柴胡皂苷D通過NLRP3介導細胞焦亡抑制未分化甲狀腺癌細胞增殖的機制研究

〔摘要〕 目的 研究柴胡皂苷D通過NOD樣受體蛋白3（NOD-like receptor protein 3，NLRP3）介導細胞焦亡，抑制未分化甲狀腺癌細胞增殖的作用及機制。方法 培養未分化甲狀腺癌細胞株HTh83和KMH2，不同濃度柴胡皂苷D（1、4、7、10、13、16、19、22、25、28、31、34、37 μmol/L）作用48 h后檢測細胞存活率，計算半數抑制濃度（50% inhibition concentration，IC50）；細胞分為對照組（0 μmol/L柴胡皂苷D）、低濃度組（2.2 μmol/L柴胡皂苷D）、中濃度組（11 μmol/L柴胡皂苷D）、高濃度組（22 μmol/L柴胡皂苷D）、si-NC組（轉染NC siRNA）、高濃度+si-NC組（22 μmol/L柴胡皂苷D聯合轉染NC siRNA）、高濃度+si-NLRP3組（22 μmol/L柴胡皂苷D聯合轉染NLRP3 siRNA），處理48 h后檢測克隆形成數目，NLRP3、裂解型Caspase-1、GSDMD氨基末端片段（GSDMD N terminal fragment， GSDMD-N）的表達水平及培養基中白細胞介素-1β（interleukin-1β， IL-1β）、白細胞介素-18（interleukin-18， IL-18）的水平。結果 柴胡皂苷D以濃度依賴的方式降低HTh83細胞和KMH2細胞的存活率（P<0.05）；低濃度組、中濃度組、高濃度組的細胞克隆數目低于對照組（P<0.05），NLRP3、裂解型Caspase-1、GSDMD-N的表達水平及培養基中IL-1β、IL-18的水平高于對照組（P<0.05）；高濃度+si-NLRP3組細胞的存活率及克隆數目高于高濃度+si-NC組（P<0.05），NLRP3、裂解型Caspase-1、GSDMD-N的表達水平及培養基中IL-1β、IL-18的水平低于高濃度+si-NC組（P<0.05）。結論 柴胡皂苷D能顯著抑制未分化甲狀腺癌細胞增殖，其作用機制可能與激活NLRP3，介導細胞焦亡有關。

〔關鍵詞〕 未分化甲狀腺癌；柴胡皂苷D；增殖；NOD樣受體蛋白3；焦亡

〔中圖分類號〕R285.5 〔文獻標志碼〕A 〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674－070X.２０24.10.011

Mechanism of saikosaponin D in inhibiting the proliferation of anaplastic thyroid cancer cells via NLRP3-mediated pyroptosis

GAO Fang1， LI Jun1， GUO Yanxia2， LI Hong3*

1. Department of Pharmacy， Tangshan Fengnan District Hospital of Chinese Medicine， Tangshan， Hebei 063300， China;

2. Department of Pharmacy Preparation， Tangshan Fengnan District Hospital of Chinese Medicine， Tangshan， Hebei 063300， China; 3. Department of Pharmacy， Tangshan Hospital of Chinese Medicine， Tangshan， Hebei 063300， China.

