昆布多糖的提取工藝優化及其對小鼠抗疲勞能力的研究

摘 要：

采用響應面法對昆布多糖的提取工藝進行優化，并通過小鼠負重游泳試驗評價昆布多糖對小鼠抗疲勞能力的影響。結果表明：在液料比21∶1、復合酶添加量1.3％、酶解溫度65 ℃、酶解時間181 min的條件下，昆布多糖的提取率可達到11.48％。各生化指標結果顯示：與對照組相比，昆布多糖各劑量組小鼠負重游泳時間顯著延長（Plt;0.05），血乳酸、血尿素氮含量顯著降低（Plt;0.05），中、高劑量組肝／肌糖原含量顯著增加（Plt;0.05），結果說明昆布多糖對小鼠具有較好的抗疲勞作用，是一種較有前景的運動功能性物質。

關鍵詞：

昆布多糖;響應面法;提取優化;小鼠;抗疲勞

中圖分類號： TS 972.161 ""文獻標志碼： A ""文章編號：

2095-8730（2024）04-0073-06

昆布（Eckloniakurome Okam），又名江白菜、綸布等，屬翅藻科植物，常生于低潮線附近的巖礁上，主要分布于我國福建、浙江等沿海地區。昆布性味鮮咸，是人們餐桌上一道常見的美食，同時他還具有一定的藥用價值，現代藥理學研究發現，昆布中含有豐富的糖類物質，具有改善血糖血脂［1］、調節免疫活性［2］、抗氧化［3］、抗腫瘤［4］、抗疲勞［5］等作用。由于昆布具有較好的生物活性和藥理保健價值，目前已受到人們的廣泛關注，但有關昆布抗疲勞的研究還比較少。

本研究以藥食同源性海洋植物昆布為原料，首先對昆布多糖的提取工藝進行優化，再通過小鼠負重游泳運動疲勞性試驗，探討昆布多糖對小鼠抗疲勞能力的影響，為進一步為探究昆布多糖的生物活性價值提供依據和參考。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

昆布：購自亳州中藥材市場，產地福建，經洗凈后50 ℃烘干，粉碎后過0.25 mm篩，再經95％乙醇回流提取2次，脫脂、揮干溶劑后備用。

6～8周齡雄性SPF級C57BL／6小鼠，體質量為18～22 g，由斯貝福（北京）生物技術有限公司提供，動物合格證號：SCXK（京）2019-0010。本研究所有動物實驗由河南農業大學倫理委員會批準（批準編號：HAU-2022005），符合《實驗動物管理與使用指南》。

木瓜蛋白酶（gt;20 u／mg）：上海創賽科技有限公司;果膠酶（gt;50 000 u／g）：上海泰坦科技股份有限公司;纖維素酶（50 u／mg）：上海源葉生物科技有限公司;血乳酸（BLA）、血尿素氮（BUN）：上海晶抗科技生物工程有限公司;肝糖原（LG）、肌糖原（MG）檢測試劑盒：南京建成生物工程研究所;牛磺酸（純度99％）：山東冠特生物工程有限公司。

1.2 主要儀器

101-A1型電熱鼓風干燥箱：上海捷呈實驗儀器有限公司; RE-52A型旋轉蒸發儀：江蘇同君儀器科技有限公司;HH-6型數顯恒溫水浴箱：常州金壇精達儀器制造有限公司;M1416R高速臺式冷凍離心機：深圳市瑞沃德生命科技股份有限公司;UV-5100B型紫外分光光度計：無錫久平儀器有限公司;FA1004-FA2004型分析天平：上海友中衡電子有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 昆布多糖的提取

稱取預處理的昆布粉末10 g，加入適量的磷酸緩沖溶液及復合酶（果膠酶、纖維素酶、木瓜蛋白酶按質量比2∶2∶1混合）搖勻后，在一定的溫度下進行酶解，酶解結束后于沸水浴中滅活15 min，過濾，濾液經濃縮后加入3倍體積的95％乙醇，4 ℃下靜置過夜，于3 000 r／min轉速下離心10 min，沉淀依次用無水乙醇、丙酮、乙醚洗滌，40 ℃下干燥至恒重，得昆布多糖粗品。

1.3.2 單因素試驗

經粗提的昆布多糖，分別以不同的液料比（mL/g）（10∶1、15∶1、20∶1、25∶1、30∶1）、復合酶添加量（0.4％、0.8％、1.2％、1.6％、2.0％）、酶解溫度（30、40、50、60、70、80 ℃）、酶解時間（60、120、180、240、300 min）為單因素，考察單因素對昆布多糖提取的影響，每組試驗重復3次。

