表面增強拉曼光譜結合化學計量學用于生鮮山藥中尿囊素含量的快速檢測

摘要 尿囊素作為山藥的功能性成分，在醫學及化妝品領域有重要的作用。本研究基于實驗室自行搭建的拉曼光譜檢測系統，以生鮮鐵棍山藥為研究對象，分析了尿囊素標準品粉末的拉曼光譜以及生鮮山藥的尿囊素提取液的表面增強拉曼光譜，確定了生鮮山藥中尿囊素的表面增強拉曼特征峰為644、1027 和1398 cm?1。探究了生鮮山藥中尿囊素和銀溶膠吸附時間以及山藥厚度對拉曼特征峰強度的影響，建立了直接獲取生鮮山藥中尿囊素表面增強拉曼特征信息的方法。基于本方法采集32 個生鮮山藥的表面增強拉曼光譜，建立了644、1027 和1398 cm?1 處尿囊素拉曼特征峰一元線性回歸（Unary linear regression， ULR）預測模型、多元線性回歸（Multivariable linear regression， MLR）預測模型以及全波段光譜偏最小二乘回歸（Partialleast squares regression， PLSR）預測模型。結果表明，多元線性回歸模型效果最佳，其驗證集決定系數（R2V）為0.93，均方根誤差（RMSEV）為0.35 mg/g。但是，尿囊素特征峰易受溶液極性和基底變化的影響，其特征峰會發生一定偏移，影響檢測精度，而利用全波段拉曼光譜建立PLSR 定量預測模型可提升模型的魯棒性。基于隨機蛙跳（Random frog， RF）算法篩選特征變量建立了尿囊素的RF-PLSR 定量預測模型， R2V 提升為0.96，RMSEV 降低至0.26 mg/g。采用未參與建模的10 個生鮮山藥樣本對此模型進行外部驗證，最大殘差絕對值為0.74 mg/g。研究結果表明，本方法可以實現生鮮山藥中尿囊素含量的快速定量檢測。

關鍵詞 山藥；尿囊素；表面增強拉曼光譜；預測模型

山藥是薯蕷科植物的干燥塊莖，具有藥食兩用的功能，富含尿囊素、多糖和蛋白質等多種活性成分。尿囊素作為山藥塊莖中的重要活性物質，具有抗氧化和促進細胞生長等作用，廣泛應用于醫學、化妝品和農業等領域[1]。尿囊素可用于治療糖尿病、骨髓炎、肝硬化及癌癥，作為山藥功能性成分，其含量在山藥品質評價中占據重要地位[2-4]。因此，建立一種山藥中尿囊素含量的快速定量檢測方法非常重要。

相比于蛋白質和淀粉等山藥的主要成分，尿囊素含量相對較少。目前，山藥中尿囊素含量的檢測方法主要有高效液相色譜（HPLC）法[5-6]和毛細管電泳法[7]等。研究人員針對HPLC 法進行了精度和流程優化[8-9]，在檢測范圍內，含量與峰值面積的線性關系的相關系數可達到0.99 以上。此類傳統檢測方法精度高，但耗費大量的人力和物力，不適合推廣應用于山藥加工產業。目前，很多研究者基于近紅外光譜開展了山藥及其產品的產地鑒別及總糖、多糖等含量檢測，精度約為90%[10-14]。近紅外光譜主要針對山藥中蛋白質和總糖等主要成分進行檢測，對于尿囊素等含量較低的成分檢測效果并不理想。因此，亟需建立一種尿囊素的快速檢測方法。表面增強拉曼光譜（Surface-enhanced Raman spectroscopy， SERS）因具有簡單、快速和高靈敏等特點，在食品質量安全方面尤其是抗生素等微量成分的檢測方面表現出極大的優勢和潛力。Liao 等[15]采用傅里葉變換（FT）-拉曼光譜對32 種常用山藥蛋白的分子結構進行了研究分析，還有研究者基于拉曼光譜[16-18]對山藥產地進行了鑒別，但尚未見對生鮮山藥中尿囊素快速檢測的報道。

本研究采用實驗室自行研制的表面增強拉曼光譜采集系統，以生鮮鐵棍山藥為研究對象，分析其中尿囊素的SERS 光譜特征峰，建立了生鮮山藥中尿囊素特征信息的快速獲取方法，以及生鮮山藥中尿囊素含量定量預測模型和檢測方法，為山藥中尿囊素的直接快速定量檢測提供了新思路和技術參考。

