基于立足點介導的熵驅動雙足DNA 步行器及樹枝狀雜交鏈式反應的一步式循環腫瘤DNA 微流控傳感研究

摘要 血液中低豐度的循環腫瘤DNA（ctDNA）是一類關鍵癌癥標志物，實現ctDNA 的精準檢測對于疾病的早期診斷、監測及預后評估均具有重要意義。本研究設計了一種基于微流控芯片的熵驅動雙足DNA 步行器與樹枝狀雜交鏈式反應相結合的級聯信號放大策略，用于檢測血液中的ctDNA。當靶標存在時，立足點A與靶標相互作用，借助燃料鏈F 觸發雙向鏈置換反應，從而釋放靶標及8-17 DNAzyme 活性中心。其中，釋放的靶標進入新一輪熵驅動鏈置換反應；同時， Pb2+激活的8-17 DNAzyme 活性中心將作用于微珠表面的切割位點，暴露出微珠表面的捕獲探針，進而誘導樹枝狀雜交鏈式反應，使熒光信號富集于微珠表面。以乳腺癌突變基因PIK3CAE545K 為靶標模型，在最優實驗條件下，此傳感器的線性范圍為50～10000 fmol/L，檢出限（LOD， 3σ）為0.94 fmol/L，回歸方程為y=31.6539 lgCT+474.0801（CT 為突變基因PIK3CAE545K 濃度， fmol/L）。將此方法應用于人血清中突變基因PIK3CAE545K 含量的檢測，加標回收率在98.8%～106.5%之間。本方法靈敏度高、特異性強、抗干擾能力強，并具有高通量和一步式操作的特點，在復雜樣品的快速分析中具有良好的應用潛力。

關鍵詞 DNA 步行器；熵驅動鏈置換反應；微流控芯片；8-17 DNAzyme；樹枝狀雜交鏈式反應

癌癥每年導致超過820 萬人死亡[1]，其中，乳腺癌是女性癌癥死亡的主要原因[2]，對女性健康構成嚴重威脅。早期診斷和治療是降低癌癥死亡率的關鍵因素，而高靈敏性、高特異性且便捷的檢測方法是其中的關鍵[3-6]。循環腫瘤DNA（Circulating tumor DNA， ctDNA）是由腫瘤細胞釋放到外周血中的DNA片段[7-9]，可作為癌癥相關生物標志物，例如乳腺癌突變基因PIK3CAE545K（Mutation1633 Ggt;A）是攜帶腫瘤特異性基因突變的ctDNA 片段[10-11]。近年來，基因測序[12]和聚合酶鏈式反應（Polymerase chain reaction，PCR）[13]被用于檢測ctDNA，但其操作流程復雜，并且儀器設備昂貴[14-15]。因此，開發高靈敏度、高特異性且簡單、快速的ctDNA 檢測方法對癌癥的精準診斷和有效治療至關重要。

等溫信號放大技術相比于熱循環擴增具有設計簡單且無需專用設備的優勢，如3D DNA 步行器[16]、鏈置換反應（Strand replacement reaction， SDR）[17]、雜交鏈式反應（Hybridization strand reaction， HCR）[18]和支鏈雜交鏈式反應[19]等。立足點（Toehold）介導的鏈置換反應[20]是由Toehold 結構域開始的鏈置換反應，基于Watson-Crick 堿基互補配對原則和熵驅動反應的雙重條件使其具有高特異性。然而，鏈置換反應的檢測靈敏度有限，因此，研究者提出結合多種等溫信號擴增技術，以提高檢測靈敏度。3D DNA 步行器[16，21]是一種受化學能（如鏈置換和酶切反應）驅動、能沿著特定軌跡移動的納米機器，可通過提高反應物的局部濃度，縮短反應時間，提高靈敏度。Yuan 等[22]提出了一種鏈置換反應結合蛋白酶驅動的3D DNA 步行器，用于檢測病毒DNA，雖然該方法可有效提高檢測靈敏度，但其依賴于蛋白酶切割，易受復雜實驗條件（如緩沖液和溫度）的影響。8-17 DNAzyme 是一種具有催化活性的DNA 序列[23-25]，克服了蛋白酶的一些局限性。盡管如此，多種等溫擴增技術的操作仍然繁瑣，限制了其實際應用。

