基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探究黃芩苷抗骨肉瘤的作用機(jī)制及其與SP600125協(xié)同效應(yīng)的研究

〔摘要〕 目的 本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和體外實(shí)驗(yàn)探討黃芩苷治療骨肉瘤的潛在靶點(diǎn)和作用機(jī)制以及其與SP600125協(xié)同效應(yīng)的研究。方法 運(yùn)用PharmMapper、Swiss Target Prediction、 Genecards、OMIM和TTD數(shù)據(jù)庫檢索黃芩苷和骨肉瘤的潛在靶點(diǎn)。通過STRING平臺(tái)構(gòu)建蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)圖和篩選核心靶點(diǎn)。使用R語言進(jìn)行GO和KEGG富集分析。在GEO數(shù)據(jù)庫篩選出骨肉瘤中的差異表達(dá)基因。采用分子對接方法評估其與核心靶點(diǎn)的結(jié)合潛力。利用CCK-8細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞凋亡檢測、透射電子顯微鏡和Western blot驗(yàn)證其作用機(jī)制。結(jié)果 通過數(shù)據(jù)庫確定46個(gè)黃芩苷治療骨肉瘤的潛在靶點(diǎn)。通過蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)篩選出23個(gè)核心靶點(diǎn)。GO和KEGG富集分析表明，磷脂酰肌醇三激酶（phosphatidylinositol 3-kinase， PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B， PKB/AKT）通路和絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase， MAPK）通路和凋亡通路在黃芩苷治療骨肉瘤中起著關(guān)鍵作用。核心靶點(diǎn)與骨肉瘤差異性表達(dá)基因比對的結(jié)果發(fā)現(xiàn)，AKT1、熱休克蛋白90α （heat shock protein 90 alpha， HSP90AA1）、膜聯(lián)蛋白A5（annexin A5， ANXA5）、細(xì)胞周期檢驗(yàn)點(diǎn)激酶1（checkpoint kinase 1， CHEK1）和尿激酶型纖溶酶原激活劑（urokinase-type plasminogen activator， PLAU）在骨肉瘤組織中的表達(dá)高于正常骨組織。分子對接揭示黃芩苷與AKT1、HSP90AA1、ANXA5、CHEK1和PLAU靶點(diǎn)有較好的結(jié)合活性。體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)表明，黃芩苷抑制HOS和143B骨肉瘤細(xì)胞的增殖和遷移，并促進(jìn)細(xì)胞凋亡。此外，聯(lián)合使用c-Jun氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase， JNK）抑制劑SP600125進(jìn)一步增強(qiáng)了黃芩苷的抗骨肉瘤作用。透射電子顯微鏡顯示，黃芩苷增加骨肉瘤細(xì)胞內(nèi)自噬小體的數(shù)量，但與SP600125聯(lián)合時(shí)，黃芩苷誘導(dǎo)的自噬小體的增多會(huì)受到抑制。Western blot分析結(jié)果表明，黃芩苷抑制了AKT1蛋白的磷酸化和p-AKT/AKT表達(dá)水平，并與SP600125共處理可增強(qiáng)該抑制作用。另外，黃芩苷可誘導(dǎo)骨肉細(xì)胞內(nèi)LC3-II和p62以及p-JNK/JNK的表達(dá)，但與SP600125聯(lián)用會(huì)顯著抑制此效應(yīng)。結(jié)論 黃芩苷通過多靶點(diǎn)和多通路的相互作用發(fā)揮抗骨肉瘤效應(yīng)。此外，SP600125協(xié)同增強(qiáng)了黃芩苷治療骨肉瘤的效應(yīng)，為骨肉瘤的治療提供了研究依據(jù)和理論支持。

〔關(guān)鍵詞〕 骨肉瘤；黃芩苷；網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)； 蛋白激酶B1；自噬；SP600125

〔中圖分類號(hào)〕R285.5 〔文獻(xiàn)標(biāo)志碼〕A 〔文章編號(hào)〕doi：10.3969/j.issn.1674－070X.２０24.10.018

Mechanism of action of baicalin against osteosarcoma and its synergistic effects with SP600125 based on network pharmacology

LIAO Xinghua， PANG He， WU Hang， WEI Bo*

Orthopedic Center， Hospital of Guangdong Medical University， Zhanjiang， Guangdong 524001， China