1 實驗部分

1.1 儀器、試劑與材料

表面增強拉曼光譜采集系統[19]如圖1 所示，包括10785MM0350MS 激光器（美國Innovative PhotonicSolutions 公司）、RPB 拉曼探頭（美國InPhotonics 公司）、Raman Explorer 785 光譜儀（美國HeadwallPhotonics 公司）和DU920PBR-DD 高性能CCD 相機（英國Andor Technology 公司）；TDZ5-WS 低速臺式離心機（湖南赫西儀器裝備有限公司）；高效液相色譜儀（美國Agilent 公司）；超聲波清洗器（上海科導超聲儀器有限公司）；高速粉碎機（天津市泰斯特儀器有限公司）。

檸檬酸鈉（分析純，北京化工廠）；AgNO3（≥99%，國藥集團化學試劑有限公司）；尿囊素標準品（≥98%，北京譜析標準技術有限公司）。微孔濾膜（0.22 μm，天津津騰實驗設備有限公司）。

山藥樣本為鐵棍山藥，購于北京某超市，洗凈擦干后置于室溫中，以消除溫度對實驗結果的影響。

1.2 實驗方法

1.2.1 表面增強劑銀溶膠的制備

采用文獻[20]的方法，以檸檬酸鈉還原AgNO3 法制備銀溶膠。將400 mL 1.0 mmol/L 的AgNO3 溶液加熱至沸騰，在1000 r/min 的轉速下攪拌，并滴加10 mL 1%檸檬酸鈉溶液，控制全部檸檬酸鈉溶液的滴加時間為3 min，以確保銀溶膠制備程序的一致性。在持續加熱下反應1 h 后，將溶液自然冷卻至室溫，以3000 r/min 離心30 min，棄上清液，收集濃縮20 倍的銀溶膠置于玻璃瓶中，在4 ℃下避光保存，備用。

1.2.2 生鮮山藥中尿囊素的提取及標準理化值的測定

分別截取用于采集拉曼光譜的山藥樣本兩側塊莖（15 mm，如圖2 所示），采用粉碎機進行粉碎后，研磨成均勻的漿糊。稱取0.8 g 樣品于50 mL 離心管中，加入20%乙醇40 mL，渦旋1 min，再超聲提取1 h，每隔10 min 更換一次水，防止水溫過高。在100 r/min 下振蕩提取8 h 后，再渦旋1 min， 5000 r/min 離心10 min，收集上清液，用20%乙醇稀釋5 倍，作為尿囊素提取液。

以生鮮山藥中提取的尿囊素提取液為研究對象，基于QB/T 5095—2017[21]方法對生鮮山藥中的尿囊素含量進行測定。

1.2.3 尿囊素標準品及其水溶液的SERS 光譜檢測

基于實驗室自行研制的表面增強拉曼光譜采集系統進行拉曼光譜采集，拉曼光譜系統激光波長為785 nm、激光功率為150 mW、積分時間為1 s，利用MATLAB R2016b 附帶的PLS Toolbox 數據庫對所獲光譜曲線數據進行平滑降噪（Savitsky-Golay， Filter width 5， Polynomial order 1）和特征峰值提取，并利用Origin 2022 軟件繪制標準曲線。

1.3 拉曼光譜預處理方法

為消除暗電流造成的激光斑點大小、激光功率波動及光程變化等物理因素對拉曼光譜產生隨機噪聲干擾，所有光譜均經過SG（Savitzky-golay）平滑和多元散射校正（Multiplicative scatter correction， MSC）預處理。利用非對稱最小二乘（Asymmetric least squares， ALS）[22]進行基線擬合和背景消除，進一步表征目標物的拉曼光譜。

2 結果與討論

2.1 尿囊素拉曼特征峰的確定

利用實驗室自行搭建的拉曼光譜采集系統采集尿囊素標準品的拉曼光譜，經ALS扣除背景后的尿囊素標準品的拉曼光譜如圖3A 所示。尿囊素標準品具有豐富的拉曼特征峰信息，特別是在320、658、877、1019、1389和1769 cm–1 處出現了較強的拉曼特征峰，其中， 320 cm–1 處的特征峰為N—H的搖擺振動峰[23]，877 cm–1 處的特征峰是N—C 的拉伸振動峰， 1769 cm–1 處的特征峰是C=O的拉伸振動峰， 1019 cm–1 處的特征峰是由N—H鍵面拉伸振動產生， 658和1389 cm–1 處的特征峰均為N—C鍵的拉伸振動峰。