微流控芯片技術以其便攜性和高度集成的特性，為血液中低豐度ctDNA 的檢測提供了新思路[26]。該技術同時具有高通量平行分析能力和高效物質傳輸效率，可提高檢測靈敏度[27-29]。Peng 等[30]設計了一種基于功能化微珠的多通道微芯片，僅需30 min 即可同時檢測人類、兔、雞和鼠的免疫球蛋白G，展現出微流控芯片快速檢測、高靈敏度以及操作簡便的顯著優勢。

本研究設計了一種三通道平行的微流控微珠陣列芯片，并構建了一步式立足點介導的熵驅動雙足3D DNA 步行器，用于ctDNA 的高靈敏度檢測。以靶標和8-17 DNAzyme 為3D DNA 步行器的雙足，通過多種DNA 納米技術實現級聯信號放大；以乳腺癌突變基因PIK3CAE545K 為靶標，驗證了一步式微流控微珠陣列芯片生物傳感器的性能。本方法具有高靈敏度、高特異性和高效、便捷等優點，可用于乳腺癌突變基因PIK3CAE545K 的高靈敏的檢測，為癌癥的早期篩查提供參考和技術支持。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

IX73 倒置熒光顯微鏡（日本Olympus 公司）；ChemiDoc XRS+電泳儀（美國Bio-Rad 公司）；KVB-30D紫外曝光機（中國臺灣金電子股份有限公司）。

乙二胺四乙酸二鈉（EDTA?2Na）、30%聚丙烯酰胺（29∶1）、四甲基乙二胺（TEMED）、牛血清白蛋白（BSA）、6 × Loading 緩沖溶液和25 bp DNA Marker（上海生物工程（上海）股份有限公司）；三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽（Tris-HCl）和PbCl2（國藥集團化學試劑有限公司）；4-羥乙基哌嗪乙磺酸（HEPES，上海麥克林生化科技股份有限公司）；15 μm 聚苯乙烯微珠（蘇州知益微珠科技有限公司）；聚二甲基硅氧烷（PDMS）和固化劑（Dow Corning 公司）；人血清（上海金馬生物技術有限公司）。

HPLC 純化的寡核苷酸序列購于上海生物工程（上海）股份有限公司，序列見表1。

1.2 實驗方法

1.2.1 序列設計及探針預處理

DNA 探針凍干粉用TE 緩沖溶液（10 mmol/L Tris-HCl， 0.1 mmol/L EDTA， pH 8.0）溶解，濃度為100 μmol/L，于?20 ℃儲存。使用HEPES 緩沖溶液（25 mmol/L HEPES， 50 mmol/L NaCl， 20 mmol/LMgCl2， pH 7.4）將Biotin-C1、C2 和C3 稀釋至10 μmol/L， SH 底物探針稀釋至5 μmol/L， H1-TMR、H2 和H3 探針稀釋至5 μmol/L，燃料鏈（F）稀釋至200 nmol/L，均于?20 ℃儲存。

復合鏈S 的構建：將3 μL Bio-C1（10 μmol/L）、3 μL C3（10 μmol/L）、6 μL C2（10 μmol/L）和8 μLHEPES 緩沖溶液混合，總體積為20 μL，于95 ℃孵育5 min 后，以0.1 ℃/s 的速度緩慢冷卻至室溫，形成復合鏈S（Bio-C1/C2/C3）。

發夾結構的形成：將含SH（5 μmol/L）、H1-TMR（5 μmol/L）、H2（5 μmol/L）和H3（5 μmol/L）探針的HEPES 緩沖溶液在95 ℃下孵育5 min，并以0.1 ℃/s 的速度緩慢冷卻至室溫，形成發夾結構。