〔Ａｂｓｔｒａｃｔ〕 Objective To investigate the potential targets and mechanism of action of baicalin in treating osteosarcoma and its synergistic effects with SP600125 by network pharmacology and in vitro experimentation. Methods Using PharmMapper， Swiss Target Prediction， Genecards， OMIM， and TTD databases， potential targets for baicalin and osteosarcoma were retrieved. A protein-protein interaction network was constructed and core targets were screened through the STRING platform. GO and KEGG enrichment analyses were performed using R language. Differentially expressed genes in osteosarcoma were identified from the GEO database. Molecular docking was employed to assess the binding potential with the core targets. The mechanism of action was validated through CCK8 cell proliferation assays， cell migration assays， apoptosis detection， transmission electron microscopy， and Western blot. Results Through database analysis， 46 potential targets for baicalin in the treatment of osteosarcoma were identified. Among these， 23 core targets were screened via the protein-protein interaction network. GO and KEGG enrichment analyses indicated that the phosphatidylinositol 3-kinase （PI3K）/protein kinase B （PKB/AKT） pathway， the mitogen-activated protein kinase （MAPK） pathway， and the apoptosis pathway play pivotal roles in the treatment of osteosarcoma with baicalin. By comparing the core targets with differentially expressed genes in osteosarcoma， it was found that AKT1， heat shock protein 90 alpha （HSP90AA1）， annexin A5 （ANXA5）， checkpoint kinase 1 （CHK1）， and urokinase-type plasminogen activator （PLAU） were expressed at higher levels in osteosarcoma tissues than in normal bone tissues. Molecular docking revealed that baicalin exhibited good binding activity with AKT1， HSP90AA1， ANXA5， CHK1， and PLAU targets. In vitro cell experiments demonstrated that baicalin inhibited the proliferation and migration of HOS and 143B osteosarcoma cells while promoting cell apoptosis. Furthermore， the combination with the c-Jun N-terminal kinase （JNK） inhibitor SP600125 further enhanced the anti-osteosarcoma effects of baicalin. Transmission electron microscopy showed that baicalin increased the number of autophagosomes within osteosarcoma cells， but this increase was inhibited when combined with SP600125. Western blot analysis indicated that baicalin inhibited the phosphorylation of AKT1 protein and reduced the p-AKT/AKT expression level， and cotreatment with SP600125 enhanced this inhibitory effect. Additionally， baicalin induced the expression of LC3-II， p62， and p-JNK/JNK in osteosarcoma cells， but this induction was significantly suppressed when combined with SP600125. Conclusion Baicalin exerts anti-osteosarcoma effects through interaction with multiple targets and pathways. Furthermore， SP600125 synergistically enhances the therapeutic efficacy of baicalin in treating osteosarcoma， providing research evidence and theoretical support for the treatment of this disease.

〔Ｋｅｙｗｏｒｄｓ〕 osteosarcoma; baicalin; network pharmacology; protein kinase B1; autophagy; SP600125

骨肉瘤是一種常見的原發(fā)性惡性骨腫瘤，好發(fā)于青少年，主要發(fā)生四肢長骨干骺端，如股骨遠(yuǎn)端和脛骨近端[1]。骨肉瘤以其高度的惡性特征而著稱，具有快速的生長速度和轉(zhuǎn)移能力，因此治療起來相當(dāng)困難，導(dǎo)致患者的致殘率和死亡率較高[2]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，骨肉瘤患者的綜合5年生存率僅為60%～70%，而一旦出現(xiàn)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移或復(fù)發(fā)的情況，這一比例會(huì)驟降至20%，其中轉(zhuǎn)移性病灶的存在是預(yù)后不良的主要因素[3]。在初次診斷時(shí)，已有80%的骨肉瘤患者體內(nèi)存在可測量的轉(zhuǎn)移性或微轉(zhuǎn)移性病灶。因此，幾乎所有患者在接受手術(shù)切除治療后，還需要進(jìn)行新輔助化學(xué)治療[4-5]。目前，大劑量甲氨蝶呤聯(lián)合阿霉素和順鉑的化療方案已成為治療骨肉瘤標(biāo)準(zhǔn)化學(xué)治療方案。然而，由于其毒副作用，在臨床應(yīng)用受到一定的限制[6]。此外，對于已發(fā)生轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)或不可切除的腫瘤患者通常會(huì)對當(dāng)前化學(xué)治療方案產(chǎn)生耐藥[7]。因此，尋找有效的新型抗骨肉瘤藥物具有重要意義。

植物天然有效成分，因其多靶點(diǎn)和多途徑的協(xié)同作用，在腫瘤發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移以及免疫調(diào)節(jié)等各個(gè)階段都展現(xiàn)出治療潛力，成為抗腫瘤先導(dǎo)化合物的重要來源[8]。黃芩苷（Baicalin，C21H18O11）是一種從黃芩植物中提取的黃酮類化合物，具備多種藥理活性，包括抗氧化、抗腫瘤、抗菌和保護(hù)心腦血管功能等[9]。在抗腫瘤方面，黃芩苷表現(xiàn)出顯著效果，并且對健康組織無顯示毒性[9-10]。SP600125（C14H8N2O）是一種具有強(qiáng)大滲透能力的小分子化合物，它通過ATP競爭機(jī)制與JNK結(jié)合，有效地抑制了JNK1、JNK2和JNK3的活性，從而干擾了細(xì)胞的生物過程[11]。體內(nèi)外的研究揭示，該化合物對多種腫瘤表現(xiàn)顯著的治療潛力，特別是對膀胱癌、骨肉瘤和肺癌等，其能夠通過影響腫瘤細(xì)胞周期阻滯、抑制轉(zhuǎn)移行為、促進(jìn)凋亡和抑制自噬，以及增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對藥物的敏感性來發(fā)揮作用[12]。

1 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法

1.1 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫及軟件

PubChem數(shù)據(jù)庫（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/），PharmMapper數(shù)據(jù)庫（http：//www.lilab-ecust.cn/pharmmapper/），Swiss Target Prediction數(shù)據(jù)庫（http：//www.swisstargetprediction.ch/），GeneCards數(shù)據(jù)庫（https：//www.genecards.org/），OMIM數(shù)據(jù)庫（https：//omim.org/），TTD數(shù)據(jù)庫（http：//db.idrblab.net/ttd/），DAVID數(shù)據(jù)庫（https：//david.ncifcrf.gov/），STRING數(shù)據(jù)庫（https：//string-db.org/），Venny 2.1在線軟件作圖工具平臺(tái)（https：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/），UniProt數(shù)據(jù)庫（https：//www.uniprot.org/），GEO數(shù)據(jù)庫（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/），Cytoscape 3.8.2軟件，R4.0.5軟件等。

