硫化氫介導的S-巰基化修飾及其化學檢測技術

摘要：自硫化氫作為氣體信號分子被發現以來，其在生物體內作用機制的研究取得快速進展，并已被證實可通過介導S-巰基化修飾從而調控蛋白質功能與活性。但因S-巰基化修飾具有高度動態性及復雜性，如何高效、準確地檢測并量化這一修飾過程，已成為影響該領域進一步發展的關鍵。基于此，通過對現有化學檢測技術進行綜述，分析馬來酰亞胺法、改良生物素轉換法以及標記轉換法等技術，旨在為硫化氫介導的S-巰基化修飾的深入研究提供技術支持，以推動該領域發展。

關鍵詞：硫化氫；S-巰基化修飾；化學檢測

硫化氫作為氣體信號分子，近年來在生物學領域得到廣泛應用，參與調節多種生理及病理過程，通過介導S-巰基化修飾來影響蛋白質功能及活性。S-巰基化修飾可對蛋白質結構、穩定性產生一定影響，并在細胞信號傳導、氧化還原調控等方面充分發揮作用。隨著研究的深入，硫化氫介導的S-巰基化修飾已成為生物學領域的熱點問題，為此，需深入探討其化學檢測技術，以期為研究提供支撐［1］。

1S-巰基化修飾

1.1S-巰基化修飾研究現狀

在人類蛋白質組中，已有數百種蛋白質被鑒定出具有S-巰基化修飾位點，蛋白質涉及多種生物過程，如信號轉導、代謝調控、氧化還原反應等。且針對S-巰基化修飾的化學檢測技術也得到快速發展。例如，基于質譜技術的S-巰基化修飾檢測方法已取得明顯成就，并廣泛應用于各種生物樣本中S-巰基化修飾位點鑒定。新型熒光探針及生物素標記技術也被開發出來，用于實時監測及定量分析S-巰基化修飾水平。此外，研究人員通過質譜技術對S-巰基化修飾位點進行鑒定，并測定位點在細胞內修飾水平［2］。

1.2S-巰基化修飾與S-亞硝基化修飾之間的關系

在蛋白質修飾領域，S-巰基化修飾與S-亞硝基化修飾均顯示出對蛋白質功能的重要影響，且此兩種修飾在某些蛋白質上共存，可相互調節。例如，在一種關鍵代謝酶中，當S-巰基化修飾與S-亞硝基化修飾同時發生時，酶的活性會受到一定影響。在某種程度上，當S-巰基化修飾水平升高時，S-亞硝基化修飾水平會相應降低，反之亦然。這種相互調節的機制與兩種修飾在生物體內的動態平衡有關。當心肌細胞受到氧化應激時，S-巰基化修飾水平呈上升趨勢，而S-亞硝基化修飾水平呈下降趨勢。這表明在細胞應激狀態下，S-巰基化修飾可起到保護細胞免受氧化損傷作用，而S-亞硝基化修飾會受到抑制［3］。

2S-巰基化修飾的化學檢測技術

2.1馬來酰亞胺法

馬來酰亞胺法由約翰霍普金斯大學的Snyder教授及其團隊于2012年提出，是一種高度靈敏技術，專門用于檢測蛋白質中的S-巰基化修飾。這種方法基于特定的化學原理來標記和檢測靶蛋白中半胱氨酸（Cys）上的S-巰基（—SH），觀察其在硫化氫（H2S）作用下形成S-巰基化產物（—SSH）的過程。在實驗中，使用Alexa Fluor 680標記的C2N-乙酰馬來酰亞胺熒光探針來特異性地標記靶蛋白中經過H2S修飾的Cys上的—SH基團。這種熒光探針可與—SH形成穩定的共價鍵，從而允許通過熒光信號來追蹤被修飾蛋白質。通過添加二硫蘇糖醇（DTT）這一還原劑，可破壞由H2S形成的二硫鍵（—SSH），導致原本與熒光探針結合的—SH基團從蛋白質上脫落。

由于—SH的脫落，熒光探針與蛋白質的結合減弱，導致熒光信號減弱。通過凝膠電泳將蛋白質分離，并使用轉印或點印跡法將蛋白質轉移到PVDF膜上。使用凝膠成像儀檢測PVDF膜上的紅色熒光條帶，觀察熒光信號的強度變化。如果熒光信號減弱，可判斷H2S對靶蛋白進行S-巰基化修飾。這種方法的靈敏性及特異性使其成為研究蛋白質S-巰基化修飾的主要工具，為深入了解H2S在生物體中的生理功能及作用機制提供有效支撐。在針對S-巰基化修飾研究中，研究人員采用馬來酰亞胺法對蛋白質中S-巰基化水平進行檢測，使用含有馬來酰亞胺基團的熒光探針與細胞裂解液中的蛋白質進行反應［4］。

2.2改良生物素轉換法

利用烷化劑S-甲基甲硫代磺酸鹽（MMTS）來封閉蛋白質中未被S-巰基化修飾的半胱氨酸（Cys）上的巰基（—SH）。MMTS通過與相關未修飾巰基發生反應，以便保證其不會被標記步驟所干擾，利用丙酮去除多余的MMTS，使用生物素HPDP來特異性地標記經過S-巰基化修飾的Cys殘基上的—SSH基團。生物素HPDP可選擇性地與—SSH結合，為識別檢測提供基礎。通過利用生物素與鏈霉親和素之間的高親和力，將生物素標記S-巰基化蛋白質從復雜的蛋白質混合物中富集出來，對檢測靈敏度及特異性產生影響。

