠體基因組結構特征、重復序列、密碼子使用偏性、IR邊界、核苷酸多樣性以及進化關系進行分析。結果表明，‘湘辣14號’葉綠體基因組全長為156 817 bp，為典型的四分體結構，總GC含量為37.72%。共注釋132個基因，包括87個蛋白編碼基因、8個rRNA基因、37個tRNA基因。在‘湘辣14號’葉綠體基因組中鑒定到61個分散重復序列和190個簡單重復序列（simple sequence repeat，SSR）位點，其中單核苷酸重復最多，主要以A/T為主，占總SSR數量的53.16%。密碼子分析表明，‘湘辣14號’葉綠體基因組密碼子第三位堿基偏向使用A/U。IR區相對LSC和SSC更為保守，部分基因存在收縮和擴張現象。共在‘湘辣14號’葉綠體基因組中獲得5個高變異區：clpP、rpl20、cemA、rpl32、ycf1。進化關系分析說明，‘湘辣14號’與辣椒C. annuum（OP919650.1）和C. annuum（JX27081.1）的親緣關系較近，屬于辣椒屬植物。本研究為‘湘辣14號’的性狀改良和分子標記研究提供了數據支撐。

關鍵詞：‘湘辣14號’；辣椒屬；葉綠體基因組；基因組特征；進化關系

中圖分類號：S602 文獻標志碼：A 文章編號：1008-1038（2024）12-0038-08

DOI：10.19590/j.cnki.1008-1038.2024.12.007

Analysis of Chloroplast Genome Characteristics and Evolutionary Relationship of Capsicum annuum ‘Xiangla No.14’

HE Daoshan1， HE Haiyan1， XIE Wei1， LUO Zhiguo1， ZHANG Tiejun3， QIN Yalin2， LI Peng1*

（1. Xiangtan Institute of Agricultural Sciences， Xiangtan 411134， China; 2. Hunan University of Humanities， Science and Technology， Loudi 417000， China; 3. Xiangshui Township Agricultural Center， Yuhu District， Xiangtan 411134， China）

Abstract： Based on Illumina NovaSeq 6000 sequencing， the entire chloroplast genome sequence of Capsicum annuum cv ‘Xiangla No.14’ was obtained， and its chloroplast genome structure and features， repeat sequence， codon usage bias， IR boundary， nucleotide diversity and evolutionary relationship were determined using bioinformatics method. The ‘Xiangla No.14’ chloroplast genome displayed a typical quadripartite structure with a size of 156 817 bp， and the whole GC content was 37.72%. A total of 132 genes were annotated， comprising 87 protein-coding genes， 8 rRNA genes， 37 tRNA genes in ‘Xiangla No.14’ chloroplast genome. In total of 61dispersed repeats and 190 SSR were detected in ‘Xiangla No.14’ chloroplast genome. The most type was single nucleotide repeats， which mainly included A and T， accounting for 53.16% of the total number of SSR. Codon analysis showed that the third base of the chloroplast genome of ‘Xiangla No.14’ was biased towards A/U. The IR region was more conservative than LSC and SSC regions， and some genes existed expansion and contraction. Five mutation hotspots， namely， clpP， rpl20， cemA， rpl32， and ycf1 were obtained in ‘Xiangla No.14’ chloroplast genome. Phylogenetic analysis revealed that ‘Xiangla No.14’ was closely related with C. annuum （OP919650.1） and C. annuum （JX27081.1）， which belonged to C. genus. The findings of this study provided data support for the characteristics improvement and molecular marker study of ‘Xiangla No.14’ in the future.

Keywords： ‘Xiangla No.14’; Capsicum genus; chloroplast genome; genome characteristics; evolutionary relationship

辣椒（Capsicum annuum）屬于茄科（Solanaceae）辣椒屬（Capsicum）一年生或有限多年生植物，起源于印度，在熱帶和溫帶地區均大面積栽培[1]。辣椒有多種藥理和生理作用，包括鎮痛、抗炎、抗氧化和抗肥胖等[2]。辣椒富含多種刺激性化合物，其中辣椒素（反式-8-甲基-N-香草基-6-壬烯酰胺）是主要的刺激性化合物[2]。目前，辣椒是市場上重要的香料作物和蔬菜[3]，果實富含辣椒素、花色素、類胡蘿卜素等多種生物活性物質，其中花色素和類胡蘿卜素作為天然色素和抗氧化劑，在食品、醫藥等領域發揮重要作用[4]。

