基于網絡藥理學研究瑤藥黑老虎三萜類成分對類風濕關節炎的作用機制及試驗驗證

〔摘要〕 目的 基于網絡藥理學和實驗研究探討瑤藥黑老虎Kadsura coccinea （Lem.） A.C. Smith治療類風濕關節炎（rheumatoid arthritis，RA）的作用機制。方法 采用硅膠、C18反相柱色譜及半制備高效液相分離技術對黑老虎的有效成分進行分離純化；采用波譜技術對分離得到的化合物進行結構鑒定；通過 Swiss Target Prediction數據庫篩選黑老虎成分靶點，在GeneCards數據庫和MalaCards數據庫挖掘RA相關靶點，進而篩選黑老虎作用于RA的靶點；制作蛋白質-蛋白質相互作用（protein-protein interaction， PPI）網絡取其交集，并通過GO分析和KEGG富集分析；采用MTT試劑盒檢測化合物對腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor， TNF）-α和白細胞介素（interleukin， IL）-6的釋放情況，以及蛋白免疫印跡實驗對預測結果進行驗證。結果 從黑老虎中提取分離出6個三萜類化合物，分別鑒定為heilaohuacid A （1），heilaohuacid G （2），seco-coccinic acid F （3），seco-coccinic acid G （4），schisandronic acid （5）和schisanlactone B （6）。MTT實驗結果是化合物2，3，4，6能抑制RA-FLS細胞增殖，其IC50值為7.52～8.85 μmol。6個化合物在濃度為10 μmol和20 μmol時均能抑制炎癥因子TNF-α和IL-6的釋放（P<0.05，P<0.01）。網絡藥理學預測得到109個共同作用靶標，通過與691個RA疾病相關靶標進行交集映射，獲得其干預RA靶標38個，主要為絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶、TNF、絲裂原活化蛋白激酶1、前列腺素內過氧化物合酶2、絲裂原活化蛋白激酶14等。GO分析和KEGG富集分析得關鍵通路為白細胞介素（interleukin， IL）-17信號通路和TNF信號通路等。化合物3在濃度為20 μmol能上調核因子κB抑制因子α（recombinant inhibitory subunit of NF kappa B-α， I？資B-α）的表達水平（P<0.05）。結論 本研究從網絡藥理學角度預測瑤藥黑老虎三萜成分治療RA的作用機制，初步證實其可上調I？資B-α蛋白的表達，為瑤藥黑老虎治療RA提供了科學依據。

〔關鍵詞〕 瑤藥；黑老虎；三萜；類風濕關節炎；網絡藥理學

〔中圖分類號〕R285.5 〔文獻標志碼〕A 〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674－070X.２０24.10.017

Mechanism of action and experimental verification of triterpenoids from the Yao ethnomedicine Kadsura coccinea on the rheumatoid arthritis

based on network pharmacology

LI Huiying， LIU Shiqi， LI Donghui， ZHANG Shuo， YAO Yuxuan， SU Wei， LUO Jie，

WANG Wei*， YANG Yupei*

TCM and Ethnomedicine Innovation & Development International Laboratory， School of Pharmacy， Hunan

University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410208， China

〔Ａｂｓｔｒａｃｔ〕 Objective To explore the mechanism of action of the Yao ethnomedicine Kadsura coccinea （Lem.） A.C. Smith in treating rheumatoid arthritis （RA） based on network pharmacology and experimental research. Methods The active compounds of Kadsura coccinea were separated and purified by silica gel， C18 reversed-phase column chromatography， and semi-preparative high-performance liquid chromatography. The structures of the compounds obtained from the separation were identified using spectroscopic techniques. The targets of Kadsura coccinea components were screened through the Swiss Target Prediction database， and RA-related targets were excavated from the GeneCards and MalaCards databases to further identify the targets of Kadsura coccinea acting on RA. A protein-protein interaction （PPI） network was constructed to find the intersections， followed by GO analysis and KEGG enrichment analysis. The MTT （thiazolyl blue） assay kit was used to detect the release of tumor necrosis factor （TNF）-α and interleukin （IL）-6 by the compounds， and the prediction results were verified through Western blot. Results Six triterpenoids were extracted and separated from Kadsura coccine and identified as heilaohuacid A （1）， heilaohuacid G （2）， seco-coccinic acid F （3）， seco-coccinic acid G （4）， schisandronic acid （5）， and schisanlactone B （6）. The MTT assay results demonstrated that compounds 2， 3， 4， and 6 could inhibit the proliferation of RA-FLS cells， with IC50 values of 7.52～8.85 μmol. Six compounds suppressed the release of inflammatory cytokines TNF-α and IL-6 at concentrations of 10 and 20 μmol （P<0.05， P<0.01）. A total of 109 co-acting targets were predicted by network pharmacology， which were mapped against 691 RA-related targets to obtain 38 intervention targets for RA. These targets primarily included serine/threonine protein kinases， TNF， mitogen-activated protein kinase 1 （MAPK1）， prostaglandin-endoperoxide synthase 2 （COX-2）， and mitogen-activated protein kinase 14 （MAPK14）. The key pathways identified through GO analysis and KEGG enrichment analysis were interleukin（IL）-17 signaling pathway and the TNF signaling pathway. Compound 3 upregulated the expression level of recombinant inhibitory subunit of NF kappa B-α （I？資B-α） at a concentration of 20 μmol （P<0.05）. Conclusion This study predicts the mechanism of action of the triterpenoid components of the Yao ethnomedicine Kadsura coccinea in treating RA from a network pharmacology perspective and initially confirms that it can upregulate the expression of I？資B-α protein， offering a scientific basis for the use of Kadsura coccinea in RA treatment.