采集的不同濃度的尿囊素標準品水溶液的SERS 光譜以及生鮮山藥尿囊素提取液的SERS 光譜如圖3B 所示。3 個不同濃度梯度的尿囊素標準品溶液的SERS 光譜均在664、1027 和1398 cm–1 處出現了顯著的拉曼特征峰。隨著尿囊素濃度增加，這3 處的拉曼特征強度逐漸增大，但是與尿囊素標準品在658、1019 和1389 cm–1 處的特征峰相比，表面增強后特征峰發生了偏移。這是因為尿囊素分子依靠靜電吸附至銀納米粒子的電負性表面，拉曼信號增強；同時，尿囊素分子吸附至銀納米粒子表面后，電子密度分配發生了扭曲，改變了分子鍵的極化率，導致光譜中的波段發生偏移[24]。生鮮山藥尿囊素提取液的SERS 光譜同樣在664、1027 和1398 cm–1 處出現了較強的拉曼特征峰。綜上，確認上述3 處特征峰為生鮮山藥中尿囊素的SERS 特征峰。

2.2 生鮮山藥中尿囊素特征信息直接獲取方法

切取厚度為5 mm 的山藥樣品置于鋁箔紙上，利用自行搭建的拉曼光譜采集系統采集山藥斷面的拉曼光譜。如圖4 中譜線c 所示，直接采集的山藥斷面拉曼光譜未出現任何拉曼信號，但滴加1 μL 銀溶膠表面增強劑后，采集的山藥SERS 光譜在664、1027 和1398 cm–1 處均出現了明顯的尿囊素特征峰，與尿囊素標準品溶液的SERS 特征峰完全相符，如圖4 中譜線a 和譜線b 所示。這說明基于SERS 光譜可以直接快速獲取山藥中尿囊素的特征信息，為建立山藥中尿囊素的快速檢測方法奠定了基礎。

采集SERS 光譜時，滴加表面增強劑后，尿囊素可依靠靜電作用吸附至電負性的銀納米粒子的表面，使拉曼信號增強。表面增強劑與樣品的作用時間直接影響尿囊素的特征信號。為確定尿囊素與銀溶膠的最佳吸附時間，對同一個山藥樣本滴加銀溶膠后，每隔5 s 采集一次光譜，連續采集5 次。如圖5 所示，隨著吸附時間延長，拉曼特征峰強度逐漸增大，當吸附時間為10 s 時，拉曼特征峰強度達到最高；當吸附時間為15 s 時，拉曼特征峰強度變小。這是因為銀溶膠在空氣中暴露時間過長，內部結構發生變化，導致吸附能力逐漸下降[19]。因此，本研究中選擇尿囊素與銀溶膠的最佳吸附時間為10 s。

采集山藥SERS 光譜時，滴加的表面增強劑銀溶膠會逐漸滲透至山藥內部。為探討山藥厚度與SERS 信號強度之間的關系，將同一個山藥樣品分別切取厚度為10、8、6、4、2 和1 mm 的薄片置于鋁箔紙上，分別滴加1 μL 銀溶膠后，采集山藥的SERS 光譜。如圖6 所示，隨著山藥厚度增加，拉曼信號強度逐漸減弱。這可能是因為山藥樣本較厚時滴加的銀溶膠直接滲透至山藥內部，采集部位的尿囊素無法充分地吸附至銀納米粒子表面；但是當生鮮山藥樣本較薄時，山藥下方的鋁箔紙使山藥中尿囊素與銀納米粒子充分接觸，達到較好的增強效果。綜合考慮，本研究選擇光譜采集用的山藥樣本厚度為2 mm。

2.3 生鮮山藥中尿囊素的SERS 特征信息穩定性分析

切取10 個厚度為6 mm 的生鮮山藥樣本，分別將每個樣本均勻切分為厚度為2 mm 的3 段，每個樣本分別采集3 個位點的SERS 光譜（圖7），并分析每個樣本在664、1027 和1398 cm–1 處尿囊素特征峰強度的相對標準偏差（RSD）。如圖8 所示，在664 cm–1 處， 10 個樣本的尿囊素特征峰強度的RSD 為1.66%～7.20%，平均值為4.56%；1027 cm– 1 處尿囊素特征峰強度的RSD 為2.78%～7.56%，平均值為5.42%；1398 cm–1 處尿囊素特征峰強度的RSD 為1.35%～7.17%，平均值為4.18%。以上結果說明，直接獲取生鮮山藥中尿囊素SERS 特征信息的方法穩定性良好。