〔Ａｂｓｔｒａｃｔ〕 Objective To study the effects and mechanism of saikosaponin D in inhibiting the proliferation of anaplastic thyroid cancer cells via NOD-like receptor protein 3 （NLRP3）-mediated pyroptosis. Methods Anaplastic thyroid cancer cell lines HTh83 and KMH2 were cultured and treated with various concentrations of saikosaponin D （1， 4， 7， 10， 13， 16， 19， 22， 25， 28， 31， 34， 37 μmol/L） for 48 h. Cell survival rate was subsequently measured and half-maximal inhibitory concentration （IC50） was calculated. The cells were divided into control group （0 μmol/L saikosaponin D）， low concentration group （2.2 μmol/L saikosaponin D）， medium concentration group （11 μmol/L saikosaponin D）， high concentration group （22 μmol/L saikosaponin D） and si-NC group （transfected with NC） siRNA）， high concentration+si-NC group （22 μmol/L saikosaponin D co-transfected with NC siRNA）， and high concentration+si-NLRP3 group （22 μmol/L saikosaponin D co-transfected with NLRP3 siRNA）. After 48 h of treatment， the colony formation was quantified， the expression levels of NLRP3， cleaved caspase-1， and GSDMD N terminal fragment （GSDMD-N） as well as the levels of interleukin-1β （IL-1β） and interleukin-18 （IL-18） in the medium were measured. Results Saikosaponin D reduced the survival rate of HTh83 cells and KMH2 cells in a concentration-dependent manner. The number of cell clones in low-， medium-， and high-concentration groups was lower than that in the control group （P<0.05）， while the expression levels of NLRP3， cleaved caspase-1， and GSDMD-N， and the levels of IL-1β and IL-18 in the medium were higher than those in the control group （P<0.05）. The survival rate and clone number in high concentration +si-NC group were higher than those in high concentration+si-NC group， while the expression levels of NLRP3， cleaved caspase-1， and GSDMD-N， and the levels of IL-1β and IL-18 in the medium were lower than those in high concentration+si-NC group （P<0.05）. Conclusion Saikosaponin D significantly inhibits the proliferation of anaplastic thyroid cancer cells， and its mechanism is probably related to the activation of NLRP3 and the mediation of pyroptosis.

〔Ｋｅｙｗｏｒｄｓ〕 anaplastic thyroid cancer; saikosaponin D; proliferation; Nod-like receptor protein 3; pyroptosis

未分化甲狀腺癌是一種具有極高惡性程度的甲狀腺惡性腫瘤，患者的臨床預后差、生存期往往不超過半年[1-2]。雖然未分化甲狀腺癌的分子機制尚不完全明確，但相關研究資料認為，細胞焦亡是調控未分化甲狀腺癌細胞惡性生物學行為的重要靶點[3]。細胞焦亡過程中伴隨著大量炎癥物質的釋放，因而該過程又稱炎癥性死亡。NOD樣受體蛋白3（NOD-like receptor protein 3，NLRP3）是調控焦亡的重要受體蛋白，NLRP3通過介導Gasdermin D（GSDMD）氨基末端的切割、形成GSDMD氨基末端片段（GSDMD N terminal，GSDMD-N）的方式執行細胞焦亡[4-6]。

中醫學理論認為，甲狀腺癌屬“石癭”范疇。柴胡疏肝散合二陳湯具有活血止痛、行氣解郁的功效，臨床研究證實該方劑對甲狀腺癌術后復發具有抑制作用[7]。柴胡疏肝散合二陳湯中柴胡的活性成分柴胡皂苷D具有抗癌活性，可通過激活NLRP3/GSDMD-N介導的細胞焦亡抑制非小細胞肺癌細胞增殖[8]，但柴胡皂苷D對未分化甲狀腺癌細胞增殖及焦亡的調控作用尚不明確。基于此，本研究通過細胞實驗對柴胡皂苷D通過NRLP3介導細胞焦亡，抑制未分化甲狀腺癌細胞增殖的機制展開探索。

1 材料與方法

1.1 材料

未分化甲狀腺癌細胞株HTh83和KMH2、CCK-8細胞增殖檢測試劑盒（批號：CL-0806、CL-0623、P-CA-001，武漢普諾賽生命科技有限公司）；柴胡皂苷D（批號：B20150，上海源葉生物科技有限公司）；二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）、結晶紫（批號：D2650、Y0000418，美國Sigma公司）；NLRP3一抗、裂解型Caspase-1一抗、GSDMD-N一抗（批號：ab263899、ab286125、ab210070，美國Abcam公司）；辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔抗體（批號：PK20001，武漢三鷹生物技術有限公司）。