高等植物的葉綠體基因組通常為四分體結構，由一個大單拷貝區（large single copy region，LSC）、一個小單拷貝區（small single copy region，SSC）和一對反向重復區（inverted repeat regions，IRs）組成[5]。葉綠體基因組相對較小，且結構高度保守，是研究復雜植物種群系統發育的理想材料[5-6]。如Carrizo García等[7]利用核基因waxy和葉綠體基因psbA-trnH、matK確定了34種辣椒屬植物的地理起源和種間關系。Zhong等[8]對147份辣椒屬種質資源進行簡單重復序列（simple sequence repeat，SSR）標記，以比較這些辣椒植物的遺傳多樣性特征。Magdy等[9]利用泛質體基因組對辣椒屬進行了鑒定和分類研究，發現ycf3-trnS、rps16-trnQ、rbcL-accD多態性位點可用于系統發育關系研究。利用葉綠體基因trnL-trnF、rpl32-trnL、psbA-trnH、ndhF-rpl32和核基因waxy對4個來自熱帶安第斯山脈的辣椒新品種進行了系統進化分析，明確了辣椒新品種的進化關系[10]。可見，葉綠體基因組豐富了人們對辣椒生物學和進化的理解，有利于對高品質辣椒的進一步改良，為辣椒鑒定和種群研究提供可靠的分子工具。‘湘辣14號’是中熟雜交線椒品種，具有果皮薄、肉質脆、果實線形、味辣、風味佳等特點，營養價值和經濟價值較高，深受青睞。‘湘辣14號’在湖南、海南、廣西等地大面積種植，經連續種植后出現辣椒品質和遺傳多樣性下降的現象[11]，因此，基于高通量測序技術的不斷完善以及費用的降低，獲得更多的辣椒葉綠體全基因組序列，利用葉綠體基因組開展辣椒性質改良、分類鑒定和分子標記等研究，對進一步提高辣椒品質和產量具有非常重要的意義。

本研究以辣椒屬‘湘辣14號’幼嫩葉片為材料，基于Illumina NovaSeq 6000高通量測序技術，獲得‘湘辣14號’的葉綠體全基因組序列，利用生物信息學手段比較‘湘辣14號’與其他近緣物種的葉綠體基因組差異，并基于17種重要的茄科植物和2個外群進行系統進化關系的比較分析，通過核苷酸多樣性比較分析，獲得‘湘辣14號’變異度較高的區域，為后續‘湘辣14號’的性狀改良、分子標記以及進化關系研究提供理論依據，為辣椒優良種質的合理保護與利用提供技術支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

‘湘辣14號’樣品采自位于湖南省湘潭市雨湖區（27°51′N、112°54′E）的湘潭市農業科學研究所種苗中心。

選擇苗齡50 d且無病蟲害的幼嫩新鮮葉片，立即將其幼葉放入液氮速凍，置于-80 ℃冰箱保存。試驗于2023年7月—2024年4月在湘潭市農業科學研究實驗室進行。

1.2 總DNA的提取

采用改良CTAB法提取‘湘辣14號’的總DNA，然后用1%瓊脂糖凝膠電泳和超微量分光光度計（one drop，OD-1000+）檢測‘湘辣14號’總DNA完整性和濃度[12]。

1.3 葉綠體全基因組測序、組裝及注釋

將合格的‘湘辣14號’總DNA樣品送到南京集思慧遠生物科技有限公司，采用Illumina NovaSeq 6000進行測序，測序讀長為150 bp。采用FastQC對末端Illumina讀數質量進行評估，并用Fastp v0.20.0剪切低質量的Illumina讀數。使用SPAdes v3.10.1軟件，以NCBI已報道的辣椒葉綠體基因組（NC_033526.1）作為參考，重新組裝‘湘辣14號’過濾后的Illumina讀數，并采用GeSeq軟件對‘湘辣14號’的蛋白質編碼基因、tRNA基因、mRNA基因進行注釋[13]，采用CPGAVAS2對蛋白質編碼基因進行注釋[14]，進一步使用BLAST對‘湘辣14號’葉綠體基因組注釋進行人工校正，以提高‘湘辣14號’的注釋質量。采用OGDRAW軟件制作‘湘辣14號’葉綠體基因組圖譜。最后，將完整的‘湘辣14號’葉綠體基因組上傳至NCBI網站，登錄號為OR551752.1。

