草蓯蓉多糖對THP-1 巨噬細胞炎癥反應的抑制作用及其機制

［摘 要］ 目的：探討草蓯蓉多糖（BRPS）對脂多糖（LPS）誘導的THP-1巨噬細胞炎癥反應的影響，并闡明其作用機制。方法：將THP-1單核細胞分化為巨噬細胞，采用LPS誘導THP-1巨噬細胞，建立炎癥模型。CCK-8 法檢測不同濃度（0、100、200、500、1 000 和2 000 μg·L-1） LPS 及不同濃度（0、12. 5、25. 0、50. 0、100. 0 和200. 0 mg·L-1） BRPS 處理后THP-1 巨噬細胞存活率， 選取后續實驗藥物濃度。將THP-1 巨噬細胞分為空白組、模型組、低劑量BRPS 組（25. 0 mg·L-1 BRPS）、中劑量BRPS 組（50. 0 mg·L-1 BRPS） 和高劑量BRPS 組（100. 0 mg·L-1 BRPS）。采用P38 抑制劑SB203580、ERK 抑制劑U0126、c-Jun 氨基末端激酶（JNK） 抑制劑SP600125 和核因子κB （NF-κB）抑制劑BAY11-7082 對THP-1 細胞進行驗證。另取THP-1 細胞， 分為對照組、LPS 組、抑制劑組、100. 0 mg·L-1 BRPS 組和抑制劑+100. 0 mg·L-1 BRPS 組。酶聯免疫吸附試驗（ELISA） 法檢測各組THP-1 巨噬細胞培養液中腫瘤壞死因子α （TNF-α）、白細胞介素（IL）-6 和IL-1β 水平， 2， 7-二氯熒光素二乙酸酯（DCFH-DA） 熒光探針法檢測各組THP-1 巨噬細胞中活性氧（ROS） 水平，Hoechst33342/PI 熒光染色法觀察各組THP-1 巨噬細胞膜損傷情況，JC-1 熒光染色法觀察各組THP-1巨噬細胞線粒體膜電位，蛋白印跡法檢測各組THP-1 巨噬細胞中環氧合酶2 （COX-2）、高遷移率族蛋白B1 （HMGB1）、NOD 樣受體熱蛋白結構域相關蛋白3 （NLRP3）、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白酶（Caspase）-1、消皮素D （GSDMD）-N、IL-1β、絲裂原活化蛋白激酶（MAPK） 和NF-κB 相關蛋白表達水平。結果：CCK-8法檢測，LPS濃度為100～2 000 μg·L-1時，THP-1巨噬細胞存活率均gt;90%；與0 μg·L-1 LPS 組比較，100、200、500、1 000 和2 000 μg·L-1 LPS 組THP-1 巨噬細胞培養液中IL-6水平均明顯升高（Plt;0. 05），提示巨噬細胞炎癥反應明顯增強，因此選用100 μg·L-1 LPS 構建炎癥模型；12. 5、25. 0、50. 0、100. 0 和200. 0 mg·L-1 BRPS 處理THP-1 巨噬細胞，THP-1 巨噬細胞存活率分別為91. 2%、93. 8%、91. 4%、90. 6% 和91. 8%，選取25. 0、50. 0 和100. 0 mg·L-1 BRPS 作為后續實驗中低、中和高劑量BRPS 組藥物濃度。ELISA 法檢測，與空白組比較，模型組THP-1 巨噬細胞培養液中IL-6、TNF- α 和IL-1β 水平均明顯升高（Plt;0. 05）； 與模型組比較， 低、中和高劑量BRPS 組THP-1 巨噬細胞培養液中IL-6、TNF-α 和IL-1β 水平均明顯降低（Plt;0. 05）。DCFH-DA 熒光探針法檢測，與空白組比較，模型組THP-1 巨噬細胞中ROS 水平明顯升高（Plt;0. 05）；與模型組比較，低、中和高劑量BRPS 組THP-1 巨噬細胞中ROS 水平均明顯降低（Plt;0. 05）。Hoechst33342/PI熒光染色法觀察， 與空白組比較， 模型組THP-1 巨噬細胞膜損傷程度明顯增加； 與模型組比較，低、中和高劑量BRPS 組THP-1 巨噬細胞膜損傷程度明顯減少。JC-1 熒光染色法觀察， 空白組THP-1 巨噬細胞線粒體膜電位較高；與空白組比較，模型組THP-1 巨噬細胞線粒體跨膜電位明顯降低；與模型組比較，低、中和高劑量BRPS 組THP-1 巨噬細胞線粒體跨膜電位逐漸升高。蛋白印跡法檢測，與空白組比較，模型組THP-1 巨噬細胞中COX-2、HMGB1、NLRP3、Caspase-1、GSDMD-N和IL-1β 蛋白表達水平及p-P38/P38、p-ERK/ERK、p-JNK/JNK 和p-NF- κB/NF-κB 比值均明顯升高（Plt;0. 05）；與模型組比較，中和高劑量BRPS 組THP-1 巨噬細胞中HMGB1、NLRP3、Caspase-1、GSDMD-N 和IL-1β 蛋白表達水平及p-P38/P38、p-ERK/ERK、p-JNK/JNK 和p-NF-κB/NF-κB 比值均明顯降低（Plt;0. 05），低劑量BRPS 組THP-1 巨噬細胞中NLRP3、Caspase-1 和IL-1β 蛋白表達水平均明顯降低（Plt;0. 05），高劑量BRPS 組THP-1 巨噬細胞中COX-2 蛋白表達水平明顯降低（Plt;0. 05）；與對照組比較，LPS 組THP-1 巨噬細胞p-P38/P38、p-ERK/ERK、p-JNK/JNK 和p-NF-κB/NF- κB 比值及IL-1β 蛋白表達水平均明顯升高（Plt;0. 05）；與LPS 組比較，抑制劑組、100 mg·L-1BRPS 組和抑制劑+100 mg·L-1 BRPS 組THP-1 巨噬細胞中p-P38/P38、p-ERK/ERK、p-JNK/JNK和p-NF-κB/NF-κB 比值及IL-1β 蛋白表達水平均明顯降低（Plt;0. 05）；與抑制劑組比較，抑制劑+100 mg·L-1 BRPS 組THP-1 巨噬細胞p-P38/P38、p-ERK/ERK、p-JNK/JNK 和p-NF-κB/NF-κB 比值均明顯降低 （Plt;0. 05）。結論：BRPS抑制THP-1細胞巨噬細胞的炎癥反應，其機制可能與BRPS調控MAPK 和NF-κB 信號通路有關。