細胞培養箱（Galaxy 170S型，Eppendorf公司）；全波長酶標儀（ReadMax 1500型，上海閃譜生物科技有限公司）；倒置顯微鏡（ECLIPSE Ts2型，日本Nikon公司）；凝膠成像系統（1600R型，上海天能生命科學有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 藥物配制 用DMSO溶解柴胡皂苷D，制備成濃度為1 mmol/L的藥物母液，放置在－20 ℃避光保存。進行細胞分組處理時，用培養基稀釋至終濃度。

1.2.2 細胞培養 HTh83和KMH2細胞均在含有10%胎牛血清的高糖DMEM培養液中培養，培養條件為37 ℃及5%CO2。

1.2.3 CCK-8實驗檢測細胞增殖 消化收集對數生長期的HTh83和KMH2細胞，按照2 000個/孔接種在96孔培養板內，貼壁培養24 h后更換為含有不同濃度柴胡皂苷D（1、4、7、10、13、16、19、22、25、28、31、34、37 μmol/L[9]）的培養基，設置對照組，并于每個濃度重復5次。培養48 h后加入CCK-8檢測液，繼續培養1 h后在酶標儀中檢測450 nm波長處的吸光值（A）。細胞存活率=（A處理組－A空白組）/（A對照組-A空白組）×100%。根據細胞存活率計算柴胡皂苷D的半數抑制濃度（50% inhibition concentration，IC50）。

1.2.4 平板克隆實驗檢測細胞克隆數目 消化收集對數生長期的HTh83和KMH2細胞，按照1 000個/孔接種在6孔培養板內，貼壁培養24 h后按照對照組（0 μmol/L柴胡皂苷D）、低濃度組（2.2 μmol/L柴胡皂苷D）、中濃度組（11 μmol/L 柴胡皂苷D）、高濃度組（22 μmol/L 柴胡皂苷D）、si-NC組（轉染NC siRNA）、高濃度+si-NC組（22 μmol/L柴胡皂苷D聯合轉染NC siRNA）、高濃度+si-NLRP3組（22 μmol/L柴胡皂苷D聯合轉染NLRP3 siRNA）處理。每2天更換1次培養液，第14天時棄培養基，磷酸鹽緩沖液清洗3次后用4%多聚甲醛固定20 min，再次清洗后用0.1%結晶紫室溫染色20 min，洗凈結晶紫并拍照，計算克隆數目。

1.2.5 Western blot檢測蛋白表達水平 消化收集對數生長期的HTh83和KMH2細胞，按照5×105個/孔接種在12孔培養板內，貼壁培養24 h后按照對照組（0 μmol/L柴胡皂苷D）、低濃度組（2.2 μmol/L柴胡皂苷D）、中濃度組（11 μmol/L柴胡皂苷D）、高濃度組（22 μmol/L柴胡皂苷D）、si-NC組（轉染NC siRNA）、高濃度+si-NC組（22 μmol/L柴胡皂苷D聯合轉染NC siRNA）、高濃度+si-NLRP3組（22 μmol/L柴胡皂苷D聯合轉染NLRP3 siRNA）作用48 h。棄培養基，采用蛋白裂解液提取細胞蛋白，按照Western blot流程進行實驗，以β-actin為內參，檢測NLRP3、裂解型Caspase-1、GSDMD-N的蛋白表達水平。

1.2.6 ELISA檢測培養基中IL-1β、IL-18水平 按照“1.2.5”的方法接種細胞和分組處理，收集處理后的細胞培養基，采用ELISA試劑盒檢測培養基中白細胞介素-1β（interleukin-1β， IL-1β）、白細胞介素-18（interleukin-18， IL-18）的水平。