〔Ｋｅｙｗｏｒｄｓ〕 Yao ethnomedicine; Kadsura coccinea; triterpenoid; rheumatoid arthritis; network pharmacology

類風濕關節炎（rheumatoid arthritis，RA）是一種常見的慢性、高致殘性自身免疫紊亂疾病，長期以來被認為是“不死的癌癥”，其主要病理特點為關節滑膜炎癥、微血管的新生、血管翳的形成及軟骨和骨組織的破壞等[1]。RA常見的臨床表現為關節僵直、腫脹、疼痛，隨著疾病進展最終導致關節畸形及活動能力障礙，其病理特征表現為成纖維樣滑膜細胞（fibroblast-like synoviocytes，FLS）的異常增生，以及持續炎癥反應，最終導致骨、關節破壞甚至功能障礙[2-4]。研究表明，RA-FLS細胞具有過度增殖、抑制凋亡、過度炎癥介質等腫瘤細胞特征[5]。活化的RA-FLS細胞可誘導炎癥細胞因子、趨化因子和基質降解分子的過度生產，包括腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α， TNF-α）、白細胞介素（interleukin， IL）-6、基質金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP），促進免疫細胞浸潤和軟骨降解[6-7]。此外，炎癥細胞因子的過度表達也是RA發病的重要過程，如TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8在RA中大量存在[8]。此外，在這些細胞因子中，IL-6和TNF-α是維持炎癥反應的重要介質[9]，進而誘導RA-FLS在RA發展過程中的侵襲性增殖。目前，常用的治療藥物有抗風濕藥物、生物制劑、糖皮質激素及非甾體抗炎藥等，長期應用會引起胃腸道不適、肝損傷等嚴重不良反應[10]。因此，從中藥民族藥物中尋找高效低毒的RA治療藥物，有很大的社會價值和現實意義。

RA屬于瑤醫“風敵病”范疇，是由于風、寒、濕邪侵襲人體筋脈，導致脈絡不通，盈虧失調；或由風邪侵襲機體，濕熱毒邪郁積體內而化熱所致[11]。臨床表現為肌肉筋骨關節等處疼痛、腫脹、關節變形、活動屈伸不利等癥[12]。瑤醫在辨別人體盈虧狀態的基礎上選擇藥物，遵循“風虧打盈”的原則，即“盈則消之，虧則補之”，通過藥物調整人體“盈虧平衡”，使天、地、人三元和諧，達到治愈疾病的目的[13]。瑤醫依據藥物的“風打”屬性選擇治療“風敵病”的藥物，如104味老班藥中的“十八鉆”屬于“風打相兼藥”，“鉆”類藥物性能強勁、通達經絡，多為行氣止痛、散瘀消腫之藥，用于治療風濕痹痛、筋骨痛、腰腿痛、跌打損傷等疾病臨床療效顯著[14]。

黑老虎，瑤藥俗稱“大鉆”，為“風打相兼藥”中的“十八鉆”之一，來源于五味子科南五味子屬植物冷飯團Kadsura coccinea（Lem.） A.C. Smith的根，主要分布于我國的廣西、湖南、四川、貴州、云南、海南等省。其味辛、微苦，性溫，歸肝、脾經，具有行氣活血、祛風活絡、散瘀止痛之效[15-16]。黑老虎在瑤族醫藥中具有顯著的抗RA效果[17]，如舒筋風濕酒（黑老虎酒）其組方中主要含有黑老虎。目前，關于瑤藥黑老虎治療RA的藥效物質基礎及作用機制研究較少。

本研究擬基于化學成分研究和網絡藥理學從多靶點、多角度、多途徑揭示瑤藥黑老虎對治療RA的潛在分子機制，并結合細胞實驗驗證瑤藥黑老虎活性成分抗RA的作用，以期為瑤藥黑老虎臨床治療RA的應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與試劑

核磁共振波譜儀（德國布魯克集團公司，型號：Bruker AV-600）；四級桿飛行時間質譜儀（美國沃特世公司，型號：Xevo G2-S QTof）；Agilent 1260液相色譜、酶標儀（美國安捷倫公司，型號：1260 Infinity II、800TS-SN）；分析天平（梅特勒-托利多國際股份有限公司，型號：MS204TS）；高速低溫離心機（德國艾本德股份公司，型號：5418R）；超純水系統（英國埃爾格純凈水技術有限公司，型號：FLB00003057）；生物安全柜美國、細胞培養箱（賽默飛世爾科學技術有限公司，型號：1300、8000）；制冰機（日本三洋電機有限公司，型號：AF-200）；生物光學顯微鏡[尼康儀器（上海）有限公司，型號：ECLIPSE Ni-U]；凝膠成像系統（上海天能科技有限公司，型號：Tanon 5200）；柱色譜填料（青島海洋化工有限公司，型號：柱層析硅膠H）；葡聚糖凝膠（香港GE醫療公司，型號：Sephadex LH-20）。