1.3.3 響應面優化試驗

根據預試驗的結果，選取液料比（A）、復合酶添加量（B）、酶解溫度（C）、酶解時間（D）為自變量，以昆布多糖提取率為響應值，運用Box-Behnken試驗設計，進行4因素3水平試驗，確定昆布多糖復合酶法提取的最佳工藝條件，試驗因素水平見表1，每個試驗點做3個重復，取平均值。

1.3.4 昆布多糖提取率計算

昆布多糖提取率按下列公式計算。

昆布多糖提取率=［（昆布多糖質量濃度×溶液體積×稀釋倍數）/昆布粉質量］×100%。

1.3.5 昆布多糖抗疲勞活性的研究

1.3.5.1 動物分組及給藥

50只小鼠飼養于標準化的潔凈動物室內，保持室內溫度為（23±2）℃，相對濕度45％～65％，期間不限制小鼠的正常飲食，適應性飼養1周后將其隨機分為5組，分別為空白對照組（C組）、昆布多糖低劑量組（L組）、昆布多糖中劑量組（M組）、昆布多糖高劑量組（H組）和牛磺酸陽性對照組（PC組），每組10只。L、M、H組每日以100、200、400 mg／kg的劑量對小鼠灌服昆布多糖，PC組以400 mg／kg的劑量灌服牛磺酸，空白對照組則灌服等劑量的生理鹽水，每日1次，連續灌服28 d。

1.3.5.2 小鼠負重游泳試驗

參考陳澤宇等［6］的試驗方案，小鼠末次給藥60 min后進行負重游泳，當發現小鼠漂浮于水面時，用玻璃棒對其輕輕敲打，使之保持持續游泳狀態，當小鼠頭部沉入水中超過10 s且無力浮出水面，表明已處于運動力竭狀態，此時記錄小鼠自游泳開始至其運動力竭的時間。

1.3.5.3 小鼠體內各生化指標的測定

小鼠游泳試驗結束30 min后，采用乙醚將小鼠迷暈，摘取眼球取血，4 ℃下3 000 r／min離心15 min，收集上清液，按照BLA、BUN試劑盒說明書對血乳酸和尿素氮含量進行檢測。同時頸椎脫臼處死小鼠，在冰浴條件下刨取出小鼠肝臟和腿部肌肉組織，組織取出后經生理鹽水漂洗3次，濾紙擦干后稱重，再取100 mg組織剪碎，加入生理鹽水進行勻漿，3 000 r／min離心15 min，取上清液進行肝糖原（LG）、肌糖原（MG）含量檢測。

1.4 統計與分析

本試驗數據以“平均值±標準差”表示，運用SPSS 21.0統計學軟件進行數據分析，組間比較采用單因素方差分析，Plt;0.05表示差異具有統計學意義。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果分析

由圖1可知，昆布多糖提取率隨液料比的上升呈現出先升后降的趨勢，當液料比達到20∶1時，昆布多糖的提取率最高（8.55％）。在復合酶添加量為0.4％～2.0％范圍內時，昆布多糖提取率也呈現出相同的趨勢，表現為先升后降，在復合酶添加量為1.2％時，昆布多糖提取率達到最高。當酶解溫度為60 ℃時，昆布多糖的提取率較高（9.52％）。對于酶解時間而言，適當的延長酶反應時間，可以促進昆布多糖不斷溶出，但酶解時間過長，可能會引起昆布多糖降解，導致更多非糖類雜質的溶出，因此選擇酶解時間為180 min。綜合各因素對昆布多糖提取率的影響，確定初步的提取條件為液料比20∶1、復合酶添加量1.2％、酶解溫度60 ℃、酶解時間180 min。

2.2 響應面試驗結果分析

根據單因素試驗得到的結果，采用Design Expert 8.0.6響應面軟件對昆布多糖提取工藝進一步優化，具體設計方案及試驗結果見表2。對表2的數據進行二次回歸擬合，得到昆布多糖提取率（Y）的二次回歸方程：

Y=-8.923 33+2.525 67A+4.314 58B-0.766 83C+0.152 69D-0.213 75AB-0.001 30AC-0.001 32AD+0.148 75BC-0.001 04BD+0.000 37CD-0.046 667A2-3.682 29B2+0.004 78C2-0.000 41D2。

從昆布多糖提取工藝的模型回歸分析可以看出（表3），模型P值lt;0.000 1，失擬項Pgt;0.05，說明構建的模型具有顯著性，能夠較好地擬合真實值［7］。同時，模型中決定系數R2為0.9951，表明該模型可以解釋響應面中99.51％的可變性，可以用于昆布多糖提取的優化。對于各因素對昆布多糖提取率的影響，發現模型一次項A、C，交互項AB、AD、BC及二次項A2、B2、C2、D2對昆布多糖提取率的影響極顯著（Plt;0.01），而一次項B、D及交互項AC、BD、CD對昆布多糖提取率的影響不顯著（Pgt;0.05），這進一步說明各工藝參數和提取率之間本身是一種非線性的關系。