1.2 黃芩苷-骨肉瘤共同靶點(diǎn)的篩選

通過PubChem數(shù)據(jù)庫獲取其化學(xué)結(jié)構(gòu)信息。隨后，將此結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)輸入到PharmMapper數(shù)據(jù)庫中，篩選出Norm Fit值大于0.6的潛在靶點(diǎn)。同時(shí)，利用Swiss Target Prediction數(shù)據(jù)庫進(jìn)一步預(yù)測黃芩苷可能作用的靶點(diǎn)。通過UniProt數(shù)據(jù)庫校正所獲得靶點(diǎn)的名稱。以“Osteosarcoma”作為關(guān)鍵詞在Gene？鄄Cards、OMIM和TTD數(shù)據(jù)庫中搜索與骨肉瘤相關(guān)的靶點(diǎn)。收集這些疾病相關(guān)靶點(diǎn)的信息后，使用Venny 2.1在線工具繪制韋恩圖，找出藥物靶點(diǎn)與疾病靶點(diǎn)之間的交集。最終，采用Cytoscape軟件構(gòu)建一個(gè)“疾病-靶點(diǎn)-成分”網(wǎng)絡(luò)圖。

1.3 靶點(diǎn)相互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及核心靶點(diǎn)分析

將篩選出的共同靶點(diǎn)輸入STRING數(shù)據(jù)庫中檢索共同靶點(diǎn)之間的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（protein-protein interaction，PPI）網(wǎng)絡(luò)關(guān)系。設(shè)置篩選條件為“Homo sapiens”以確保蛋白種類Human，并將相互作用閾值設(shè)定為0.4，以檢索置信度較高的PPI網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)。隨后，將獲得的PPI數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape軟件，繪制出詳細(xì)的PPI網(wǎng)絡(luò)圖。接著，利用Cytoscape中的NetworkAnalyzer工具對PPI網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)進(jìn)行拓?fù)浞治觥；贒egree值參數(shù)進(jìn)行排序，選取Degree值高于平均值的基因作為核心靶點(diǎn)。最后，使用R軟件對選定的核心靶點(diǎn)進(jìn)行數(shù)據(jù)可視化。

1.4 GO和KEGG富集分析

利用R軟件結(jié)合Bioconductor生物信息學(xué)軟件包，對篩選出的潛在靶點(diǎn)進(jìn)行了基因本體論（gene ontology， GO）和京都基因與基因組數(shù)據(jù)庫（Kyoto encyclopedia of genes and genomes， KEGG）的富集分析，其中設(shè)定P<0.05和Q<0.05作為篩選條件。挑選各部分GO富集分析P值排名前10的條目，通過柱狀圖形式呈現(xiàn)。富集分析基于P值排序，選出KEG富集分析的前30個(gè)條目，并采用氣泡圖的方式展現(xiàn)了涉及的信號(hào)傳導(dǎo)通路。

1.5 核心靶點(diǎn)的差異表達(dá)基因分析

從GEO數(shù)據(jù)庫下載了GSE99671數(shù)據(jù)集，該數(shù)據(jù)集包括18例骨肉瘤組織和18例正常骨組織的序列文件。接著，提取了骨肉瘤患者的基因表達(dá)矩陣，并對數(shù)據(jù)進(jìn)行了歸一化處理，將原始的Counts數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換成TPM（transcripts per million），以實(shí)現(xiàn)表達(dá)量的標(biāo)準(zhǔn)化。然后利用平臺(tái)注釋文件對基因名進(jìn)行注釋。結(jié)合PPI分析確定的核心靶點(diǎn)與歸一化后的基因表達(dá)數(shù)據(jù)，篩選出在正常樣本和骨肉瘤樣本之間表現(xiàn)出顯著差異的差異表達(dá)基因。

1.6 分子對接

黃芩苷的結(jié)構(gòu)來自PubChem數(shù)據(jù)庫，然后導(dǎo)入Schr dinger軟件經(jīng)過加氫、結(jié)構(gòu)優(yōu)化和能量最小化保存后作為分子對接的配體。蛋白結(jié)構(gòu)AKT1（PDB

ID：7NH5）、HSP90AA1（PDB ID：3O0I）、ANXA5（PDB ID：2XO3）、CHEK1（PDB ID：2HXL）和PLAU（PDB ID：1C5Y）來自RCSB數(shù)據(jù)庫（https：//www.rcsb.org/）。蛋白結(jié)構(gòu)在Schr？觟dinger Maestro軟件進(jìn)行處理，使用Protein Preparation Wizard模塊去除蛋白結(jié)晶水，補(bǔ)充缺失的氫原子，修復(fù)缺失的肽鍵和肽段信息，進(jìn)行能量最小化和幾何結(jié)構(gòu)的優(yōu)化。在Glide模塊中進(jìn)行篩選時(shí)，根據(jù)蛋白結(jié)構(gòu)的小分子配體確定對接位點(diǎn)，位點(diǎn)盒子大小設(shè)為15 ？魡×15 ？魡×15 ？魡。最后通過Standard Precision Glide Docking方法進(jìn)行分子對接和篩選。對接后的復(fù)合物使用Pymol2.1軟件進(jìn)行可視化，分析黃芩苷和靶點(diǎn)蛋白的作用模式。