［關鍵詞］ 草蓯蓉多糖； NOD 樣受體熱蛋白結構域相關蛋白3 ； 絲裂原活化蛋白激酶；核因子κB； 焦亡

［中圖分類號］ R285.5 ［文獻標志碼］ A

草蓯蓉，又稱“不老草”，屬列當科草蓯蓉屬植物，分布于中國長白山、日本富士山和朝鮮北部山區［1］。草蓯蓉含有草蓯蓉多糖（Boschnikiarossica polysaccharides， BRPS）、草蓯蓉苷、草蓯蓉苯丙素苷和草蓯蓉環烯醚萜苷等多種藥理成分［2］。草蓯蓉可全草入藥，味甘，具有補腎、壯陽及保肝等功效［3］。中醫藥研究［4］ 發現滋腎清熱類中草藥同時具有抗炎作用。研究［5-7］ 顯示BRPS 具有抗炎、抗腫瘤和抗氧化應激等藥理作用。BRPS 可溶于水，不良反應少，具有非常廣泛的藥用價值，因此對BRPS 的研究具有重要意義［8］。

當機體受到刺激后會產生防御反應，此時炎癥反應會被激活，進行組織修復，但是過度的炎癥反應會對機體組織產生損害［9］。NOD 樣受體熱蛋白結構域相關蛋白3 （NOD-like receptor thermalprotein domain associated protein 3， NLRP3） 炎癥小體是由NLRP3、凋亡相關斑點樣蛋白（apoptosis-associated speck-like protein containing aCARD， ASC） 和含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白酶（cysteine aspartic specific protease，Caspase）-1 前體（Pro-Caspase-1） 組成的高分子蛋白復合物， 其激活后導致細胞釋放炎癥因子， 引起細胞焦亡［10］。經典炎癥通路絲裂原活化蛋白激酶（mitogenactivatedprotein kinase，MAPK） 通路和核因子κB（nuclear factor kappa B， NF-κB） 通路可以激活下游NLRP3 炎癥小體［11］。NLRP3 炎癥小體激活后可將Pro-Caspase-1 剪切為具有活性的Caspase-1，此外活化的Caspase-1 切割打孔蛋白消皮素D（gasdermin D，GSDMD），隨后GSDMD 的N 端活性片段（GSDMD-N） 轉移至細胞膜磷脂層上并形成孔洞， 細胞內外滲透壓改變， 最后細胞腫脹破裂，細胞失去調控物質進出的能力，釋放出細胞內炎性因子，引發機體的炎癥反應［12-13］。