氘代試劑（劍橋同位素實驗室有限公司，批號：PR-29017/082117AC1）；二氯甲烷、乙酸乙酯、乙醇、甲醇（分析純，國藥集團化學試劑有限公司，批號：P2219111、P2382556、20221130、20221223）；甲醇、乙腈（色譜純，上海西格瑪奧德里奇貿易有限公司，批號：57-56-1、75-05-8）；核因子κB抑制因子α（recombinant inhibitory subunit of NF kappa B-α， I？資B-α）抗體、β-actin抗體（武漢三鷹生物技術有限公司，批號：10268-1-AP、20536-1-AP）；山羊抗兔二抗、小鼠TNF-α檢測試劑盒（武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司，批號：E-AB-1003、FU104FFZ5209）；Super ECL化學發光檢測試劑盒（美國Advansta公司，批號：240227-60）；Easy PAGE彩色快速凝膠配制試劑盒[賽文（創新）北京生物，批號：24AD0200]；BCA蛋白定量試劑盒（北京索萊寶科技有限公司，批號：240006016）；小鼠IL-6檢測試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司，批號：132171181220）。

1.2 藥材

黑老虎根于2015年7月被收集于湖南省懷化市（N26°16'，E109°79'），經湖南中醫藥大學藥學院王煒教授鑒定為五味子科Schisandraceae南五味子屬Kadsura植物冷飯團Kadsura coccinea （Lem.） A.C. Smith的干燥根。藥材目前保存于湖南中醫藥大學中醫藥民族醫藥國際聯合實驗室，藥材標本編號為2015071501。

1.3 提取和分離

瑤藥黑老虎干燥根200 kg，先用乙醇浸泡1 h，再依次用5倍量、4倍量的80%乙醇回流提取2 h，過濾收集提取液，在60 ℃條件下減壓濃縮蒸干，得到乙醇浸膏5.3 kg；將3 kg乙醇浸膏用5 L蒸餾水分散后，依次用5 L石油醚、5 L氯仿、5 L乙酸乙酯和5 L正丁醇分別進行3次萃取，得到石油醚萃取部位浸膏181.3 g、二氯甲烷萃取部位浸膏1 225.5 g、乙酸乙酯萃取部位浸膏562.9 g、正丁醇萃取部位浸膏655.8 g。將二氯甲烷萃取部位浸膏（945 g）經硅膠柱色譜環己烷-乙酸乙酯（體積比為80∶1、20∶1、10∶1、5∶1、1∶1、0∶1）梯度洗脫后，經TLC分析合并相同流分，得12個主要流分（Fr.1～Fr.12）。Fr.3經反復硅膠柱層析、Sephadex LH-20凝膠柱色譜以及制備液相分離純化得到化合物2（5.2 mg）、5（15.0 mg）、3（2.0 g）；Fr.4經過重結晶得到化合物4（12.0 g）；Fr.9經反復硅膠柱層析和葡聚糖凝膠柱色譜以及制備液相分離、純化得到化合物1（5 mg）和6（8 mg）。

2 網絡藥理學分析

2.1 黑老虎中活性三萜類化合物靶點預測

根據體外抗RA-FLS細胞增殖和抗炎活性篩選結果，選擇化合物1～6進行靶點預測分析。各化合物結構優化后以sdf格式上傳至Swiss Target Prediction（https：//www.swisstargetprediction.ch/）在線平臺進行篩選，篩選條件限定為“Homo sapiens”，消除重復內容，最終得到全部活性化合物的靶點基因。

2.2 RA疾病相關靶點基因收集

在GeneCards數據庫（http：//www.genecards.org/）和MalaCards數據庫（https：//www.malacards.org/）中搜索RA的潛在治療靶點。搜索詞為“rheumatoid arthritis”，使用條件為“gene”和“Homo sapiens”進一步過濾。將兩個數據庫的全部疾病基因進行合并，確定為最終的RA疾病相關靶點基因。

2.3 RA疾病與活性化合物靶點韋恩圖

使用微生信網頁（http：//www.bioinformatics.com.cn/）制作黑老虎三萜類活性化合物靶點基因與RA相關靶點基因的韋恩圖，得到重疊的靶點，即黑老虎三萜類活性化合物治療RA的潛在關鍵作用靶點基因。

2.4 構建黑老虎治療RA的蛋白質-蛋白質相互作用網絡

將黑老虎三萜類成分治療RA的關鍵作用靶點上傳到STRING數據庫（https：//string-db.org/cgi/input.pl），獲得蛋白質-蛋白質相互作用（protein-protein interaction networks， PPI）網絡，再使用Cytoscape V3.6.0軟件對PPI網絡進行分析及可視化處理。

2.5 GO及KEGG富集分析及可視化

將從PPI網絡下載得到的GO功能和KEGG信號通路富集數據使用微生信網頁（https：//string-db.org/cgi/input.pl）進行分析及可視化，限定物種為“Homo sapiens”，分別選擇生物學過程（biological process， BP）、細胞成分（cellular component， CC）、分子功能（molecular function， MF）及KEGG進行富集分析。設置條件為P<0.05。