2 材料

2.1 主要藥品和試劑

黃芩苷（HPLC≥98%；上海源葉生物科技有限公司，批號(hào)：B20570）；SP600125（HPLC≥99.7%； Medchem Express公司，批號(hào)：HY-12041）；抗體p-AKT1（批號(hào)：9018）、AKT1（批號(hào)：2938）、JNK（批號(hào)：9252）、p-JNK（批號(hào)：4668）、Bax（批號(hào)：2772）、Bcl-2（批號(hào)：4223）、辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG（批號(hào)：7074）和抗小鼠IgG（批號(hào)：7076）均購買于Cell Signaling Technology公司；抗體p-AKT（批號(hào)： ab192623）、AKT（批號(hào)：ab179463）、LC3（批號(hào)：ab48394）和p62（批號(hào)：ab56416）抗體購買于Abcam公司；抗體GAPDH（批號(hào)：21612）購買于Signalway Antibody公司；1%青霉素-鏈霉素混合液（北京索萊寶科技有限公司，批號(hào)：P1400）；10%胎牛血清FBS（批號(hào)：A5669401）、MEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基（批號(hào)：11095080）均購買于Thermo Fisher Scientific公司；ECL顯色劑（Zeta Life公司，批號(hào)：310212）；0.1%結(jié)晶紫（批號(hào)：C0121）、Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測試劑盒（批號(hào)：C1062M）、BCA蛋白濃度測定試劑盒（批號(hào)P0010S）、5X SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液（批號(hào)：P0015）均購自碧云天生物技術(shù)研究所。

2.2 主要儀器

微孔板讀取（型號(hào)：MK3，Thermo Fisher Scientific公司）；流式細(xì)胞儀（型號(hào)：FACSCelesta，BD Biosciences公司）；熒光成像系統(tǒng)（型號(hào)：Tanon-5200Multi，Tanon公司）；透射電子顯微鏡（型號(hào)：JEM-1400，JEOL公司）；超薄切片機(jī)（型號(hào)：Leica EM UC7，Leica Microsystems公司）。

3 體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)

3.1 細(xì)胞培養(yǎng)

將143B和HOS骨肉瘤細(xì)胞以10×105的密度接種在10 cm×10 cm的細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，使用添加了1%青霉素-鏈霉素混合液和10%胎牛血清FBS的MEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。細(xì)胞被放置在恒溫37 ℃和5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中。定期檢查細(xì)胞的生長狀態(tài)，并適時(shí)更換培養(yǎng)基。當(dāng)細(xì)胞生長接近密集單層，即達(dá)到80%～90%的融合度時(shí)，便進(jìn)行傳代操作。

3.2 CCK-8檢測細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)

將骨肉瘤細(xì)胞懸液以每孔3.0×103個(gè)細(xì)胞的密度接種于96孔板中，并在37 ℃、5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱孵育24 h。之后，細(xì)胞被不同濃度（0、20、40、80 μmol·L-1）的黃芩苷或不同濃度（0、10、20、40 μmol·L-1）SP600125處理48 h。若需聯(lián)合使用20 μmol·L-1濃度的SP600125，則在黃芩苷干預(yù)前對細(xì)胞進(jìn)行4 h的預(yù)處理。為了評估細(xì)胞活力，向每個(gè)孔中加入10 μL

CCK-8檢測溶液，在37 ℃、5% CO2的條件下繼續(xù)孵育2～4 h，測定450 nm的波長的吸光度值。

3.3 細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)

為了評估黃芩苷或SP600125對骨肉瘤細(xì)胞遷移能力的影響，使用Transwell小室進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。首先，將骨肉瘤細(xì)胞用MEM培養(yǎng)基重新懸浮，并取100 μL的細(xì)胞懸液（含2.0×104個(gè)細(xì)胞）加入Transwell小室的上室中。在下室中加入500 μL含有10% FBS的MEM培養(yǎng)基，然后放入恒溫37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)24 h。培養(yǎng)結(jié)束后，輕輕用棉簽擦去上室內(nèi)未發(fā)生遷移的細(xì)胞。對于遷移至膜內(nèi)側(cè)的細(xì)胞，使用甲醇固定15 min，隨后以0.1%結(jié)晶紫染色10 min。PBS徹底清洗掉多余的染料。最后，在放大倍數(shù)400×顯微鏡視野下觀察染色后的細(xì)胞，并在隨機(jī)選取的5個(gè)視野拍照。所得圖片可通過Image J軟件進(jìn)行定量分析

3.4 流式細(xì)胞凋亡檢測

為準(zhǔn)確評估骨肉瘤細(xì)胞的凋亡比例，采用Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測試劑檢測。骨肉瘤細(xì)胞先經(jīng)80 μmol·L-1黃芩苷單獨(dú)處理或與20 μmol·L-1 SP600125聯(lián)合處理48 h。處理后，用5 μL Annexin

V-FITC和10 μL碘化丙啶染色液對細(xì)胞進(jìn)行染色，再加入195 μL Annexin V-FITC結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞。隨后，在室溫下將細(xì)胞避光孵育30 min以促進(jìn)染料結(jié)合。孵育結(jié)束后，采用流式細(xì)胞儀對細(xì)胞樣本進(jìn)行檢測，并通過BD FACSDiva軟件來定量染色后的凋亡細(xì)胞比例。