1.2.2 微流控芯片的陽模板制備

按照微流控芯片結構圖，采用菲林打印制備光掩膜，將其覆蓋在PCB 板上并紫外曝光110 s，隨后采用100 mL 顯影液進行顯像6 min。用水沖洗后，避光放入200 mL 刻蝕液（FeCl3·6H2O-水， 1∶2， m/V）中，靜置10～45 min，刻蝕10～30 μm 的深度，最后采用丙酮清除光刻膠，制得芯片陽模板。

1.2.3 微流控微珠陣列芯片的裝配及微通道處理

將PDMS 與固化劑按質量比10∶1 混勻，靜置20 min，平鋪于陽模板上（約1 mm 厚），在70 ℃烘箱中固化40 min后從陽模板上剝離下來，進行沖壓打孔，支撐進樣口/出樣口。將基片a （Slip a）與基片b （Slip b）的通道面貼合，組裝成微流控芯片。用5 μL 1% 的BSA 對通道內壁進行改性，減少非特異性吸附。最后將功能化的微珠流入微室中，得到微流控微珠陣列芯片。

1.2.4 微珠的表面功能化

取100 μL 聚苯乙烯微珠，用100 μL Binding 緩沖溶液（20 mmol/L Tris-HCl， pH 7.5， 1 mol/L NaCl，1 mmol/L EDTA， 0.0005% Triton X-100， pH=7.4）洗滌3 次（3500 r/min， 5 min），棄去上清液，然后以摩爾比為1∶20 的比例加入復合鏈S 與SH 底物發夾混合（4 μL S （1.5 μmol/L）、24 μL SH （5 μmol/L）和22 μLHEPES 緩沖溶液，總體積為50 μL），室溫下反應1 h。隨后用HEPES 緩沖溶液洗滌3 次，并在HEPES 緩沖溶液中于4 ℃儲存。

1.2.5 一步式微流控芯片檢測突變基因PIK3CAE545K

將功能化微珠稀釋10 倍后注入微室中。將4 μL F（200 nmol/L）、2 μL Pb2+ （2 mmol/L）、18 μL H1-TMR （25 nmol/L）、6 μL H2 （25 nmol/L）、6 μL H3 （25 nmol/L）和4 μL HEPES 緩沖溶液混勻，總體積為40 μL。取4 μL 上述溶液和2 μL Target 混勻后滴加于微流控微珠陣列芯片的進樣口，在液壓驅動下，溶液流通至微室中，在30 ℃下恒溫反應3 h。反應完成后，用5 μL HEPES 緩沖溶液洗滌通道。最后，采用熒光倒置顯微鏡在549 nm 的激發波長下進行熒光成像。

2 結果與討論

2.1 實驗原理

微流控芯片由兩層PDMS 基片組成，可平行檢測3 份樣品，如圖1A 所示。其中，上層基片a（Slip a）設有進樣口和出樣口，微室尺寸為120 μm×120 μm×10 μm；底層基片b（Slip b）僅設有進樣通道和微室，無出樣通道，尺寸為100 μm×100 μm×15 μm。直徑為15 μm 的微珠在重力與毛細作用的驅動下進入微室中，微珠利用深度差被固定于微室中，以提高反應溶液與微珠表面的接觸效率。

如圖1B 所示，功能化微珠由復合鏈S 和底物發夾SH 構成。復合鏈S 由Bio-C1/C2/C3 組成，其中，C3 鏈5′端的Toehold A 用于特異性識別靶標；Bio-C1 鏈構成的DNA 步行器含有封閉的8-17 DNAzyme活性中心。功能化微珠注入微室后，形成微流控微珠陣列芯片。當靶標存在時， Toehold A 與靶標結合使C2 鏈解離，暴露出Toehold B。Toehold B 與燃料鏈F 相結合，觸發雙向鏈置換反應，釋放靶標且顯露出Bio-C1 鏈中的8-17 DNAzyme 催化活性中心。靶標作為DNA 步行器的“一條腿”在微珠之間行走，啟動新一輪鏈置換反應。Pb2+激活8-17 DNAzyeme， Bio-C1 作為DNA 步行器的“另一條腿”沿著三維軌道催化裂解SH，使捕獲探針顯露于微珠表面，啟動H1-TMR、H2 和H3 進行樹枝狀的雜交鏈式反應（Dendritichybridization chain reaction， D-HCR）。值得注意的是，發夾H1 的3′端標記有四甲基羅丹明分子，捕獲探針（a）與H1 的5′端結合，暴露發夾序列（c、b*），并進一步與H2 發夾的雜交鏈式反應；被觸發的H2 發夾（b*、a*）與新的H1 發夾進行雜交，而H2 的5′端序列（d、e）與H3 的3′端序列（d*、e*）相互作用，完成D-HCR 過程，隨著D-HCR 的發生，微珠表面的熒光信號增強。