1.4 重復序列分析

采用REPuter對‘湘辣14號’葉綠體基因組的分散重復序列進行分析，最小海明距離、最小重復長度、最大計算重復次數分別設置為3 bp、30 bp、5 000次。采用MISA軟件對‘湘辣14號’葉綠體基因組的SSR進行鑒定，單核苷酸至六核苷酸的重復參數分別設定為8、5、3、3、3和3[15]。

1.5 密碼子偏好性分析

采用CodonW 1.4.2工具分析和計算‘湘辣14號’葉綠體基因組的相對同義密碼子使用度（relative synonymous codon usage，RSCU）。如果RSCU大于1，說明‘湘辣14號’密碼子偏好性較強；RSCU等于1，說明‘湘辣14號’密碼子不顯示偏好性；RSCU小于1，說明‘湘辣14號’密碼子偏好性較弱[5]。

1.6 葉綠體基因組比較分析

采用IR SCOPE軟件對7個物種的LSC、IRb、SSC、IRa區域進行比較分析，并可視化IR邊界的收縮和擴展。采用DnaSP v.6工具計算‘湘辣14號’每個編碼基因的核酸多樣性（nucleic acid diversity，Pi），以確定‘湘辣14號’的核酸變異度[16]。

1.7 進化關系分析

對本研究得到的‘湘辣14號’葉綠體全基因組序列以及另外16個同科植物和2個外群[Liriodendron chinense（NC_030504.1）和Amborella trichopoda（NC_005086.1）]進行進化關系分析。采用MrBayes v3.2.7a工具構建貝葉斯進化樹，選擇GTR+I+G模型，Ngammacat設置為5。

1.8 數據處理

運用Excel 2010對實驗數據進行處理與分析。

2 結果與分析

2.1 葉綠體基因組基本特征

‘湘辣14號’葉綠體全基因組為一個閉合環狀雙鏈結構，呈典型的4分體結構，全長為156 817 bp，包含一個長為87 380 bp LSC，一個長為17 853 bp SSC，IR區（IRa和IRb）均為 25 792 bp（表1）。整個‘湘辣14號’葉綠體基因組中的堿基G+C（GC）含量為37.72%，IR中GC含量最高，為43.05%，LSC中GC含量次之，為35.74%，SSC中GC含量最低，為32.01%。在‘湘辣14號’葉綠體基因組中共注釋到132個基因，其中87個蛋白編碼基因、37個tRNA、8個rRNA。編碼蛋白基因可劃分為4類：45個光合作用相關基因，29個自我復制相關基因，5個其他基因和8個未知功能的基因。共19個基因含有1個內含子，分別為ndhA、ndhB（2）、petB、petD、atpF、rpl16、rpl2（2）、rps16、rpoC1、trnA-UGC（2）、trnG-UCC、trnI-GAU（2）、trnK-UUU、trnL-UAA、trnV-UAC；4個基因含有2個內含子，分別為rps12（2）、clpP、ycf3。

2.2 重復序列分析

在‘湘辣14號’葉綠體基因組中鑒定到61個分散重復序列，包括38個正向重復序列，21個回文重復序列和2個反向重復序列，沒有檢測到互補重復序列。其中60個分散重復序列長度為30～107 bp，占比最高的長度是30 bp，共10個；其次是39 bp，共7個；此外，1個最長分散重復序列，為25 792 bp（見圖1）。在‘湘辣14號’葉綠體基因組中共鑒定到190個SSR位點，其中LSC、SSC、IR中的SSR位點分別為127、25、38個（見圖2）。單核苷酸重復序列、二核苷酸重復序列、三核苷酸重復序列、四核苷酸重復序列、五核苷酸重復序列、六核苷酸重復序列分別為103、7、69、8、2、1個。此外，單核苷酸重復序列以A/T為主，占總SSR數量的53.16%，二核苷酸重復序列以AT/TA為主，占總SSR數量的3.16%，而三核苷酸重復序列以AAT/ATT為主（見圖2）。可見，這些SSR序列含有較高的AT含量支持了‘湘辣14號’葉綠體基因組中高的AT含量（62.28%）這一結論。