脂多糖（lipopolysaccharide， LPS） 是細菌細胞壁中的主要成分，可以與機體免疫系統中的受體結合， 進而引發炎癥反應［14］。巨噬細胞在炎癥反應中起關鍵作用，其可通過分泌細胞炎癥因子參與機體免疫應答。研究［15］ 發現： 佛波酯（phorbolmyristate acetate， PMA） 可誘導人單核白血病細胞THP-1 極化為巨噬細胞。但BRPS 通過MAPK 和NF-κB 通路對THP-1 巨噬細胞發揮抗炎作用的具體機制尚未完全闡明。因此，本研究探討BRPS 的抗炎作用及其對MAPK 和NF-κB 信號通路的影響，為BRPS 的臨床應用提供參考。

1 材料與方法

1. 1 藥物、細胞、主要試劑和儀器 BRPS （含量為86. 5%），常規醇沉法提取，由延邊大學醫學院尹宗柱教授惠贈。THP-1 細胞購自美國ATCC 公司。LPS 和PMA 購自美國Sigma 公司， RPMI-1640 培養基和胎牛血清購自以色列BI 公司， β-actin 抗體購自美國ABclonal 公司，NLRP3 和Caspase-1 抗體購 自 美 國 Thermo 公 司，環 氧 合 酶 2（cyclooxygenase-2， COX-2）、高遷移率族蛋白B1（high mobility group box 1 protein， HMGB1）、GSDMD-N、白細胞介素（interleukin， IL）-1β、P38、磷酸化P38 （phosphorylated P38， p-P38）、細胞外調節蛋白激酶（extracellular regulatedprotein kinases， ERK）、 磷 酸 化 ERK（phosphorylated ERK，p-ERK）、c-Jun 氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase， JNK）、磷酸化JNK（phosphorylated JNK， p-JNK）、NF- κB、磷酸化NF-κB （phosphorylated NF-κB， p-NF-κB） 和Lamin B1 抗體購自美國Cell Signaling Technology公司，人IL-1 β 、IL-6 和腫瘤壞死因子α （tumornecrosis factor- α， TNF- α） 酶聯免疫吸附試驗（enzyme linked immunosorbent assay， ELISA） 試劑盒購自美國RayBiotech 公司， 活性氧（reactiveoxidative species， ROS） 檢 測 試 劑 盒、Hoechst33342/PI 熒光染色試劑盒和線粒體膜電位檢測試劑盒購自上海碧云天生物有限公司，核蛋白提取試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司。CO2 培養箱和酶標儀購自美國Bio-Tek 公司，垂直板電泳儀購自北京六一生物科技有限公司，化學發光成像系統購自美國Azure Biosystems 公司，熒光倒置顯微鏡購自重慶奧特光學儀器有限責任公司。

1. 2 THP-1細胞培養和 PMA 誘導巨噬細胞 將THP-1 單核細胞培養于含10% 胎牛血清和1% 抗生素的RPMI-1640 培養基中，于37 ℃、5% CO2條件下培養。細胞生長2～3 d 后進行傳代。取對數生長期細胞，采用100 pg·L-1 PMA 刺激THP-1 單核細胞48 h，誘導分化為巨噬細胞。光學顯微鏡下觀察細胞形態表現，此時細胞為貼壁狀態［16-17］。

1. 3 CCK-8法檢測不同濃度LPS和BRPS處理后THP-1巨噬細胞存活率 將 THP-1巨噬細胞接種于96 孔細胞培養板中， 分別加入含0、100、200、500、1 000 和2 000 μg·L-1 LPS 的培養基培養24 h，每組設 6 個復孔，加入 CCK-8 試劑后，避光 2 h，于波長450 nm 處測定吸光度（A） 值，計算THP-1巨噬細胞存活率。細胞存活率=測定孔A 值/空白孔A 值×100%另取THP-1 巨噬細胞，接種于96 孔細胞培養板中， 每組設6 個復孔， 分別加入含0、12. 5、25. 0、50. 0、100. 0 和200. 0 mg·L-1 BRPS 的培養基培養24 h，加入CCK-8 試劑， 避光2 h 后，于波長450 nm 處測定A 值， 計算THP-1 巨噬細胞存活率， 以選取后續實驗藥物濃度。細胞存活率= 測定孔A 值/空白孔A 值×100%。實驗重復3 次。