2.2 可行性分析

為驗證微流控微珠陣列芯片構建的有效性，對其進行流通性測試。圖2A為顯微鏡下的Slip a和Slip b的結構，以及兩層基片貼合后的完整芯片。圖2B 為功能化微珠在重力和毛細作用下引入微室中的過程，證實了微珠通過深度差可固定于微室內。采用黑色墨水驗證了3 個通道的流通性（圖2C）。圖2D 為構建的微流控微珠陣列檢測平臺實物圖。

通過12%聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）分別對鏈置換反應與樹枝狀雜交鏈式反應的可行性進行分析，各組分終濃度均為1 μmol/L。如圖3A 泳道7 所示，進行鏈置換反應后， S 亮帶減弱， Fuel/C3 亮帶明顯變亮，表明鏈置換反應已完成。樹枝狀雜交鏈式反應電泳表征如圖3B 所示，泳道4、5 和6 的結果顯示各發夾處于亞穩態結構，無引發序列時，無法自組裝成納米聚合物；泳道7 為捕獲探針P/H1/H2 在30 ℃下反應3 h 發生雜交鏈式反應，泳道8 為P/H1/H2/H3 在相同條件下進行D-HCR，泳道8 亮帶分子量顯著大于泳道7，證明樹枝狀雜交鏈式反應比雜交鏈式反應形成的納米聚合物分子更大。

通過去除關鍵影響因素的方式進行可行性分析，設計了4 組實驗，分別為不加PbCl2、不加燃料鏈F、不加靶標探針以及完整實驗組，未加變量均以等體積緩沖溶液替代。如圖3C 所示，缺少Pb2+時，無法激活8-17 DNAzyme 進行底物鏈切割；缺少F 鏈或靶標時，無法進行熵驅動鏈置換反應，背景信號較低；完整體系的熒光信號顯著增強，證明此體系可有效檢測突變基因PIK3CAE545K。

2.3 實驗條件的優化

考察了金屬離子種類與濃度、D-HCR 組裝中3 個發夾比例及傳感器反應時間對8-17 DNAzyme 切割效率的影響，所有實驗均在1 pmol/L 突變基因PIK3CAE545K 條件下進行。

2.3.1 激活8-17 DNAzyme 的金屬離子種類及濃度的優化

二價金屬離子（如Co2+、Ca2+、Mg2+、Cu2+、Zn2+和Pb2+）可促進8-17 DNAzyme 催化磷酸二酯鍵的斷裂[31]，因此，考察了二價金屬離子的種類對8-17 DNAzyme 催化活性的影響。如圖4A 所示，相同濃度的二價金屬離子（100 μmol/L）存在時，對1 pmol/L 靶標進行檢測，結果表明， Pb2+存在時8-17 DNAzyme 具有較高的催化活性。如圖4B 所示，在靶標存在情況下，隨著Pb2+濃度從5 μmol/L 增高至100 μmol/L， 8-17DNAzyme 的切割效率加快，熒光信號在25 μmol/L 時趨于穩定。因此，選擇Pb2+最佳濃度為25 μmol/L。

2.3.2 樹枝狀雜交鏈式反應發夾比例的優化

H1-TMR、H2 和H3 發夾比例對樹枝狀雜交鏈式反應產生的熒光信號具有顯著影響。如圖4C 所示，隨著H1-TMR 濃度增加，熒光信號增強。H1-TMR、H2 和H3 發夾比例為1∶1∶1 時，含有四甲基羅丹明的H1 濃度較低，難以迅速結合至微珠表面；當H1-TMR、H2 和H3 發夾比例為3∶1∶1 時，信號趨于穩定。因此，選擇H1-TMR、H2 和H3 發夾的最佳比例為3∶1∶1。