圖1 ‘湘辣14號’葉綠體基因組的分散重復序列分析

Fig.1 Dispersed repeats analysis of ‘Xiangla No.14’ chloroplast genome

圖2 ‘湘辣14號’葉綠體基因組的簡單重復序列分析

Fig.2 SSRs analysis of ‘Xiangla No.14’ chloroplast genome

2.3 密碼子偏好性分析

‘湘辣14號’葉綠體基因組相對同義密碼子使用度分析見圖3。

圖3 ‘湘辣14號’葉綠體基因組相對同義密碼子使用度分析

Fig.3 RSCU analysis of ‘Xiangla No.14’ chloroplast genome

在‘湘辣14號’葉綠體基因組中發現密碼子共有26 990個，編碼20種氨基酸。除終止密碼子外，編碼亮氨酸（CUA、CUC、CUG、CUU、UUA、UUG）、 異亮氨酸（AUA、AUC、AUU）、絲氨酸（AGC、AGU、UCA、UCC、UCG、UCU）的密碼子最多，分別為2 882、2 249和 2 105 個，而編碼蛋氨酸（AUG、GUG）、色氨酸（UGG）、半胱氨酸（UGC、UGU）的密碼子最少，分別為 625、485、305個。相對同義密碼子（RSCU）大于1的密碼子共有31個，AUG的RSCU值最高，為6.966 4；GUG的RSCU值最低，為0.033 6；UGG的RSCU等于1，無偏好性；以A或U結尾的密碼子有29個，以G結尾的密碼子有2個，沒有以C結尾的密碼子，說明‘湘辣14號’偏好使用A或U結尾的密碼子。

2.4 IR邊界比較分析

利用IR scope工具比較了‘湘辣14號’、三分三（Anisodus acutangulus，NC_066481）、辣椒（C. annuum，JX270811）、曼陀羅（Datura metel，OK040953）、莨菪（Hyoscyamus muticus，MZ450974）、黑枸杞（Lycium ruthenicum，OP846050）、番茄（Solanum lycopersicum，NC_007898）的葉綠體基因組LSC、SSC和IR的邊界區域收縮與擴張情況（圖4）。

圖4 8種植物葉綠體基因組邊界分析

Fig.4 Boundary analysis of eight chloroplast genomes

這7種茄科植物的葉綠體基因組全長差異較小，長度范圍為154 976～156 817 bp，但各邊界區域存在收縮與擴張現象。在LSC/IRb邊界，除了莨菪外，其他6個物種的rps19均位于JLB中，‘湘辣14號’、三分三、辣椒、曼陀羅、黑枸杞、番茄中的rps19分布在IRb中長度分別為66、75、66、63、61、92 bp；‘湘辣14號’、三分三、辣椒、曼陀羅、莨菪、黑枸杞、番茄中的rpl2基因朝IRb分別進入139、149、142、137、26、132、159 bp。在SSC/IRb邊界，‘湘辣14號’、三分三、曼陀羅、莨菪、黑枸杞中的ycf1基因分布在SSC中長度分別為33、26、24、14、1 bp，辣椒和黑枸杞中的trnN基因朝IRb分別進入1 457、1 323 bp，7個物種的ndhF基因朝SSC進入3～52 bp。在 SSC/IRa邊界，‘湘辣14號’、三分三、辣椒、曼陀羅、莨菪、黑枸杞、番茄中的ycf1基因分布在IRa區中長度分別為1 128、1 465、1 128、1 101、1 444、995、1 119 bp，7個物種的trnN基因朝IRa區進入1 323～1 793 bp。在 IRa/LSC邊界，7個物種的rpl2基因朝IRa區進入26～159 bp，而trnH朝LSC區進入長度范圍為1～96 bp。