1. 4 ELISA 法檢測不同濃度 LPS 處理后 THP-1巨噬細胞培養液中 IL-6水平 將 THP-1巨噬細胞接種于6 孔細胞培養板中，按上述各組LPS 濃度進行處理，24 h 后吸取各組細胞培養液，按照ELISA試劑盒說明書步驟進行操作，繪制標準曲線，計算不同濃度LPS 處理后巨噬細胞培養液中IL-6 水平。實驗重復3 次。

1. 5 細胞分組和處理 將 THP-1 細胞分為空白組、模型組、低劑量BRPS 組、中劑量BRPS 組和高劑量BRPS 組?？瞻捉MTHP-1 細胞采用100 pg·L-1PMA 刺激48 h 分化為巨噬細胞，加入無血清培養基培養24 h，更換新培養基培養1 h。模型組THP-1細胞采用100 pg·L-1 PMA 刺激48 h， 加入無血清培養基培養24 h 后， 100 μg·L-1 LPS 處理1 h， 建立細胞炎癥模型。低、中和高劑量BRPS 組THP-1細胞采用100 pg·L-1 PMA 刺激48 h， 分別加入含25. 0、50. 0 和100. 0 mg·L-1 BRPS 培養基培養24 h后，應用100 μg·L-1 LPS 處理1 h［18］。采用P38 抑制劑SB203580、ERK 抑制劑U0126、JNK 抑制劑SP600125 和NF- κB 抑制劑BAY11-7082 對THP-1細胞進行驗證。另取THP-1 細胞， 分為對照組、LPS 組、抑制劑組、100. 0 mg·L-1 BRPS 組和抑制劑+100. 0 mg·L-1 BRPS 組。各組THP-1 細胞采用100 pg·L-1 PMA 刺激48 h 分化為巨噬細胞。對照組THP-1 細胞不作任何處理； LPS 組THP-1細胞加入100 μg·L-1 LPS 作用1 h； 抑制劑組THP-1 細胞分別采用相應濃度不同抑制劑處理后加入100 μg·L-1 LPS作用1 h，其中10 μmol·L-1SB203580 作用90 min， 10 μmol·L-1 U0126 作用90 min， 10 μmol·L-1 SP600125 作 用 30 min，30 μmol·L-1 BAY11-7082 作用60 min；100. 0 mg·L-1BRPS 組THP-1 細胞加入含100. 0 mg·L-1 BRPS培養基培養24 h 后，加入100 μg·L-1 LPS 作用1 h；抑制劑+100. 0 mg·L-1 BRPS 組THP-1 細胞加入含100. 0 mg·L-1 BRPS 培養基培養24 h 后，更換相應濃度不同抑制劑處理，再加入100 μg·L-1 LPS 作用1 h。

1. 6 ELISA法檢測各組THP-1巨噬細胞培養液中IL-6、TNF-α和 IL-1β水平 將 THP-1巨噬細胞接種于6 孔細胞培養板中，收集各組細胞培養液，按照試劑盒說明書操作，檢測IL-6、TNF-α 和IL-1β 水平，繪制標準曲線，計算各組THP-1 巨噬細胞培養液中IL-6、TNF-α 和IL-1β 水平。實驗重復3 次。

1. 7 2，7- 二 氯 熒 光 素 二 乙 酸 酯（2，7-dichlorodihydrofluorescein diacetate，DCFH-DA）熒光探針法檢測各組 THP-1 巨噬細胞中 ROS 水平 將THP-1 巨噬細胞接種于6 孔細胞培養板中，按照ROS 檢測試劑盒說明書操作，各孔加入適當稀釋好的DCFH-DA 試劑避光染色30 min。倒置熒光顯微鏡下觀察并拍照，采用Image J 軟件分析綠色熒光強度，以綠色熒光強度代表ROS 水平。實驗重復3 次。