2.6 構建藥物-活性成分-靶標-通路網絡關系圖

將藥物黑老虎、三萜類活性化合物、治療RA的潛在關鍵作用靶點基因以及KEGG富集的得到的前20條通路信息導入Cytoscape 3.6.0軟件中，從而構建“藥物-活性成分-靶標-通路”網絡關系圖。并根據Degree值進行篩選，得出黑老虎三萜類成分治療RA中最關鍵的活性成分、關鍵作用靶點以及關鍵信號通路。

3 細胞實驗驗證

3.1 巨噬細胞RAW 264.7的培養

小鼠巨噬細胞樣細胞系RAW 264.7購買于湖南富衡生物科技有限公司。RAW 264.7細胞使用含有10% FBS和1%雙抗（100 U/mL的青霉素、100 μg/mL的鏈霉素）的 DMEM高糖培養基，置于37 ℃、5%CO2、濕度條件合適的培養箱中培養，培養基1～2 d換液，2～3 d傳代一次，準備進一步實驗。LPS誘導的RAW 264.7細胞檢測上清液中的炎性因子。將RAW 264.7細胞用細胞刮刀從培養瓶中消化下來，然后以4 ℃、800 r/min離心5 min（離心半徑10 cm），去除上清液，用10% FBS的DMEM高糖培養基稀釋細胞液，以每孔密度為8 000個/孔細胞數量的細胞懸液100 μL均勻種植在96孔板孔，置于37 ℃、5% CO2、濕度條件合適的培養箱中培養。

3.2 檢測炎性因子TNF-α和IL-6的表達水平

實驗設置分組為正常組、模型組、化合物1（10、20 μmol）、化合物2（10、20 μmol）、化合物3（10、20 μmol）、化合物4（10、20 μmol）、化合物5（10、20 μmol）、化合物6（10、20 μmol）。待24孔板中的巨噬細胞RAW 264.7長滿到85%時，各組加入含藥或空白培養基培養24 h后，除正常組外，其余組繼續用100 ng/mL的LPS孵育細胞4 h，收集上清液，以4 ℃、3 000 r/min離心10 min（離心半徑10 cm），吸取上清液，根據TNF-α和IL-6的ELISA試劑盒說明書進行檢測，在酶標儀的570 nm處檢測OD值，計算炎性因子的含量。

3.3 檢測抑制RA-FLS細胞的增殖活性

化合物1～6對RA-FLS細胞的增殖抑制作用采用標準MTT測定方法。平行實驗3次，以吲哚美辛為陽性對照。實驗設置分組為正常組、吲哚美辛組（2.5、5、10、15、20 μmol/L）、化合物1（2.5、5、10、15、20 μmol/L）、化合物2（2.5、5、10、15、20 μmol/L）、化合物3（2.5、5、10、15、20 μmol/L）、化合物4（2.5、5、10、15、20 μmol/L）、化合物5（2.5、5、10、15、20 μmol/L）、化合物6（2.5、5、10、15、20 μmol/L）用藥物孵育48 h后的RA-FLS細胞，棄去培養液，用1×PBS清洗2次，隨后用含10% MTT的無血清DMEM/F-12培養基繼續培養4 h后，棄去培養液，每孔加入100 μL的DMSO，放置搖床上充分溶解結晶紫。在酶標儀上，以492 nm的波長檢測OD值。根據以下公式計算不同化合物的細胞存活率，細胞存活率（%）=（藥物組OD值-空白組OD值）/（正常組OD值-空白組OD值）×100%。

3.4 分析蛋白免疫印跡實驗

根據抑制RA-FLS細胞增殖實驗結果，選擇化合物3考察對TNF信號通路上的I？資B-α蛋白的表達情況。實驗設置分組為正常組、化合物3（5、10、20 μmol/L）。從RA-FLS細胞中提取的總蛋白經10%SDS-PAGE電泳分離后轉移到PVDF膜上。將膜在5%脫脂乳中室溫封閉1.5 h，然后與一抗I？資B-α（1∶2 000）和β-actin（1∶5 000）在4 ℃下孵育過夜。然后用二抗在37 ℃下孵育2 h，然后分別使用ECL和Image J軟件對蛋白質條帶進行可視化和定量分析。

3.5 統計學方法

用GraphPad Prism 9.0和SPSS 26.0 軟件進行統計學分析。數據以“ｘ±s”表示，若滿足正態性和方差齊性，則采用單因素方差分析；多重比較采用LSD法；若不符合正態分布或方差齊性，則采用非參數檢驗；以P<0.05表示差異有統計學意義。