MMTS被發現可與未修飾的—SH反應，也可與—SSH發生反應，在一定程度上將會對檢測結果的準確性產生影響。有研究表明，MMTS與—SSH的反應速度較快，將MMTS與生成產物的游離—SH反應，從而間接地封閉未修飾巰基，而S-巰基化修飾蛋白質可通過生物素HPDP進行標記。因蛋白質中S-巰基化水平較高，將引發較高假陽性率。因此，在使用該方法時，可結合質譜法，以提高分析的可靠性及準確性，此外，通過利用基因敲除或抑制特定酶，可對S-巰基化水平產生影響，從而進行檢測結果的可靠性驗證。

2.3標記轉換法

由于S-巰基化形成二硫鍵（—SSH）相較于蛋白質中其他二硫鍵具有更強親核性，使用巰基封閉劑——甲基磺酰基苯并噻唑（MSBT）或其水溶性類似物MSBT-A來封閉蛋白質中未修飾的巰基（—SH）以及部分S-巰基化修飾的巰基（—SSH）。利用MSBT或MSBT-A封閉所有自由巰基（—SH和—SSH），確保其不再參加其他化學反應。隨即引入一個特殊設計標記轉換試劑——生物素化氰基乙酸甲酯衍生物。這個試劑兼具親核性和生物素報告分子，可選擇性地與封閉劑S-巰基化修飾二硫鍵（—SSH）發生反應，與未修飾巰基（—SH）結合。經過標記蛋白質通過鏈霉親及素磁珠與生物素發生特異性結合，從而實現S-巰基化修飾蛋白質富集。利用Western印跡技術對富集蛋白質進行分析，對S-巰基化水平進行定量評估。

3實驗設計與操作注意事項

3.1細胞和組織樣品的制備

實驗采用HeLa細胞系，細胞在含有胎牛血清（FBS）的DMEM培養基中，在37 ℃恒溫培養箱中培養。細胞密度達到80%時，繼續進行操作。使用胰蛋白酶消化細胞，離心收集細胞沉淀，重復洗滌細胞3次，以去除培養基中的雜質和胰蛋白酶殘留。還應使用血球計數板對收集細胞進行計數，使每次實驗細胞數量保持一致。在本次實驗中，共收集到約1×106個細胞。選取小鼠肝臟組織作為實驗材料。在無菌條件下迅速剝離肝臟，并放入預冷的PBS中清洗。在此基礎上，使用無菌剪刀將肝臟組織剪成約1 mm3的小塊，以便于處理與消化。將剪碎組織放入含有蛋白酶K的消化液中，在37 ℃水浴中消化2 h。消化過程中，每30 min振蕩一次，以確保組織充分消化，還應使用70 μm細胞篩網過濾消化后的組織懸液，去除未消化的組織碎片。

3.2檢測過程中的質量控制

在進行蛋白質S-巰基化修飾的檢測實驗中，采取嚴格質量控制措施，選擇經過驗證、具有高靈敏度和特異性的檢測方法，以便對蛋白質中S-巰基化修飾水平進行識別。在樣品制備階段，對每一步操作進行精確控制，保證樣品的完整性及代表性。例如在細胞樣品制備中，確保細胞培養條件一致，細胞密度達到80%時進行收集，收集到的細胞數量精確至1×106個。對于組織樣品，選取同一部位、大小相近的組織塊進行消化處理，最終收集到細胞數量約為5×105個。在檢測過程中，采用標準物質監控的方法，定期使用有證標準物質作為監控樣品，與待測樣品同時進行檢測。

3.3數據解讀與分析

硫化氫介導的S-巰基化修飾通過改變蛋白質的局部構象和活性，進而調控細胞的多種生物學功能。S-巰基化修飾水平可通過檢測蛋白質中特定半胱氨酸殘基的硫巰基化修飾程度來評估。S-巰基化修飾對蛋白質活性的影響，可通過比較修飾前后蛋白質的生化活性來判斷。還需要關注S-巰基化修飾與其他蛋白質翻譯后修飾相互作用，以及硫化氫水平對S-巰基化修飾的影響。在化學檢測技術方面，馬來酰亞胺法原理是利用馬來酰亞胺與硫巰基之間的特異性反應來檢測S-巰基化修飾。

改良生物素轉換法通過引入生物素標記來提高檢測的特異性和靈敏度。標記轉換法是一種新興檢測方法，通過引入標記分子來追蹤硫巰基化修飾的過程，對實驗數據進行清洗整理，去除異常值及重復值。運用描述性統計方法對數據進行初步分析，了解數據分布及特征，比較不同組別之間的差異、分析硫化氫水平對S-巰基化修飾的影響等，使用可視化工具將數據以圖表或圖形的形式展示出來，便于直觀理解數據之間的關系及變化趨勢。

4結論

硫化氫介導的S-巰基化修飾在生物學領域中，通過精細調控蛋白質功能與活性，對眾多生命過程產生影響。化學檢測技術作為研究S-巰基化修飾主要方法，如馬來酰亞胺法、改良生物素轉換法以及標記轉換法等，為研究提供修飾機制窗口。隨著技術不斷進步，未來會有更多高效、準確的檢測方法投入應用，以推動S-巰基化修飾的深入研究。

參考文獻：

［1］張珍，全心雨，唐志書.硫化氫介導的S-巰基化修飾及其化學檢測技術［J］.中國生物化學與分子生物學報，2024，40（1）：4453.

［2］唐福臨.H2S介導的S-巰基化修飾對擬南芥剪接相關蛋白的功能調節［D］.太原：山西大學，2023.

［3］劉翠霞.H2S介導CKX2蛋白S-硫巰基化修飾調控擬南芥根系發育［D］.咸陽：西北農林科技大學，2022.

［4］丁雪婷.H2S介導的S-硫巰基化修飾調節擬南芥MPK10活性的機制研究［D］.咸陽：西北農林科技大學，2022.