1. 8 Hoechst33342/PI熒光染色法觀察各組THP-1巨噬細胞膜損傷情況 將 THP-1 巨噬細胞接種于6 孔細胞培養板中， 按Hoechst33342/PI 熒光染色試劑盒說明書操作， 各孔加入染色混合液（Hoechst33342 染液∶ PI 染液=1∶ 1）， 避光染色30 min。倒置熒光顯微鏡下觀察并拍照。Hoechst33342 染液可穿透細胞膜呈藍色， PI 染液不能穿透細胞膜，當細胞膜破損時，Hoechst33342染液增強呈強藍色熒光， PI 染液可以將細胞膜破損的細胞染為強紅色熒光［19］。以Hoechst33342 染液和PI 染液染色強度代表各組THP-1 巨噬細胞膜損傷程度。

1. 9 JC-1熒光染色法觀察各組THP-1巨噬細胞線粒體膜電位 將THP-1巨噬細胞接種于6孔細胞培養板中，按線粒體膜電位檢測試劑盒說明書操作，加入染色液避光染色30 min。倒置熒光顯微鏡下觀察并拍照， 細胞中紅色熒光為JC-1 聚合物熒光染色， 綠色熒光為JC-1 單體熒光染色。以紅色熒光強度代表THP-1 巨噬細胞線粒體膜電位。

1. 10 蛋白印跡法檢測各組 THP-1巨噬細胞中炎癥相關信號通路蛋白表達水平 收集 THP-1巨噬細胞并裂解細胞，提取總蛋白及核蛋白，煮沸變性后進行SDS-PAGE 電泳，采用PVDF 膜進行轉膜，封閉后，加入一抗，β-actin （1∶10 000）、COX-2（1∶1 000）、HMGB1（1∶1 000）、NLRP3（1∶1 000）、Caspase-1 （1： 1 000）、GSDMD-N （1∶ 1 000）、IL-1β（1∶1 000）、p-P38（1∶2 000）、P38（1∶1 000）、p-ERK （1∶ 2 000）、 ERK （1∶ 1 000）、 p-JNK（1∶1 000）、JNK （1∶1 000）、p-NF-κB （1∶1 000）、NF-κB （1∶ 1 000） 和Lamin B1 （1∶ 1 000） 孵育過夜。相應二抗稀釋（1∶1 000），室溫孵育1 h 后顯色， 采用Image J 軟件分析蛋白條帶灰度值，以β -actin 內參， 并計算目的蛋白表達水平。目的蛋白表達水平=目的蛋白條帶灰度值/內參蛋白條帶灰度值。實驗重復3 次。

1. 11 統計學分析 采用 GraphPad Prism8. 0統計軟件進行統計學分析。各組THP-1 巨噬細胞存活率、THP-1 巨噬細胞培養液中IL-6、TNF- α 和IL-1β 水平及THP-1 巨噬細胞中炎癥相關信號通路蛋白表達水平均符合正態分布， 以x±s 表示， 多組間樣本均數比較采用單因素方差分析，組間樣本均數兩兩比較采用獨立樣本t 檢驗。以Plt;0. 05 為差異有統計學意義。

2 結 果

2. 1 不同濃度LPS和BRPS處理后THP-1巨噬細胞存活率及細胞培養液中 IL-6水平 LPS濃度為100～2 000 μg·L-1 時， LPS 對THP-1 巨噬細胞不顯示細胞毒性，THP-1 巨噬細胞存活率均gt;90%。與0 μg·L-1 LPS 組比較，100、200、500、1 000 和2 000 μg·L-1 LPS 組THP-1 巨噬細胞培養液中IL-6水平均明顯升高（Plt;0. 05）， 提示巨噬細胞炎癥反應明顯增強。本研究選用100 μg·L-1 LPS 處理THP-1 巨噬細胞1 h 作為炎癥模型的建立條件。見表1。

12. 5、25. 0、50. 0、100. 0 和200. 0 mg·L-1BRPS 處理THP-1 巨噬細胞，THP-1 巨噬細胞存活率分別為91. 2%、93. 8%、91. 4%、90. 6% 和91. 8%，提示BRPS 對THP-1 巨噬細胞不顯示細胞毒性。因此，選取25. 0、50. 0和100. 0 mg·L-1 BRPS作為后續實驗中低、中及高劑量BRPS 組的藥物濃度。