4 結果

4.1 結構鑒定

化合物1：白色非晶形粉末，HR-ESI-MS測定其準分子離子峰m/z： 491.314 3 [M+Na]+ （計算值為491.313 7， C30H44O4Na+）；1H-NMR （600 MHz， CDCl3） δH： 6.92 （1H， m， H-24）， 6.21 （1H， d， H-7）， 5.39 （1H， dd， H-6）， 4.95 （1H， brs， H-28）， 4.75 （1H， brs， H-28）， 2.61 （1H， d， H-5）， 2.41 （1H， m， H-9）， 2.37 （1H， m， H-15）， 2.29 （1H， m， H-2）， 2.27 （1H， m， H-15）， 2.26 （1H， m， H-23）， 1.85 （1H， s， H-27）， 1.78 （1H， s， H-29）， 1.75 （1H， m， H-22）， 1.69 （1H， m， H-12）， 1.69 （1H， m， H-11）， 1.67 （1H， m， H-20）， 1.66 （1H， m， H-16）， 1.63 （1H， m， H-12）， 1.60 （1H， m， H-1）， 1.56 （1H， m， H-11）， 1.49 （1H， m， H-16）， 1.24 （1H， m， H-22）， 1.00 （1H， s， H-18）， 0.86 （1H， s， H-19）， 0.84 （1H， d， H-21）， 0.65 （1H， s， H-30）； 13C-NMR （150 MHz， CDCl3） δC： 181.5 （C-3）， 173.9 （C-26）， 147.2 （C-14）， 145.9 （C-24）， 145.4 （C-4）， 127.4 （C-25）， 126.5 （C-6）， 125.4 （C-7）， 124.9 （C-8）， 115.5 （C-28）， 50.6 （C-5）， 49.4 （C-17）， 47.5 （C-13）， 39.5 （C-9）， 37.1 （C-10）， 36.5 （C-16）， 36.4 （C-20）， 32.3 （C-12）， 30.3 （C-22）， 29.9 （C-2）， 28.4 （C-1）， 26.1 （C-23）， 24.8 （C-29）， 23.9 （C-15）， 21.8 （C-19）， 21.6 （C-18）， 19.7 （C-11）， 15.7 （C-30）， 14.7 （C-21）， 12.1 （C-27）。以上數據與文獻[18]一致，故鑒定為heilaohuacid A。

化合物2：白色無定形粉末，HR-ESI-MS測定其準分子離子峰m/z： 437.341 7 [M-H]- （計算值為437.342 0， C30H45O2-）；1H-NMR （600 MHz， CDCl3） δH： 6.16 （1H， dd， H-23）， 5.75 （1H， dd， H-24）， 5.42 （1H， dd， H-22）， 5.31 （1H， d， H-7）， 4.88 （1H， brs， H-28）， 4.82 （1H， brs， H-28）， 2.58（1H， m， H-9）， 2.31 （1H， m， H-1）， 2.26 （1H， m， H-6）， 2.11 （1H， m， H-20）， 2.08 （1H， d， H-5）， 1.98 （1H， m， H-6）， 1.85 （1H， m， H-12）， 1.80 （1H， m， H-16）， 1.80 （1H， s， H-29）， 1.75 （1H， s， H-26）， 1.74 （1H， s， H-27）， 1.72 （1H， m， H-2）， 1.66 （1H， m， H-12）， 1.64 （1H， m， H-11）， 1.60 （1H， m， H-2）， 1.55 （1H， m， H-11）， 1.54 （1H， m， H-17）， 1.44 （1H， m， H-15）， 1.20 （1H， m， H-16）， 1.03 （1H， s， H-30）， 1.00 （1H， d， H-21）， 0.86 （1H， s， H-19）， 0.78 （1H， s， H-18）； 13C-NMR （150 MHz， CDCl3） δC： 179.2 （C-3）， 149.9 （C-4）， 146.7 （C-8）， 138.7 （C-22）， 132.9 （C-25）， 125.4 （C-24）， 124.4 （C-23）， 118.0 （C-7）， 112.1 （C-28）， 53.0 （C-17）， 51.8 （C-14）， 45.5 （C-5）， 43.8 （C-13）， 40.6 （C-20）， 38.8 （C-9）， 36.5 （C-10）， 34.2 （C-15）， 33.9 （C-12）， 29.8 （C-6）， 29.0 （C-1）， 28.9 （C-2）， 28.7 （C-16）， 27.6 （C-30）， 26.1 （C-29）， 26.1 （C-26）， 24.2 （C-19）， 22.0 （C-18）， 20.4 （C-21）， 18.7 （C-11）， 18.4 （C-27）。以上數據與文獻[19]一致，故鑒定為heilaohuacid G。

化合物3：不定型無色粉末，HR-ESI-MS測定其準分子離子峰m/z： 463.353 8 [M+Na]+ （計算值為463.354 7， C30H48O2Na+）； 1H-NMR （600 MHz， CDCl3） δH： 5.31 （1H， d， H-7）， 5.23 （1H， m， H-24）， 4.99 （1H， brs， H-28）， 2.66 （1H， m， H-9）， 2.55 （1H， m， H-1）， 2.55 （1H， m， H-6）， 2.38 （1H， m， H-6）， 2.24 （1H， d， H-5）， 2.12 （1H， m， H-23）， 2.01 （1H， m， H-2）， 1.96 （1H， m， H-23）， 1.95 （1H， m， H-16）， 1.91 （1H， m， H-2）， 1.85 （1H， s， H-29）， 1.81 （1H， m， H-12）， 1.70 （1H， m， H-11）， 1.70 （1H， s， H-26）， 1.63 （1H， s， H-27）， 1.54 （1H， m， H-11）， 1.53 （1H， m， H-22）， 1.52 （1H， m， H-15）， 1.48 （1H， m， H-17）， 1.47 （1H， m， H-12）， 1.41 （1H， m， H-20）， 1.29 （1H， m， H-16）， 1.10 （1H， m， H-22）， 1.06 （1H， s， H-30）， 0.94 （1H， d， H-21）， 0.93 （1H， s， H-19）， 0.80 （1H， s， H-18）; 13C-NMR （150 MHz， CDCl3） δC： 176.6 （C-3）， 150.1 （C-4）， 146.8 （C-8）， 130.6 （C-25）， 125.5 （C-24）， 118.0 （C-7）， 111.9 （C-28）， 53.1 （C-17）， 51.6 （C-14）， 45.4 （C-5）， 43.7 （C-13）， 39.0 （C-9）， 36.4 （C-10）， 36.2 （C-22）， 36.0 （C-20）， 34.2 （C-15）， 33.9 （C-12）， 29.8 （C-6）， 29.7 （C-1）， 29.4 （C-2）， 28.3 （C-16）， 27.3 （C-30）， 25.9 （C-29）， 25.6 （C-26）， 25.1 （C-23）， 24.1 （C-19）， 21.6 （C-18）， 18.7 （C-11）， 18.3 （C-21）， 17.5 （C-27）。以上數據與文獻[20]一致，故鑒定為seco-coccinic acid F。