2.4 生鮮山藥中尿囊素含量的預測模型的建立

基于實驗室自行搭建的SERS 光譜采集系統采集生鮮山藥中尿囊素的拉曼光譜。共切取32 個厚度為2 mm 的山藥樣品，將樣本置于鋁箔紙上，滴加1 μL 銀溶膠，吸附10 s 后，分別采集四周與中心共5 個位點的拉曼光譜，取平均值作為每個樣本的原始SERS 光譜。

生鮮山藥的原始SERS 光譜如圖9 所示。生鮮山藥中存在大量的淀粉和多糖，除了位于664、1027 和1398 cm–1 處的尿囊素特征峰外，還有許多代表其它物質的拉曼特征峰，如500 cm–1 附近淀粉以及多糖的特征峰[25]。

基于KS（Kennard-stone）算法，以3∶1 的比例劃分校正集與驗證集，分別建立了664、1027 和1398 cm–1 處ULR、MLR 和全光譜的PLSR 尿囊素預測模型，結果如表1 所示。664、1027 和1398 cm–1處尿囊素的拉曼特征峰值均與濃度具有較高的相關性，基于尿囊素這3 處特征峰強度建立的MLR 預測模型的預測結果最佳，其驗證集決定系數（R2V）為0.93，均方根誤差（RMSEV）為0.35 mg/g。但是，尿囊素特征峰受溶液極性和基底的影響較大，其拉曼特征峰容易偏移，因此，利用特征峰建立模型難以保證模型的魯棒性，而利用全波段光譜的PLSR 定量預測模型可以避免這種情況，但包含許多其它無關變量。利用全光譜信息的PLSR 定量預測模型的R2V 為0.91， RMSEV 為0.38 mg/g。

為去除山藥全波段拉曼特征光譜中與尿囊素分子結構無關的其它變量并進一步簡化提升全波段光譜預測模型效果，利用隨機蛙跳（Random frog， RF）算法篩選全光譜信息中尿囊素的特征變量，根據RMSEV 最小原則，最終確定尿囊素特征變量數為12 個，特征變量選擇過程如圖10 所示。

如圖11 所示，基于RF 算法篩選的特征變量主要集中在664、1027 和1398 cm–1 處尿囊素特征峰附近。此外， 478 和770 cm–1 處一些強度較弱的信號變化也得到識別，可能是因為一些校正后的光譜基線的變化能夠間接反映分析物的濃度變化。

基于RF 算法篩選的特征變量建立的生鮮山藥中尿囊素的PLSR 定量預測模型結果如圖12 所示。經變量篩選算法消除大量無關信息后，所建立的模型的R2V 提高到0.96， RMSEV 降低至0.26 mg/g。

2.5 生鮮山藥中尿囊素含量快速檢測系統外部驗證

選取10 個未參與建模的生鮮山藥樣品對RF-PLSR 定量預測模型進行外部驗證。生鮮山藥中尿囊素含量的模型預測值與標準理化值的對比結果見表2，樣品殘差絕對值范圍為0.05～0.74 mg/g（圖13）。上述結果表明，利用生鮮山藥的SERS 光譜結合RF-PLSR 可以實現生鮮山藥中尿囊素含量的快速檢測。

3 結論

本研究以生鮮鐵棍山藥為研究對象，利用實驗室自行研制的表面增強拉曼光譜采集系統建立了生鮮山藥中尿囊素特征信息的直接快速獲取方法，以及生鮮山藥中尿囊素含量定量預測模型，實現了生鮮山藥中尿囊素含量的快速定量檢測。首先，基于實驗室自行搭建的拉曼光譜檢測系統分析了尿囊素標準品粉末的拉曼光譜以及不同濃度尿囊素標準品水溶液和生鮮山藥中尿囊素提取液的SERS 光譜，確定了生鮮山藥中尿囊素的SERS 光譜特征峰。其次，探討了生鮮山藥中尿囊素和銀溶膠吸附時間以及山藥厚度等對拉曼光譜特征峰強度的影響，確定了生鮮山藥中直接獲取尿囊素SERS 光譜特征信息的方法，尿囊素拉曼光譜在664、1027 和1398 cm–1 處的特征峰強度的平均RSD 分別為4.56%、5.42%和4.18%。基于本研究采集的32 個生鮮山藥的SERS 光譜，建立了尿囊素的RF-PLSR 定量預測模型，其R2V 為0.96，RMSEV 為0.26 mg/g。采用未參與建模的10 個生鮮山藥樣本對此模型進行外部驗證，最大殘差絕對值為0.74 mg/g。本方法操作簡單、檢測快速，為農產品中尿囊素的直接快速定量檢測提供了新的思路和技術參考。

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