2.5 核酸多態性分析

利用DnaSPv.6軟件，對‘湘辣14號’和另外7種植物葉綠體基因組的核苷酸多態性（Ｐi）進行了比較分析（圖5）。整個葉綠體基因組的Pi值范圍為0～0.058 25，平均值為0.009 7；SSC中的Pi平均值最高，為0.020 48；LSC中的Pi平均值次之，為0.009 687；IR區域中的Pi平均值最低，為0.001 525。說明‘湘辣14號’葉綠體基因組中的IR區域比LSC和SSC區域更為保守。共在‘湘辣14號’葉綠體基因組中鑒定到5個高變異區域Pi（≥0.03），其中3個位于LSC區，分別為clpP（0.058 25）、rpl20（0.046 39）、cemA（0.043 13）；2個位于SSC區，分別為rpl32（0.049 65）、ycf1（0.0455 9）。以上結果表明，clpP、rpl20、cemA、rpl32和ycf1今后可能作為辣椒種群研究的分子標記。

圖5 8種植物葉綠體基因組核苷酸多態性分析

Fig.5 Pi analysis of eight chloroplast genomes

2.6 進化樹分析

為了確定‘湘辣14號’的系統發育關系，采用MrBayes v3.2.7a，以鵝掌楸Liriodendron chinense和互葉梅Amborella trichopoda為外群，對‘湘辣14號’以及16個重要的且具代表性的茄科物種進行聚類分析，包括2個辣椒屬植物Capsicum L.，4個茄屬植物Solanum L.，2個曼陀羅屬植物Datura L.，3個山莨菪屬植物Anisodus L.，1個莨菪屬植物Hyoscyamus L.，4個枸杞屬植物Lycium L.，構建貝葉斯進化樹（圖6）。進化樹分析表明，將17種茄科植物劃分為6個主要進化枝，分別為Capsicum、Solanum、Datura、Anisodus、Hyoscyamus、Lycium，各進化枝的節點支持率均為100%。其中‘湘辣14號’與另外2個辣椒品種位于辣椒屬Capsicum進化枝上，且‘湘辣14號’與辣椒C. annuum（OP919650.1）和C. annuum（JX27081. 1）的支持率均為100%，與兩個外群植物相距較遠，說明‘湘辣14號’與C. annuum（OP919650.1）和C. annuum（JX27081. 1）的親緣關系較近，屬于辣椒屬植物。

圖6 進化樹分析

Fig.6 Phylogenetic tree analysis

3 結論

本研究成功利用高通量測序技術獲得了‘湘辣14號’葉綠體全基因組序列，并對其基因組特征進行了分析，共獲得61個分散重復序列和190個SSR位點，‘湘辣14號’密碼子使用模式為NNA或NNU，共在‘湘辣14號’葉綠體基因組中獲得5個高變異區：clpP、rpl20、cemA、rpl32、ycf1。進化關系分析說明‘湘辣14號’與辣椒C. annuum（OP919650.1）和C. annuum（JX27081.1）的親緣關系較近，屬于辣椒屬植物。綜上，本研究為‘湘辣14號’的性狀改良和分子標記的研究提供數據支撐。

4 討論

‘湘辣14號’作為湖南地區栽培面積較大且深受人們喜愛的一種重要蔬菜和香料作物，由于多年連續栽培出現了品質下降的現象。本研究基于Illumina NovaSeq 6000平臺得到了茄科辣椒屬‘湘辣14號’的葉綠體全基因組序列。‘湘辣14號’葉綠體基因組全長為156 817 bp，為典型的4分體結構，GC含量為37.72%，共注釋132個基因。Raveendar等[17]利用Illumina平臺獲得了韓國農家‘Subicho’（C. annuum var. Annuum）辣椒品種的葉綠體全基因組序列，全長為156 878 bp，GC含量為37.7%，共鑒定132個基因 。Raveendar 等[18]發現中華辣椒（C. chinense Jacq）葉綠體基因組全長為156 807 bp，GC含有為37.7%，共鑒定113個基因。‘湘辣14號’的葉綠體基因組全長介于‘Subicho’辣椒和中華辣椒之間，鑒定基因數與‘Subicho’辣椒相同，高于中華辣椒，可能是不同辣椒品種具有不同的遺傳特性所導致的差異。以上研究說明，辣椒不同品種在基因組長度、基因種類、基因數量方面存在一定的差異，為未來開展辣椒品種鑒定和遺傳多樣性評價打下堅實的基礎。