化合物4：不定型無色粉末，HR-ESI-MS測定其準分子離子峰m/z： 463.353 8 [M+Na]+ （計算值為463.354 5， C30H48O2Na+）； 1H-NMR （600 MHz， CDCl3） δH：5.10 （1H， t， H-24）， 4.91 （1H， brs， H-28）， 4.69 （1H， brs， H-28）， 2.42 （1H， m， H-2）， 2.13 （1H， m， H-5）， 2.13 （1H， m， H-11）， 2.08 （1H， m， H-23）， 2.03 （1H， m， H-7）， 2.02 （1H， m， H-1）， 1.93 （1H， m， H-16）， 1.93 （1H， m， H-11）， 1.84 （1H， m， H-1）， 1.77 （1H， s， H-29）， 1.76 （1H， m， H-12）， 1.69 （1H， s， H-26）， 1.61 （1H， s， H-27）， 1.60 （1H， m， H-15）， 1.55 （1H， m， H-6）， 1.50 （1H， m， H-17）， 1.50 （1H， m， H-22）， 1.42 （1H， m， H-20）， 1.31 （1H， m， H-16）， 1.20 （1H， m， H-15）， 1.04 （1H， m， H-22）， 0.97 （1H， s， H-30）， 0.96 （1H， s， H-19）， 0.92 （1H， d， H-21）， 0.73 （1H， s， H-18）; 13C-NMR （150 MHz， CDCl3） δC：179.1 （C-3）， 147.4 （C-4）， 139.4 （C-8）， 131.0 （C-9）， 129.2 （C-25）， 125.2 （C-24）， 113.9 （C-28）， 50.8 （C-14）， 50.4 （C-17）， 46.9 （C-5）， 44.4 （C-13）， 40.4 （C-10）， 36.3 （C-20）， 36.3 （C-22）， 32.3 （C-1）， 31.1 （C-12）， 31.0 （C-15）， 29.2 （C-2）， 28.1 （C-16）， 25.9 （C-7）， 25.8 （C-26）， 25.2 （C-23）， 25.2 （C-30）， 24.0 （C-6）， 22.9 （C-29）， 22.3 （C-19）， 21.7 （C-11）， 18.7 （C-21）， 17.7 （C-27）， 16.0 （C-18）。以上數據與文獻[21]一致，故鑒定為seco-coccinic acid G。

化合物5：不定型無色粉末，HR-ESI-MS測定其準分子離子峰m/z： 453.337 5 [M-H]- （計算值為453.336 9， C30H45O3-）； 1H-NMR （600 MHz， CDCl3） δH： 6.90 （1H， m， H-24）， 2.29 （1H， m， H-2）， 2.27 （1H， m， H-2）， 2.27 （1H， m， H-11）， 2.14 （1H， m， H-23）， 2.05 （1H， m， H-16）， 1.90 （1H， m， H-7）， 1.87 （1H， m， H-15）， 1.85 （1H， s， H-27）， 1.72 （1H， m， H-5）， 1.67 （1H， m， H-22）， 1.60 （1H， m， H-17）， 1.58 （1H， m， H-8）， 1.57 （1H， m， H-20）， 1.56 （1H， m， H-15）， 1.56 （1H， m， H-6）， 1.43 （1H， m， H-12）， 1.38 （1H， m， H-23）， 1.31 （1H， m， H-1）， 1.29 （1H， m， H-7）， 1.19 （1H， m， H-20）， 1.10 （1H， s， H-30）， 1.02 （1H， s， H-29）， 1.00 （1H， s， H-18）， 0.96 （1H， m， H-6）， 0.92 （1H， d， H-21）， 0.91 （1H， s， H-28）， 0.78 （1H， m， H-19）， 0.57 （1H， m， H-19）; 13C-NMR （150 MHz， CDCl3） δC：216.7 （C-3）， 172.6 （C-26）， 145.8 （C-24）， 26.5 （C-25）， 52.2（C-17）， 50.3 （C-4）， 48.7 （C-14）， 48.4 （C-5）， 47.9 （C-8）， 45.4 （C-13）， 37.5 （C-2）， 36.0 （C-12）， 35.5 （C-1）， 34.8 （C-20）， 33.4 （C-15）， 32.8 （C-22）， 29.6 （C-19）， 28.2 （C-7）， 26.7 （C-16）， 26.0 （C-10）， 26.0 （C-11）， 25.9 （C-23）， 22.2 （C-29）， 21.5 （C-6）， 21.1 （C-9）， 20.8 （C-30）， 19.3 （C-28）， 18.1 （C-18）， 18.1 （C-21）， 12.0 （C-27）。以上數據與文獻[22]一致，故鑒定為schisandronic acid。