3.5 透射電子顯微鏡觀察及樣品制備

前固定：骨肉瘤細(xì)胞在4 ℃下用3%戊二醛固定4 h，隨后用0.1 mol·L-1二甲砷酸鈉緩沖液換洗3次，每2 h一次。后固定：樣本在4 ℃下用1%鋨酸浸泡2 h，然后用0.1 mol/L二甲砷酸鈉緩沖液沖洗2次，15 min/次。染色：室溫下用飽和醋酸鈾染料染色2 h。脫水與滲透：樣本依次在4 ℃的50%、70%乙醇和室溫的80%、90%乙醇中脫水，然后在室溫下用100%乙醇處理2次，接著用丙酮滲透2次，15 min/次。最后，樣本在室溫下用完全包埋液（Eponate12環(huán)氧樹脂）與丙酮的混合液（比例1∶1）滲透3 h，然后比例1∶2滲透3 h，最后用完全包埋液滲透過夜。包埋：樣本在40 ℃下用完全包埋液浸泡12 h，然后在60 ℃條件移至包埋板并溫育48 h。超薄切片：使用超薄切片機(jī)制作90 nm厚的切片。電鏡觀察：使用透射電子顯微鏡在80 kV的工作電壓下觀察樣本，并用DigitalMicrograph軟件進(jìn)行圖像采集。

3.6 Western bolt檢測

收集經(jīng)黃芩苷或與SP600125聯(lián)合干預(yù)后的骨肉瘤細(xì)胞沉淀，在4 ℃條件下加入適量預(yù)混有PMSF（PMSF∶RIPA=1∶100）的RIPA裂解液。使用細(xì)胞刮刀徹底將細(xì)胞碎片收集到EP管中，并在冰上持續(xù)裂解30 min。隨后進(jìn)行30 s的超聲處理，以促進(jìn)細(xì)胞充分裂解。完成裂解后，樣本在4 ℃、12 000 r/min的條件下離心（離心半徑9 cm）15 min，然后將上層清澈的蛋白溶液轉(zhuǎn)移到新的EP管中。根據(jù)BCA蛋白濃度測定試劑盒的說明書配制BCA定量標(biāo)準(zhǔn)曲線，并測定及調(diào)整各組蛋白樣品濃度一致。向每組蛋白樣品加入適量的5X SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液，混合均勻后在99 ℃下煮沸10 min使蛋白變性。使用配制好的10%或12% SDS-PAGE凝膠，每個(gè)樣本孔道加載20 μg蛋白質(zhì)，在100 V電壓下電泳60 min進(jìn)行分離。之后，在250 mA恒流條件下，將凝膠上的蛋白轉(zhuǎn)印2.5 h至0.2 μm孔徑的PVDF膜。PVDF膜用5%脫脂牛奶封閉60 min。根據(jù)Marker位置和目標(biāo)蛋白，裁剪相應(yīng)的膜片，并加入一抗p-AKT1、AKT1、JNK、p-JNK、p-AKT、AKT、Bax、Bcl-2、LC3、p62和GAPDH（均按1∶1 000稀釋）在4 ℃冰箱中孵育12 h。然后與相應(yīng)的二抗（均按1∶5 000稀釋）在室溫避光孵育1 h。最后，使用ECL顯色劑結(jié)合熒光成像系統(tǒng)曝光膜上的蛋白條帶。利用Image J軟件對蛋白條帶進(jìn)行灰度值分析，并以GAPDH為內(nèi)參計(jì)算目標(biāo)蛋白的表達(dá)水平。

3.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所有數(shù)據(jù)均表示為3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的“ｘ±s”，并使用SPSS 25.0和GraphPad Prism 8.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析和繪圖。對于兩組間的比較，采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。當(dāng)涉及3組及以上之間的統(tǒng)計(jì)分析時(shí)，則采用單因素方差分析（ANOVA）配合Tukey事后多重比較檢驗(yàn)。P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

4 結(jié)果

4.1 黃芩苷治療骨肉瘤的潛在靶點(diǎn)

在PharmMapper和Swiss Target Prediction數(shù)據(jù)庫中檢索后，確定了202個(gè)黃芩苷潛在作用靶點(diǎn)。同時(shí)，通過Genecards、OMIM和TTD數(shù)據(jù)庫的篩選，發(fā)現(xiàn)了1 258個(gè)與骨肉瘤疾病相關(guān)的潛在靶點(diǎn)。對兩組數(shù)據(jù)進(jìn)行交集分析，揭示了46個(gè)共同靶點(diǎn)（圖1A）。進(jìn)一步整合這些共同靶點(diǎn)信息，繪制了“疾病-靶點(diǎn)-成分”交互網(wǎng)絡(luò)圖（圖1B）。

4.2 黃芩苷治療骨肉核心靶點(diǎn)的篩選

通過STRING數(shù)據(jù)庫檢索黃芩苷治療骨肉瘤的潛在作用數(shù)據(jù)，將數(shù)據(jù)整合并構(gòu)建得到46個(gè)節(jié)點(diǎn)、317個(gè)邊緣和3個(gè)同心圓的PPI網(wǎng)絡(luò)圖（圖2A）。其中，節(jié)點(diǎn)的大小、顏色深淺變化根據(jù)Degree 值大小變化。PPI數(shù)據(jù)進(jìn)行拓?fù)浞治觯Y取Degree值大于平均分（23個(gè)）的基因作為核心靶點(diǎn)（圖2B）。在核心靶基因中，AKT1（36邊）、CASP3（33邊）、EGFR（30邊）、HSP90AA1（30邊）、ESR1（29邊）和TNF（29邊）具有較高的連接節(jié)點(diǎn)度。