對得到的模型回歸方程進行偏導求解，得出昆布多糖最佳提取工藝為液料比20.69∶1.00、復合酶添加量1.27％、酶解溫度65 ℃、酶解時間180.93 min。在此條件下昆布多糖提取率的預測值達到11.56％。為證明回歸模型結果數據的可靠性，同時方便試驗操作，對提取工藝條件微調為液料比21∶1、復合酶添加量1.3％、酶解溫度65 ℃、酶解時間181 min，同時進行3次驗證試驗，得到最終的昆布多糖提取率為11.48 ％，與預測值較為接近。

2.3 昆布多糖對小鼠負重游泳時間的影響

由圖2可知，與C組相比，L、M、H組小鼠負重游泳時間均有顯著性的延長（Plt;0.05），且具有明顯的劑量依賴性，其中H組的負重游泳時間達到（22.67±3.38）min，相比C組提高了54.42％，與PC組（牛磺酸陽性對照組）相當，這說明一定劑量的昆布多糖可以顯著延長小鼠的負重游泳時間，提升小鼠的運動耐力。

2.4 昆布多糖對小鼠LG、MG含量的影響

LG和MG是兩種重要的能源儲備物質，它們在機體代謝中扮演著重要的角色。當機體進行劇烈的運動時，LG和MG共同發揮作用，LG可以轉化為糖類進入血液，保持機體血糖平衡，MG則通過無氧酵解，產生能量以支持肌肉活動。隨著運動時間的延長和運動強度的增加，LG和MG會逐漸降低，當降低到一定閾值時，機體會感到疲勞，因此LG和MG儲備量在一定程度上可以反映出機體的疲勞程度［8］。由圖3可知，與C組相比，昆布多糖各劑量組小鼠LG、MG含量均有所增加，其中H組小鼠LG、MG含量較C組分別提高了70.39％和32.26％，與C組比較具有統計學差異（Plt;0.05），這說明在質量濃度100～400 mg／kg的范圍內，昆布多糖能夠增加小鼠肝肌糖原的儲備量，為其提供充足的能量，從而提高小鼠的運動耐力。

2.5 昆布多糖對小鼠BLA和BUN含量的影響

BLA和BUN是衡量機體疲勞程度的兩個重要生化指標［9］。由圖4可知，昆布多糖各劑量組BLA、BUN含量較C組顯著降低（P＜0.05），其中L、M、H組BLA含量較C組分別降低了8.62%、13.25%和18.93%，BUN含量較C組分別降低了7.50%、14.32%和15.91%，這表明昆布多糖可以有效地清除小鼠運動后BLA、BUN的堆積，提高小鼠的運動適應性，增強抗疲勞的能力。

3 結論

采用響應面優化法研究用復合酶法提取昆布多糖，得到了昆布多糖的最佳提取工藝條件：液料比21∶1、復合酶添加量1.3%、酶解溫度65 ℃、酶解時間181 min，在該工藝條件下昆布多糖提取率可達到11.48%。進一步對小鼠體內的抗疲勞活性研究結果顯示，昆布多糖可以延長小鼠負重游泳時間，增強機體運動耐受能力，同時提高了肝肌糖原的含量，減少了血乳酸、血清尿素氮的堆積，具有一定的抗疲勞作用。

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Optimization of laminarin extraction and its effects of anti-fatigue on mice

GUAN Jihui

（College of Physical Education， Henan Agricultural University， Zhengzhou， Henan 450046， China）

Abstract：

The response surface method was used to optimize the extraction process of laminarin （Lam）， and the effect on the anti-fatigue ability of mice was evaluated through a weight-bearing swimming test. The results showed that under the conditions of a liquid-solid ratio of 21∶1， multi-enzyme dosage of 1.3％， enzymolysis temperature of 65 ℃， and enzymolysis time of 181 minutes， the extraction rate of Lam could reach 11.48％. Various biochemical indicators indicated that compared to the control group， the weight-bearing swimming time of mice in each dose group of Lam were significantly increased （Plt;0.05）， while the level of blood lactate and blood urea nitrogen were significantly decreased （Plt;0.05）. Additionally， the hepatic／muscle glycogen content in the medium and high dose groups was also significantly increased （Plt;0.05）. These findings indicate that Lam had a good anti-fatigue effect on mice and are a promising functional product for exercise.

Key words：

laminarin; response surface method; extraction optimization; mice; anti-fatigue

（責任編輯：趙 勇）

收稿日期：2024-06-11

基金項目：河南省高校人文社會科學研究項目（2022-ZZJH-378），河南省高等教育教學改革研究與實踐項目（2021SJGLX155Y）

作者簡介：

管繼輝，男，河南農業大學體育學院講師，主要從事運動營養學研究，E-mail：wks210@163.com。