化合物6：不定型無色粉末，HR-ESI-MS測定其準分子離子峰m/z： 465.300 9 [M-H]- （計算值為465.301 0， C30H41O4-）； 1H-NMR （600 MHz， CDCl3） δH：6.61 （1H， d， H-24）， 6.13 （1H， d， H-1）， 5.96 （1H， d， H-2）， 4.47 （1H， d， H-22）， 2.42 （1H， m， H-5）， 2.39 （1H， m， H-23）， 2.10 （1H， m， H-23）， 2.09 （1H， m， H-7）， 2.05 （1H， m， H-20）， 1.93 （1H， s， H-27）， 1.86 （1H， m， H-19）， 1.82 （1H， m， H-8）， 1.78 （1H， m， H-11）， 1.71 （1H， m， H-12）， 1.64 （1H， m， H-7）， 1.61 （1H， m， H-17）， 1.49 （1H， m， H-6）， 1.41 （1H， m， H-11）， 1.39 （1H， s， H-29）， 1.37 （1H， s， H-28）， 1.36 （1H， m， H-16）， 1.24 （1H， m， H-15）， 1.21 （1H， m， H-6）， 1.06（1H， m， H-15）， 1.00 （1H， s， H-18）， 0.98 （1H， d， H-21）， 0.91 （1H， s， H-30）， 0.821 H， m， H-19）; 13C-NMR （150 MHz， CDCl3） δC： 167.6 （C-3）， 166.7 （C-26）， 150.8 （C-1）， 139.5 （C-24）， 128.5 （C-25）， 120.4 （C-2）， 84.7 （C-4）， 80.6 （C-22）， 48.8 （C-14）， 48.1 （C-17）， 46.4 （C-5）， 45.6 （C-13）， 45.1 （C-8）， 39.3（C-20）， 35.1 （C-16）， 33.5 （C-9）， 32.5 （C-12）， 32.3 （C-15）， 29.3 （C-29）， 29.0 （C-7）， 28.8 （C-10）， 27.0 （C-11）， 24.5 （C-6）， 24.1 （C-19）， 23.6 （C-23）， 22.2 （C-28）， 19.1 （C-30）， 17.3 （C-18）， 17.1 （C-27）， 13.3 （C-21）。以上數據與文獻[23]一致，故鑒定為schisanlactone B。

4.2 網絡藥理學分析結果

4.2.1 黑老虎三萜類成分-RA共有靶點的預測 將分離得到的6個黑老虎三萜類成分導入Swiss Target Prediction數據庫中，靶標識別結果顯示，6個黑老虎三萜類成分作用靶點去重復后共有109個。通過檢索在線疾病數據庫GeneCards和MalaCards，將兩個數據庫的全部疾病基因進行合并整理，設置分數＞5，確定最終的RA疾病相關靶點基因有691個。將691個疾病靶點與109個三萜類成分作用靶點進行交集，結果顯示，交集靶基因共有38個。并構建韋恩圖預測黑老虎三萜類成分-RA共有靶點。詳見圖1。

4.2.2 黑老虎三萜類成分-RA共有靶點網絡構建 利用STRING數據庫對可能的RA治療靶基因進行分析，獲取其相互作用關系，借助Cytoscape 3.6.0 構建PPI網絡，該網絡包含38個節點和179個邊。對排序前15位的基因依次命名為蛋白激酶B1（RAC-alpha serine/threonine-protein kinase B1， AKT1）（30）、TNF（25）、絲裂原激活蛋白激酶1（mitogen-activated protein kinase， MAPK）1（23）、前列腺素內過氧化物合酶2（prostaglandin-endoperoxide synthase 2， PTGS2）（22）、MAPK14（19）、熱休克蛋白90α家族A類成員1（heat shock protein 90 alpha family class A member 1， HSP90AA1）（16）、雌激素受體1（estrogen receptor1， ESR1）（16）、過氧化物酶體增殖物激活受體γ（peroxisome proliferator-activated receptor γ， PPARG）（14）、蛋白酪氨酸磷酸酶受體C型（protein tyrosine phosphatase receptor type C， PTPRC）（14）、雄激素受體（androgen receptor， AR）（14）、孕激素受體（progesterone receptor， PGR）（13）、核受體亞家族3C組成員1（nuclear receptor subfamily 3 group C member 1， NR3C1）（12）、基質金屬蛋白酶1（matrix metallopeptidase 1， MMP1）（11）、細胞色素P450家族19亞家族A成員1（cytochrome P450 family 19 subfamily A member 1， CYP19A1）（10）和誘導型一氧化氮合酶（nitric oxide synthase 2， NOS2）（10）。上述靶點在PPI網絡中發揮重要作用，可能是黑老虎與RA關聯的核心靶點。詳見圖2。