4.3 GO和KEGG富集分析

對46個(gè)共同靶點(diǎn)進(jìn)行GO富集分析，得到涉及生物學(xué)過程（biological process，BP）、細(xì)胞組分（cellular component，CC）和分子功能（molecular function，MF）的三大類別信息。GO分析的結(jié)果共富集到1 569條與BP相關(guān)的條目、29條與CC相關(guān)的條目以及109條與MF相關(guān)的過程。結(jié)果根據(jù)P值選取每部分排前10位的條目繪制柱狀圖（圖3A）。KEGG富集分析篩選出111條黃芩苷治療骨肉瘤相關(guān)的潛在通路，選取P值前30的通路繪制KEGG富集的氣泡圖，其中富含與癌癥相關(guān)信號(hào)通路，如PI3K/AKT信號(hào)通路、MAPK信號(hào)通路以及細(xì)胞凋亡等（圖3B）。

4.4 核心靶點(diǎn)與骨肉瘤差異性表達(dá)基因的比對

PPI的核心靶點(diǎn)（23個(gè)）與CEO數(shù)據(jù)庫的骨肉瘤基因進(jìn)行差異性表達(dá)分析。結(jié)果顯示AKT1（P<0.01）、HSP90AA1（P<0.001）、ANXA5（P<0.01）、CHEK1（P<0.05）和PLAU（P<0.05）在骨肉瘤組織中的表達(dá)高于正常骨組織（圖4）。然而，其他核心靶點(diǎn)基因，包括EGFR、CASP3、ESR1、TNF、SRC、PGR、PPARG、AR、IG？鄄F1R、MAPK14、MAPK8、CCNA2、CDK2、KDR、CDK6、IL2、MET和MMP3，在骨肉瘤和正常骨組織之間的表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。

4.5 核心靶點(diǎn)的分子對接分析

骨肉瘤差異表達(dá)的核心靶點(diǎn)AKT1、HSP90AA1、ANXA5、CHEK1和PLAU與黃芩苷進(jìn)行分子對接，通過結(jié)合能和氫鍵相互作用來評價(jià)結(jié)合強(qiáng)度。根據(jù)結(jié)合模式清晰地顯示出黃芩苷結(jié)構(gòu)（圖5A）與靶蛋白活性位點(diǎn)相互作用的氨基酸殘基。結(jié)合情況如下：AKT1（結(jié)合能：-10.94 kcal/mol）活性位點(diǎn)的GLN-79，ASN-54和ARG-273氨基酸與黃芩苷形成氫鍵相互作用（圖5B）；HSP90AA1（結(jié)合能：-9.36 kcal/mol）活性位點(diǎn)的ASN-106、LYS-112、ASN-52和LYS-58氨基酸與黃芩苷形成氫鍵相互作用（圖5C）；ANXA5 （結(jié)合能：-8.62 kcal/mol）活性位點(diǎn)的SER-246、ILE-244、GLN-3和VAL-4氨基酸與黃芩苷形成氫鍵相互作用（圖5D）；CHEK1（結(jié)合能：-9.11 kcal/mol）活性位點(diǎn)的GLU-17、GLU-134、ASN-135、CYS-87和GLU-91氨基酸與黃芩苷形成氫鍵相互作用（圖5E）；PLAU（結(jié)合能：-8.64 kcal/mol）活性位點(diǎn)的ASP-97、HIS-99和SER-195氨基酸與黃芩苷形成氫鍵相互作用（圖5F）。

4.6 黃芩苷對骨肉瘤細(xì)胞增殖及核心靶點(diǎn)AKT1的影響

CCK-8細(xì)胞增殖結(jié)果顯示，在0～80 μmol·L-1的黃芩苷濃度范圍內(nèi)，143B和HOS骨肉瘤細(xì)胞活力均明顯降低（P<0.01）（圖6A）。鑒于黃芩苷與核心靶點(diǎn)AKT1具有很好的結(jié)合活性，并且AKT1在PPI網(wǎng)絡(luò)中的Degree值最高，進(jìn)一步通過Western blot實(shí)驗(yàn)檢測了黃芩苷對骨肉瘤細(xì)胞內(nèi)AKT1蛋白水平變化的影響。與未處理的對照組相比，經(jīng)黃芩苷處理后的143B細(xì)胞中AKT1蛋白的磷酸化水平顯示出濃度依賴性的抑制效果（P<0.01）（圖6B）。