1.3 統計學處理

采用GraphPad Prism 6.0軟件進行數據的統計學處理及制圖。實驗數據均為計量資料，以“ｘ±s”表示，進行單因素方差分析。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 柴胡皂苷D對HTh83和KMH2細胞增殖的影響

與對照組比較，不同濃度柴胡皂苷D（1、4、7、10、13、16、19、22、25、28、31、34、37 μmol/L）作用HTh83和KMH2細胞48 h后細胞存活率均顯著降低（P<0.05），HTh83細胞和KMH2細胞柴胡皂苷D作用48 h的IC50分別為22.20、22.90 μmol/L。詳見圖1。根據IC50的0.1倍、0.5倍和1.0倍選擇低濃度（2.2 μmol/L）、中濃度（11 μmol/L）、高濃度（22 μmol/L）柴胡皂苷D作用48 h進行后續實驗。

2.2 柴胡皂苷D對HTh83和KMH2細胞克隆形成的影響

柴胡皂苷D作用48 h時，低濃度組、中濃度組、高濃度組HTh83和KMH2細胞的克隆數目均低于對照組（P<0.05），且HTh83和KMH2細胞的克隆數目隨柴胡皂苷D濃度升高而降低（P<0.05）。詳見表1。

2.3 柴胡皂苷D對HTh83和KMH2細胞中NLRP3介導焦亡的影響

柴胡皂苷D作用48 h時，低濃度組、中濃度組、高濃度組HTh83和KMH2細胞的NLRP3、裂解型Caspase-1、GSDMD-N的表達水平以及培養基中IL-1β、IL-18的水平均高于對照組（P<0.05），且HTh83和KMH2細胞的NLRP3、裂解型Caspase-1、GSDMD-N的表達水平以及培養基中IL-1β、IL-18的水平隨柴胡皂苷D濃度升高而增加（P<0.05）。詳見圖2、表2。

2.4 NLRP3 siRNA轉染對柴胡皂苷D促進HTh83和KMH2細胞中NLRP3介導焦亡的影響

高濃度+si-NC組HTh83和KMH2細胞處理48 h時的NLRP3、裂解型Caspase-1、GSDMD-N表達水平以及培養基中IL-1β、IL-18的水平均高于si-NC組（P<0.05）；高濃度+si-NLRP3組HTh83和KMH2細胞處理48 h時的NLRP3、裂解型Caspase-1、GSDMD-N表達水平以及培養基中IL-1β、IL-18的水平均低于高濃度+si-NC組（P<0.05）。詳見圖3、表3。

2.5 抑制NLRP3表達對柴胡皂苷D抑制HTh83和KMH2細胞增殖和克隆形成的影響

高濃度+si-NC組HTh83和KMH2細胞處理48 h時的細胞存活率及克隆數目均低于si-NC組（P<0.05）；高濃度+si-NLRP3組HTh83和KMH2細胞處理48 h時的細胞存活率及克隆數目均高于高濃度+si-NC組（P<0.05）。詳見表4。

3 討論

未分化甲狀腺癌是一種起源于甲狀腺濾泡上皮細胞的高度惡性腫瘤，常規手術切除、放化療的療效均不理想，患者確診后的平均生存期為6～8個月[1-2]。未分化甲狀腺癌細胞表現出極強的增殖活性，與之相關的可能機制包括細胞凋亡、焦亡、鐵死亡等生物學環節異常[10-11]，但具體分子機制尚不完全清楚。因此，研究疾病的分子機制、發現新的治療靶點和治療手段對改善未分化甲狀腺癌的治療現狀、延長患者的生存期具有重要意義。中藥材及其活性成分是近些年抗癌研究的熱點，本研究對中藥柴胡的活性成分柴胡皂苷D抑制未分化甲狀腺癌細胞增殖的作用及機制展開分析。