2. 2 各組THP-1巨噬細胞培養液中IL-6、TNF-α和IL-1β水平 與空白組比較，模型組THP-1巨噬細胞培養液中IL-6、TNF-α 和IL-1β 水平均明顯升高（Plt;0. 05）。與模型組比較， 低、中和高劑量BRPS 組THP-1 巨噬細胞培養液中IL-6、TNF-α 及IL-1β 水平均明顯降低（Plt;0. 05）。見表2。

2. 3 各組THP-1巨噬細胞中ROS水平 與空白組（52. 68±2. 55） 比較， 模型組THP-1 巨噬細胞中ROS 水平（175. 02±11. 56） 明顯升高（Plt;0. 05）。與模型組比較， 低、中和高劑量BRPS 組THP-1 巨噬細胞中ROS 水平（166. 87±12. 32、136. 92±4. 30 和85. 91±10. 35） 均明顯降低（Plt;0. 05）。見圖1。

2. 4 各組THP-1巨噬細胞膜損傷情況 與空白組比較，模型組THP-1 巨噬細胞中Hoechst33342 染液和PI 染液染色增強， THP-1 巨噬細胞膜損傷程度明顯加重。與模型組比較，低、中和高劑量BRPS 組THP-1 巨噬細胞中Hoechst33342 染液和PI 染液染色減弱， THP-1 巨噬細胞膜損傷程度明顯減輕。見圖2。

2. 5 各組THP-1巨噬細胞線粒體膜電位 空白組JC-1 聚合物紅色熒光較強， JC-1 單體綠色熒光較弱， 提示THP-1 巨噬細胞線粒體膜電位較高。與空白組比較， 模型組THP-1 巨噬細胞線粒體跨膜電位明顯降低。與模型組比較， 低、中和高劑量BRPS 組THP-1 巨噬細胞線粒體跨膜電位逐漸升高。見圖3。

2. 6 各組THP-1巨噬細胞中COX-2和HMGB1蛋白表達水平 與空白組比較，模型組 THP-1巨噬細胞中COX-2 和HMGB1 蛋白表達水平均明顯升高（Plt;0. 05）。與模型組比較， 中劑量BRPS 組THP-1 巨噬細胞中HMGB1 蛋白表達水平和高劑量BRPS 組THP-1 巨噬細胞中COX-2 和HMGB1 蛋白表達水平均明顯降低（Plt;0. 05），低劑量BRPS組THP-1 巨噬細胞中COX-2 和HMGB1 蛋白表達水平和中劑量BRPS 組THP-1 巨噬細胞中COX-2蛋白表達水平差異均無統計學意義（Pgt;0. 05）。見圖4。

2. 7 各組 THP-1巨噬細胞中 NLRP3、Caspase-1、GSDMD-N 和 IL-1β 蛋白表達水平 與空白組比較，模型組THP-1 巨噬細胞中NLRP3、Caspase-1、GSDMD-N 和IL-1β 蛋白表達水平均明顯升高（Plt;0. 05）。與模型組比較， 低、中和高劑量BRPS 組THP-1 巨噬細胞中NLRP3、Caspase-1 和IL-1β 蛋白表達水平均明顯降低（Plt;0. 05）， 中和高劑量BRPS 組THP-1 巨噬細胞中GSDMD-N 蛋白表達水平均明顯降低（Plt;0. 05），低劑量BRPS 組THP-1巨噬細胞中GSDMD-N 蛋白表達水平差異無統計學意義（Pgt;0. 05）。見圖5。