4.7 SP600125增強(qiáng)黃芩苷抑制骨肉瘤細(xì)胞增殖和侵襲以及促進(jìn)凋亡的作用

在研究SP600125單獨(dú)或與黃芩苷聯(lián)合對骨肉瘤細(xì)胞增殖、遷移和凋亡影響的過程中，CCK-8細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果揭示，相較于單獨(dú)使用黃芩苷，其與SP600125的聯(lián)合應(yīng)用能顯著協(xié)同抑制143B和HOS兩種骨肉瘤細(xì)胞系的增殖能力（P<0.05）。相比之下，SP600126僅在40 μmol·L-1濃度下才顯示出對骨肉瘤細(xì)胞的抑制效應(yīng)（P<0.01）（圖7A）。在細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)中，與空白組相比，單獨(dú)應(yīng)用黃芩苷可以增強(qiáng)對細(xì)胞遷移的抑制率（P<0.05）。而當(dāng)SP600125與黃芩苷共處理時(shí)，這種聯(lián)合作用可以進(jìn)一步增強(qiáng)對細(xì)胞遷移能力的抑制效果（P<0.05）（圖7B）。通過Annexin V-FITC/PI雙染法評估細(xì)胞凋亡情況，流式細(xì)胞凋亡結(jié)果顯示，與未處理的空白組相比，單獨(dú)應(yīng)用黃芩苷能增加細(xì)胞的凋亡率（P<0.01）。同時(shí)，SP600125與黃芩苷共處理時(shí)，可進(jìn)一步增強(qiáng)黃芩苷誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡效果（P<0.05）（圖7C）。此外，與空白組相比，黃芩苷組的凋亡相關(guān)Bcl-2蛋白表達(dá)量顯著下降（P<0.01），而Bax蛋白表達(dá)量則顯著增加（P<0.001）。當(dāng)與SP600125聯(lián)合處理時(shí)，相較于單獨(dú)使用黃芩苷組，Bcl-2蛋白的表達(dá)量進(jìn)一步降低（P<0.001），同時(shí)Bax蛋白的表達(dá)量也進(jìn)一步增加（P<0.05）。這一結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證了SP600125和黃芩苷在促進(jìn)細(xì)胞凋亡方面的協(xié)同增效作用（圖7D）。

4.8 SP600125通過抑制AKT通路和調(diào)節(jié)自噬過程增強(qiáng)黃芩苷的抗骨肉瘤作用

KEGG富集分析的結(jié)果揭示了黃芩苷抗骨肉瘤作用與PI3K/AKT和MAPK信號(hào)通路的潛在關(guān)聯(lián)。因此，本研究進(jìn)一步檢測了PI3K/AKT信號(hào)通路中AKT蛋白的表達(dá)變化。結(jié)果顯示，黃芩苷的處理顯著降低p-AKT/AKT的表達(dá)水平（P<0.001），并且聯(lián)合SP600125共處理后，AKT磷酸化水平得到進(jìn)一步抑制（P<0.05）（圖8A）。為了進(jìn)一步探討JNK抑制劑SP600125如何增強(qiáng)黃芩苷誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡效應(yīng)。在處理143B細(xì)胞時(shí)，應(yīng)用了80 μmol·L-1的黃芩苷或與SP600125的聯(lián)合處理。透射電子顯微鏡結(jié)果顯示，經(jīng)黃芩苷處理的骨肉瘤細(xì)胞內(nèi)自噬小體的數(shù)量顯著增加。然而，聯(lián)合SP600125時(shí)，由黃芩苷誘導(dǎo)的自噬小體的增多被明顯減弱（圖8B）。Western

blot結(jié)果顯示，黃芩苷處理組的JNK蛋白被磷酸化激活。此外，自噬相關(guān)蛋白LC3-II與LC3-I的比值以及p62蛋白的表達(dá)均因黃芩苷的處理而顯著增加（P<0.01）。然而，當(dāng)使用SP600125抑制JNK時(shí)，黃芩苷所誘導(dǎo)的143B細(xì)胞中p62和LC3-II表達(dá)的激活被逆轉(zhuǎn)（P<0.05）（圖8C）。

5 討論

本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)共篩出46個(gè)共同靶點(diǎn)，其中，AKT1、CASP3、EGFR、HSP90AA1、ESR1和TNF等23個(gè)核心靶點(diǎn)與黃芩苷治療骨肉瘤的機(jī)制密切相關(guān)。KEGG富集顯示，PI3K-AKT信號(hào)通路、MAPK信號(hào)通路以及細(xì)胞凋亡等參與黃芩苷抗骨肉瘤的機(jī)制。核心靶點(diǎn)AKT1、HSP90AA1、ANXA5、CHEK1和PLAU在骨肉瘤組織中的表達(dá)顯著高于正常骨組織。分子對接顯示，黃芩苷與這些靶點(diǎn)都有較強(qiáng)的結(jié)合潛力。其中，AKT1與黃芩苷的結(jié)合具有很高的適配性，且在PPI網(wǎng)絡(luò)中占據(jù)核心位置。另外，Western

blot結(jié)果顯示，黃芩苷能降低143B細(xì)胞內(nèi)AKT1蛋白的磷酸化水平，這為AKT1作為核心靶點(diǎn)提供了初步的驗(yàn)證。