4.2.3 黑老虎三萜類成分-RA共有靶點的GO功能和KEGG富集分析 對38個可能的RA治療靶點進行GO富集分析，以確定黑老虎治療RA的相關生物學功能。GO功能富集分析主要包括BP、MF和CC

3個方面；經過篩選，展示出富集到的15個BP、3個CC以及10個MF，詳見圖3。通過KEGG通路分析，確定黑老虎抗RA作用的相關信號通路，共篩選出20條排名最高的路徑，主要包括TNF信號通路，IL-17信號通路和血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor， VEGF）信號通路等。詳見圖3—4。

4.2.4 構建“藥物-活性成分-靶標-通路”網絡關系圖 圖中共有75個節點，構成352條相互作用關系，這體現了黑老虎多成分、多靶點、多通路的作用機制。藥物-活性成分-靶標-通路網絡通路結果顯示，顯著富集的8個關鍵靶點分別是MAPK1、AKT1、MAPK14、TNF、PTGS2、NOS2、HSP90AA1和PRKCD。詳見圖5。

4.3 炎性因子TNF-α和IL-6的表達水平

與正常組對比，經過LPS誘導后RAW 264.7細胞上清液中炎性因子TNF-α和IL-6的表達水平顯著升高（P<0.01）。與模型組相比，濃度為10.0 μmol/L和20.0 μmol/L的化合物1～6能抑制炎性因子TNF-α的表達（P<0.05，P<0.01），化合物1， 2， 5， 6能顯著抑制炎性因子IL-6的表達（P<0.01）。詳見圖6。

4.4 抑制RA滑膜細胞的增殖活性

采用MTT法篩選分離得到6個化合物的抑制RA-FLS細胞增殖的活性，陽性對照藥為吲哚美辛，結果顯示化合物2，3，4，6展示出明顯的抑制活性。詳見表1。

4.5 Western blot實驗結果

根據網絡藥理學研究結果，選擇I？資B-α蛋白進行作用機制的研究。在化合物3的作用下，與正常組相比，I？資B-α蛋白的表達水平升高（P<0.05，P<0.01）。說明化合物3可能通過激活I？資B-α蛋白的表達水平來抑制TNF信號通路，從而發揮抗RA的作用。詳見圖7。

5 討論

RA已成為醫學領域中亟待解決的難題[24]，從中藥中尋找安全、有效的抗RA藥物來解決這一難題，具有重要的科學價值和社會意義。研究發現，黑老虎中的三萜類化合物具有很好的抗RA作用[19]。ELISA法檢測化合物1～6對LPS誘導RAW 264.7細胞產生炎性因子的表達水平的影響實驗說明，黑老虎中的三萜類化合物能緩解RA中的炎癥反應。結合GO功能和KEGG富集分析實驗結果，提示黑老虎的靶點可能參與類固醇激素受體活性、核受體活性、類固醇結合等。本課題組認為，黑老虎是通過TNF、IL-17信號通路等多成分、多靶點、多信號通路的相互作用發揮抗炎作用，從而治療RA。

目前，研究表明，Th17細胞在自身免疫中的作用，包括RA，提示Th17細胞在RA的發病機制中可能扮演著重要的角色[24]。其中，Th17細胞免疫反應活躍，IL-6驅動Th17細胞分化[25]，從而在自身免疫疾病中發揮重要作用。IL-6和TNF-α是RA骨病變中關鍵的促炎細胞因子[27]。TNF-α通過促進NF-？資B亞基p65、p50和c-Rel的核易位直接激活NF-？資B的經典途徑[27-29]，其中蛋白I？資B-α可以活化I？資B激酶復合體，最終激活NF-？資B，誘導炎癥細胞因子wGeMSg6XyaHg5mUfTNA0cQ==、趨化因子和基質金屬蛋白酶的表達，繼而促進RA滑膜細胞增殖和活化，軟骨損傷，最終導致關節破壞[28]。結果表明，黑老虎中三萜類化合物可能通過上調I？資B-α蛋白來抑制NF-？資B通路激活發揮抗RA-FLS細胞增殖和抗炎作用來改善RA。

綜上所述，本研究基于瑤藥黑老虎行氣活血、祛風活絡、散瘀止痛的功效，采用網絡藥理學的方法研究黑老虎治療RA的藥效物質基礎。在本研究中，本課題組探討了瑤藥黑老虎三萜類成分對RA的作用機制，并進行相關實驗驗證，通過構建“藥物-活性成分-靶標-通路”網絡關系圖并進一步結合蛋白免疫印跡實驗，明確了黑老虎活性三萜類成分通過抑制炎癥因子IL-6和TNF-α的釋放，上調I？資B-α蛋白的表達，改善RA，其作用機制可能與TNF通路有關。然而，研究結果仍存在一些限制性因素，例如本課題組未能充分考慮其他可能影響藥物作用的因素，如個體的遺傳差異、環境因素以及不同藥物之間的相互作用。此外，實驗模型的選擇也可能限制了結果的普遍適用性。本研究團隊后續將進一步在佐劑誘導的關節炎或膠原誘導型關節炎大鼠動物模型中，驗證黑老虎三萜類成分的體內抗RA效果，以及繼續研究其他信號通路，從而闡明瑤藥黑老虎抗RA的作用機制，并在臨床上為黑老虎治療RA的應用提供科學依據。

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