2.3.3 一步式檢測體系反應時間的優化

一步式微流控微珠陣列生物傳感器的反應時間對熒光信號有較大影響。如圖4D 所示，隨著反應時間延長， 30～120 min 時熒光信號不斷增加，反應至180 min 時，信號趨于穩定。因此，后續實驗選擇反應時間為180 min。

2.4 檢測性能分析

在最優實驗條件下，采用制備的芯片對不同濃度的突變基因PIK3CAE545K 進行檢測。結果表明，隨著靶標濃度增加，熒光信號增強，濃度達到50 pmol/L 時，信號趨于穩定（圖5A），在50～10000 fmol/L 濃度范圍內，熒光信號與靶標濃度的對數呈良好的線性關系（圖5B），線性回歸方程為y=31.65 lgCT+474.08（R2=0.9890），檢出限（LOD， 3σ）為0.94 fmol/L。在相同條件下，未采用微流控芯片（芯片外）對不同濃度的突變基因PIK3CAE545K 進行檢測，結果表明，熒光信號隨著PIK3CAE545K 濃度增加而增強， PIK3CAE545K 濃度為1 nmol/L 時，熒光信號趨于穩定（圖5C），在10～5000 pmol/L 濃度范圍內，熒光信號與靶標濃度的對數呈良好的線性關系（圖5D），線性方程為y=19.78 lgCT+221.92（R2=0.9879），檢出限（LOD， 3σ）為1.03 pmol/L。微流控芯片的高效傳質作用使檢測靶標的熒光信號顯著高于芯片外信號，檢測靈敏度提升了約3 個數量級，這歸因于不同的反應裝載方式。在芯片外檢測靶標采用EP 管進行反應，靜置3 h 后，微珠沉降至管底，導致反應不充分。采用微流控芯片檢測靶標時，溶液在重力和毛細作用驅動下持續流入微室，提高了分子碰撞效率，增強了熒光信號。綜上，相較于文獻中報道的ctDNA 檢測方法（表2），本研究通過級聯信號放大技術和微流控芯片的高效傳質特性，獲得了更高的靈敏度。

2.5 特異性分析

為考察一步式微流控微珠陣列芯片檢測方法對突變基因PIK3CAE545K 檢測的特異性，在相同實驗條件下，采用本方法分別對1 pmol/L 濃度的單堿基錯配（M1）、雙堿基錯配（M2）和三堿基錯配（M3）目標基因序列，以及正常基因PIK3CAE545K（WT）與突變基因PIK3CAE545K 靶標（Target）進行檢測。如圖6 所示，Target 的熒光信號明顯高于相同濃度的其它堿基錯配目標基因序列，通過t 檢驗計算p 值，結果顯示存在顯著性差異，表明本方法對突變基因PIK3CAE545K 序列具有良好的特異性。

2.6 實際樣品分析

為考察本方法在實際樣品檢測中的檢測性能，對模擬實際樣本進行檢測，并進行加標回收實驗。將突變基因PIK3CAE545K 加入至已稀釋20 倍的健康人血清中，加標濃度分別為0.5、1 和3 pmol/L。結果如表3 所示，加標回收率為98.8%～106.5%，相對標準偏差（RSD）為1.2%～2.1%，表明本方法可用于實際復雜樣品中突變基因PIK3CAE545K 的檢測。

3 結論

構建了一種基于立足點介導的熵驅動雙足DNA 步行器與樹枝狀雜交鏈式反應的信號放大策略，并結合微流控芯片傳感平臺，檢測了血液中的突變基因PIK3CAE545K。本方法采用微流控芯片實現一步法檢測，操作簡便，靈敏度顯著高于其它生物傳感器，檢出限低至0.94 fmol/L，并具備單堿基識別能力，展現出極高的特異性。本方法能夠在3 h 內實現血液中PIK3CAE545K 的快速檢測，為癌癥的早期診斷提供了新策略。

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