骨肉瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移與預(yù)后不佳密切相關(guān)，是導(dǎo)致擴(kuò)散、耐藥及病情惡化的病理基礎(chǔ)[13]。細(xì)胞凋亡機(jī)制是細(xì)胞受到特定信號(hào)的刺激，發(fā)生自主程序性細(xì)胞死亡，涉及染色質(zhì)固縮、DNA斷裂和凋亡小體形成的過程[14]。Bax與Bcl-2之間的比例變化能夠影響線粒體膜電位，進(jìn)而觸發(fā)細(xì)胞色素C的釋放，從而誘導(dǎo)Caspase系列反應(yīng)，最終引發(fā)細(xì)胞凋亡[15]。目前，SP600125能協(xié)同增強(qiáng)抗腫瘤藥物的治療效果已在多種癌癥模型中得到證實(shí)，與其他抗腫瘤藥物聯(lián)合使用來減弱腫瘤的耐藥性[16]。本研究通過CCK-8測定和細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)揭示，黃芩苷顯著抑制骨肉瘤細(xì)胞的增殖和遷移能力。流式細(xì)胞凋亡檢測和Western

bolt揭示了黃芩苷能明顯誘導(dǎo)的骨肉瘤細(xì)胞的凋亡比例增高。此外，當(dāng)SP600125與黃芩苷聯(lián)合應(yīng)用時(shí)，結(jié)果顯示出SP600125能夠協(xié)同增強(qiáng)黃芩苷抑制骨肉瘤細(xì)胞增殖和遷移的效果，并促進(jìn)細(xì)胞凋亡。相比之下，單獨(dú)使用JNK抑制劑SP600125對骨肉瘤細(xì)胞的影響卻十分有限。

PI3K/AKT通路在骨肉瘤中被固定激活，并參與調(diào)控骨肉瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移、凋亡和自噬等過程[17]。此外，抑制該通路及其相關(guān)上下游分子的活性已成為骨肉瘤治療的重要策略[18]。JNK是調(diào)控癌細(xì)胞凋亡和自噬的重要介質(zhì)，它的激活在骨肉瘤細(xì)胞的生長、侵襲、凋亡和自噬等機(jī)制發(fā)揮重要作用[19-20]。研究表明，這兩種信號(hào)通路存在相互干擾的現(xiàn)象，并組成一個(gè)復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)[21]。有研究發(fā)現(xiàn)，SP600125通過增強(qiáng)柴胡皂苷D對AKT通路的阻斷作用，抑制骨肉瘤細(xì)胞的惡性特性，并激活Caspase-3、Caspase-8和Caspase-9依賴的細(xì)胞凋亡[22]。自噬的激活通常與骨肉瘤細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移、凋亡、化療耐藥和免疫治療有關(guān)[23]。自噬與凋亡之間的相互作用構(gòu)成了一個(gè)復(fù)雜且精確的平衡系統(tǒng)，其中一種過程的激活或抑制可以顯著影響另一種過程的活性。此相互作用涉及眾多信號(hào)通路及調(diào)節(jié)蛋白，包括Caspase-8、P53、Bcl-2和JNK等[24]。在自噬過程中，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)LC3被水解成LC3-Ⅰ，與磷脂酰乙醇胺結(jié)合形成LC3-Ⅱ連接于自噬小體膜中[25]。此外，p62的表達(dá)與腫瘤形成、癌癥促進(jìn)和化療耐藥有關(guān)，是自噬的適配體[26]的LC3-Ⅱ和p62-Nrf2表達(dá)，活化凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)，觸發(fā)自噬向凋亡的轉(zhuǎn)換，增強(qiáng)C-2抗膀胱癌的敏感性[27]。此外，SP600125通過抑制JNK調(diào)控的自噬增強(qiáng)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞對mTORC1/2抑制劑的敏感性[28]。同時(shí)，在另一項(xiàng)研究中發(fā)現(xiàn)p62被pKAL以ROS依賴的方式顯著上調(diào)，而SP600125抑制JNK介導(dǎo)p62的下調(diào)增強(qiáng)pKAL誘導(dǎo)的結(jié)直腸癌細(xì)胞凋亡[29]。本研究結(jié)果顯示，黃芩苷和SP600125的聯(lián)合應(yīng)用能夠有效抑制AKT的磷酸化，表明AKT通路參與其抗骨肉瘤的作用機(jī)制。透射電子顯微鏡觀察顯示，黃芩苷的處理能顯著增加骨肉瘤細(xì)胞中自噬小體的數(shù)量。然而，當(dāng)聯(lián)用SP600125時(shí)，黃芩苷所誘導(dǎo)的自噬小體的增加受到抑制。另外，黃芩苷能增加自噬相關(guān)蛋白LC3-Ⅱ和p62的表達(dá)水平，以及促進(jìn)JNK的磷酸化，而這種現(xiàn)象被JNK抑制劑SP600125所逆轉(zhuǎn)。此外，SP600125的共處理增強(qiáng)了黃芩苷所誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡效應(yīng)，這表明SP600125通過調(diào)節(jié)自噬過程，與黃芩苷協(xié)同發(fā)揮抗骨肉瘤的治療效能。

綜上所述，本研究運(yùn)用了網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對接系統(tǒng)性分析黃芩苷抗骨肉瘤的潛在分子靶點(diǎn)和通路機(jī)制。在體外實(shí)驗(yàn)中，黃芩苷顯著地抑制了骨肉瘤細(xì)胞的增殖與遷移，并有效地誘導(dǎo)骨肉瘤細(xì)胞凋亡。當(dāng)與JNK抑制劑SP600125聯(lián)合使用時(shí)，這一組合療法通過降低AKT的磷酸化水平和調(diào)節(jié)自噬過程，進(jìn)一步強(qiáng)化了對骨肉瘤治療的協(xié)同效應(yīng)。黃芩苷展現(xiàn)出針對多個(gè)靶點(diǎn)及其相應(yīng)信號(hào)通路的顯著作用，顯示了其作為一種新型抗骨肉瘤藥物的潛力。特別是與SP600125聯(lián)合使用的策略，這為骨肉瘤的治療提供了新的方向。

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