2. 8 各組 THP-1巨噬細胞中 p-P38/P38、p-ERK/ERK、p-JNK/JNK和 p-NF-κB/NF-κB比值及 IL-1β蛋白表達水平 與空白組比較，模型組 THP-1巨噬細胞中p-P38/P38、p-ERK/ERK、p-JNK/JNK和p-NF- κB/NF- κB 比值均明顯升高（Plt;0. 05）。與模型組比較， 中和高劑量BRPS 組THP-1 巨噬細胞中p-P38/P38、p-ERK/ERK、p-JNK/JNK 和p-NF- κB/NF- κB 比值均明顯降低（Plt;0. 05）， 低劑量BRPS 組THP-1 巨噬細胞中p-P38/P38 、p-ERK/ERK 、p-JNK/JNK 和p-NF- κ B/NF- κ B 比值差異均無統計學意義（Pgt;0. 05）。見圖6 和7及表3。與對照組比較，LPS 組THP-1 巨噬細胞p-P38/P38、p-ERK/ERK、p-JNK/JNK 和p-NF-κB/NF-κB比值及IL-1β 蛋白表達水平均明顯升高（Plt;0. 05）。與LPS 組比較，抑制劑組、100 mg·L-1 BRPS 組和抑制劑+100 mg·L-1 BRPS 組THP-1 巨噬細胞中p-P38/P38、p-ERK/ERK、p-JNK/JNK和p-NF-κB/NF-κB 比值及IL-1β 蛋白表達水平均明顯降低（Plt;0. 05）。與抑制劑組比較， 抑制劑+100. 0 mg·L-1BRPS 組THP-1 巨噬細胞p-P38/P38、p-ERK/ERK、p-JNK/JNK 和p-NF-κB/NF-κB 比值均明顯降低（Plt;0. 05）。見圖8～11。

3 討 論

炎癥反應是免疫系統對于病原體、受損細胞和有毒化合物等有害刺激作出的防御反應，通過多種炎癥信號通路進行調節，以清除有害刺激維持機體平衡［20］。巨噬細胞在受到刺激后參與機體炎癥反應，誘導炎癥因子產生并釋放［9］。IL-1β 是IL-1 基因家族中典型的促炎因子， 可由LPS 直接刺激產生也可由TNF- α 誘導產生， 同時也可誘導IL-6、TNF-α 及其自身的分泌， 在炎癥反應中相互協調作用［21］。炎癥因子的大量釋放可引起COX-2 高表達［22］。同時， 產生的炎癥因子可促進HMGB1 與相應受體相互作用， 激活下游炎癥通路［23］。本研究結果顯示：BRPS 預處理后，THP-1 巨噬細胞中炎癥因子水平和COX-2 及HMGB1 蛋白表達水平降低，提示BRPS 可減少炎癥因子的釋放，從而降低炎癥反應。

ROS 主要來源于線粒體， 其產生不僅會誘導氧化應激，還可引發炎癥反應。線粒體功能發生障礙時， 可產生大量ROS， ROS 的釋放也可促進NLRP3 炎癥小體的激活［24-25］。NLRP3 炎癥小體組裝后，導致細胞焦亡的發生，同時IL-1β 可經受損的細胞膜釋放， 加重機體的炎癥反應［26］。本研究結果顯示：BRPS 預處理后可降低THP-1 巨噬細胞中ROS 水平、升高線粒體跨膜電位并減輕細胞膜損傷情況，降低THP-1 巨噬細胞中NLRP3 、Caspase-1、GSDMD-N 和IL-1β蛋白表達水平。提示BRPS 可減輕細胞氧化應激及炎癥反應，有效減輕細胞膜損傷情況，并抑制細胞炎癥小體活化及焦亡。

MAPK 和NF-κB 信號通路是經典的促炎信號通路，均可通過上調炎癥因子的合成，進而促進炎癥反應［27］。MAPK 主要包括P38、ERK 和JNK 共3 個亞家族， 可通過磷酸化調節炎癥因子的表達［28］。NF-κB 經典通路通常由LPS 等與細胞上的相關受體結合而介導活化，NF-κB 活化后進入細胞核內以調節下游靶基因的表達。研究［18］ 顯示：BRPS 可通過MAPK 和NF- κB 信號通路減輕RAW264. 7 巨噬細胞炎癥反應。本研究結果顯示：BRPS 降低THP-1 巨噬細胞中P38、ERK、JNK 和NF-κB 磷酸化水平，并通過MAPK 和NF-κB 通路抑制劑驗證具有相同結果，提示BRPS 抗炎作用可能與MAPK 和NF-κB 通路有關。

綜上所述， BRPS 可通過MAPK 和NF- κB 信號通路減輕LPS 誘導的THP-1 巨噬細胞炎癥反應，本研究結果為BRPS 的臨床應用提供了參考。

利益沖突聲明：所有作者聲明不存在利益沖突。

作者貢獻聲明：馬新月、刁佳雯和徐慧參與實驗數據獲取及分析，金愛花參與實驗設計和論文撰寫，全吉淑參與實驗設計和論文修改及審校。

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