重復序列和簡單重復序列（SSR）廣泛分布在植物葉綠體基因組中[19]。本研究在‘湘辣14號’中檢測到61個重復序列，正向重復占比最高，其次是回文重復，互補和反向重復占比較小，這與白絲瓜（Luffa cylindrica）、寧夏枸杞（Lycium barbarum）、黑果枸杞（Lycium ruthenicum）相一致[6，20]。在‘湘辣14號’中沒有發現互補重復序列，同樣，在白絲瓜中沒有檢測到互補重復序列和反向重復序列[6]。由于SSR具有高度的變異性和隱性遺傳性，已被廣泛用于物種鑒定、遺傳多樣性研究以及確定系統發育關系[19]。山茶科（Cyatheaceae）葉綠體基因組的SSR的分布特征已被證明可用于屬間分類[21]。本研究在‘湘辣14號’葉綠體基因組中鑒定到190個SSR位點，其中LSC中的SSR位點數最多，為127個，這與韓國農家‘Subicho’辣椒和‘Glabriusculum’（C. annuum var. glabriusculum）辣椒中的發現一致[22]。‘湘辣14號’葉綠體基因組中以單核SSR和三核SSR為主，且單核SSR以A和T組成為主，且含有較豐富的AT含量，這與11種辣椒品種相一致[23]；龔秋怡等[24]在牛茄子（Solanum capsicoides）葉綠體基因組中檢測到單核SSR最多，占總SSR數的45.1%，大多數單核SSR以A和T構成為主。

密碼子在生物體遺傳信息傳遞中扮演著重要的作用，是連接核苷酸、蛋白質和遺傳物質的重要紐帶[25]。已有大量研究學者指出，在高等植物中，密碼子偏向使用A/U結尾[5-6，26]。本研究在‘湘辣14號’中發現31個高頻密碼子，其中29個密碼子以A或U結尾，占93.55%，這與燈籠辣椒（C. baccatum var. baccatum）的密碼子使用模式NNA或NNU相同[27]。說明了‘湘辣14號’葉綠體基因組密碼子的使用模式為NNA或NNU。

核酸多態性分析是反映DNA序列變異程度的指標，其變異位點可用于物種遺傳多樣性的研究[24]。本研究在‘湘辣14號’葉綠體基因組中鑒定到5個高變異區域，其中3個位于LSC區，分別為clpP、rpl20、cemA；2個位于SSC區，分別為rpl32、ycf1，這與其他被子植物相一致[19]。D’agostino等[23]在11個辣椒屬植物中也同樣鑒定了rpl20、ycf1等高度變異熱點。Niu等[5]通過研究，在直緣烏頭（Aconitum transsectum）葉綠體基因組中發現5個高度變異熱點，分別為rpl20、ycf1、psaI、clpP、rpl14。本研究發現的5個高度變異熱點（clpP、rpl20、cemA、rpl32、ycf1）可作分子標記用于辣椒屬種間物種鑒定。

為進一步確定‘湘辣14號’在系統發育中的地位，進化樹分析表明，‘湘辣14號’與辣椒C. annuum（OP919650.1）和C. annuum（JX27081. 1）聚為一支，且支持率為100%，說明與這兩個辣椒品種親緣關系最近，確定了‘湘辣14號’與辣椒屬植物的親緣關系。Bie等[28]研究發現，辣椒（C. annuum，NC_018552.1）與無毛辣椒（C. galapagoense，NC_033524.1）親緣關系最近。隨著辣椒屬植物葉綠體基因組報道的增多，葉綠體基因組也可能為辣椒屬分類鑒定和分子標記提供遺傳信息。

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收稿日期：2024-09-09

基金項目：2021年度湘潭市科技局市級科技創新項目-地方特色品種黃荊坪竹根椒種質資源（NY-ZD20211004）

第一作者簡介：何刀山（1973—），男，高級農藝師，本科，主要從事園藝作物栽培技術工作

*通信作者簡介：李鵬（1989—），男，農藝師，碩士，主要從事園藝作物栽培技術工作