中醫學認為甲狀腺癌歸屬于“石癭”范疇，其發病與肝郁氣滯、痰濕凝聚有關，以柴胡為君藥的柴胡疏肝散合二陳湯能夠針對甲狀腺癌的中醫病機發揮活血止痛、行氣解郁的功效[7]。研究資料顯示，甲狀腺癌術后應用柴胡疏肝散合二陳湯治療能顯著降低腫瘤復發率，提示該方劑具有抗甲狀腺癌的功效[7]。柴胡疏肝散合二陳湯中柴胡的活性成分為柴胡皂苷D，多項基礎研究證實，柴胡皂苷D對肺癌細胞、胰腺癌細胞、膠質瘤細胞、子宮內膜癌細胞、肺癌細胞的增殖具有抑制作用[8， 12-16]。本研究在兩種未分化甲狀腺癌細胞株HTh83和KMH2中探究柴胡皂苷D抑制增殖的作用。結果顯示，柴胡皂苷D以濃度依賴性的方式抑制HTh83細胞和KMH2細胞增殖。平板克隆實驗結果顯示，不同濃度柴胡皂苷D能顯著抑制HTh83細胞和KMH2細胞克隆形成。以上實驗結果表明，柴胡皂苷D對未分化甲狀腺癌細胞的增殖具有抑制效應。

焦亡作為一種新的程序性細胞死亡形式，其與未分化甲狀腺癌發生發展的密切關系受到越來越多的關注。焦亡過程中伴隨大量炎癥物質釋放，調控炎癥反應的受體蛋白NLRP3是激活細胞焦亡的經典途徑，NLRP3能夠使細胞內裂解型Caspase-1生成增加，后者切割GSDMD形成的GSDMD-N是執行焦亡的蛋白[17-18]。GSDMD-N能定位于細胞膜并聚集成膜孔，使細胞中的炎癥物質從膜孔釋放并引起細胞發生炎癥性死亡，即細胞焦亡[19-22]。非小細胞肺癌相關的研究證實，柴胡皂苷D通過激活NLRP3/GSDMD-N介導的焦亡抑制癌細胞增殖[8]。本研究對未分化甲狀腺癌細胞中柴胡皂苷D調控細胞焦亡的作用進行分析。結果顯示，不同濃度柴胡皂苷D顯著增加HTh83細胞和KMH2細胞中NLRP3、裂解型Caspase-1及GSDMD-N的表達。這一結果與柴胡皂苷D在非小細胞肺癌中的實驗結果一致[8]，表明柴胡皂苷D對未分化甲狀腺癌細胞的焦亡具有促進作用，進而提示柴胡皂苷D可能通過促進焦亡的方式抑制未分化甲狀腺癌細胞增殖。

多項基礎研究證實，抑制焦亡對未分化甲狀腺癌細胞的增殖具有顯著抑制作用[23-25]。本研究進一步設計轉染siRNA的逆轉實驗，驗證細胞焦亡在柴胡皂苷D抑制未分化甲狀腺癌細胞增殖中的作用。通過轉染NLRP3 siRNA的方式在柴胡皂苷D作用于細胞的過程中抑制NLRP3表達，進而阻礙NLRP3介導的細胞焦亡。細胞增殖及克隆形成的檢測結果顯示，柴胡皂苷D作用于細胞的同時，通過轉染siRNA的方式抑制NLRP3表達后，柴胡皂苷D在HTh83細胞和KMH2細胞中抑制增殖和克隆形成、促進焦亡的作用均明顯減弱，提示柴胡皂苷D對未分化甲狀腺癌細胞增殖的抑制作用與促進NLRP3介導細胞焦亡的激活有關。

綜上所述，柴胡皂苷D對未分化甲狀腺癌細胞的增殖具有抑制作用，這一抑制作用與促進NLRP3介導細胞焦亡的激活有關。本研究結果為探索柴胡皂苷D在未分化甲狀腺癌中的治療價值及深入認識細胞焦亡在未分化甲狀腺癌發生發展中的生物學價值提供了細胞實驗證據。

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