濃縮生長因子聯合骨髓間充質干細胞膜片的生物學性能及其在骨缺損修復中的作用

［摘 要］ 目的：探討濃縮生長因子 （CGF） 對骨髓間充質干細胞 （BMSCs） 膜片性能的影響，并闡明含CGF復合細胞膜片（CS）在骨缺損修復中的作用。方法：體外實驗，選取2只3周齡SD大鼠，分離培養獲得BMSCs，茜素紅和油紅O 染色鑒定BMSCs 成骨和成脂能力。選取3 只3 周齡SD 大鼠，制備CGF 液態提取物（CGFe），將細胞分為對照組、傳統CS （BMSC-CS） 組和含CGF 復合CS （CGF/BMSC-CS） 組。HE 染色觀察2 組CS 形態表現，茜素紅和堿性磷酸酶（ALP） 染色檢測各組CS 體外成骨情況，細胞劃痕實驗檢測各組細胞遷移能力，實時熒光定量PCR （RT-qPCR） 法檢測各組細胞中ALP、膠原酶Ⅰ型（COL-1）、Runt 相關轉錄因子2 （RUNX2） 和骨鈣蛋白（OCN） mRNA 表達水平。體內實驗，選取15 只SD 大鼠隨機分為對照組、BMSC-CS 組和CGF/BMSC-CS 組，顯微計算機斷層掃描（Micro-CT） 檢測各組大鼠顱骨缺損處骨形成參數，HE 染色和Masson 染色觀察各組大鼠顱骨缺損組織形態表現。結果：第3代BMSCs為梭形，排列緊密，呈漩渦團簇狀生長；茜素紅染色有明顯的鈣結節生成，油紅O 染色有紅色脂滴形成，證實細胞具有良好的成骨和成脂分化的能力。CS 為白色半透明狀，邊緣輕微卷曲，剝離后的CS 卷曲皺縮為不規則狀。與BMSC-CS 組比較，CGF/BMSC-CS 組CS 白色更深，透明程度較低，在厚度和延展性方面明顯增加，不易破損，有一定黏性和可塑性。HE染色觀察，與BMSC-CS組比較，CGF/BMSC-CS 組CS 細胞數增加，排列密集，細胞外基質（ECM） 更豐富，包裹連接細胞形成一個整體的片狀結構。茜素紅和ALP 染色檢測，與對照組比較，BMSC-CS組CS的ALP 活性和礦化提升值均明顯升高（Plt;0. 05）；與對照組和BMSC-CS 組比較，CGF/BMSC-CS 組CS 成骨細胞及紅色礦化結節數明顯增多，染色明顯加深，陽性面積增大，ALP活性和礦化提升值均明顯升高（Plt;0. 05）。細胞劃痕實驗檢測，培養24 h，與對照組比較，BMSC-CS 組和CGF/BMSC-CS 組細胞遷移率均明顯升高（Plt;0. 05）； 與BMSC-CS 組比較， CGF/BMSC-CS 組細胞遷移率明顯升高（Plt;0. 01）；培養48 h，與對照組比較，CGF/BMSC-CS組細胞遷移率明顯升高（Plt;0. 05）。RT-qPCR 法檢測，與對照組比較，BMSC-CS 組細胞中COL-1 和OCN mRNA 表達水平均明顯升高（Plt;0. 01），CGF/BMSC-CS 組細胞中ALP、COL-1、OCN 和RUNX2 mRNA 表達水平均明顯升高（Plt;0. 01）；與BMSC-CS 組比較，CGF/BMSC-CS 組細胞中ALP、COL-1 和OCN mRNA 表達水平均明顯升高（Plt;0. 01）。Micro-CT 檢測，對照組大鼠顱骨缺損區域邊界清晰，幾乎無新骨生成；BMSC-CS 組大鼠顱骨僅在骨缺損邊緣有少量新骨形成，缺損中心區域有明顯空缺；CGF/BMSC-CS 組大鼠顱骨新骨沿骨缺損邊緣向中心區域生成， 修復大部分骨缺損； 與對照組比較， BMSC-CS 組大鼠顱骨骨體積分數［骨體積（BV） /組織體積（TV）］ 和骨小梁間距（Tb. N） 均明顯升高（Plt;0. 05），CGF/BMSC-CS 組大鼠顱骨BV、BV/TV、骨小梁數目（Tb. Th）和Tb. N均明顯升高（Plt;0. 05）；與BMSC-CS 組比較，CGF/BMSC-CS 組大鼠顱骨BV、BV/TV、Tb. Th 和Tb. N 均明顯升高（Plt;0. 01）。HE 和Masson 染色觀察，對照組大鼠顱骨缺損組織幾乎無新骨生成，僅見大量膠原纖維連接兩側骨斷端；BMSC-CS 組大鼠顱骨缺損組織僅在骨缺損邊緣有少量新骨形成，中央為致密的膠原纖維與缺損邊緣的新生骨連接；CGF/BMSC-CS 組大鼠顱骨缺損組織除在骨缺損邊緣可以看到新生骨組織外，缺損中央亦有骨島形成，骨島周圍可見骨細胞及大量的膠原纖維。Masson 染色觀察，細胞質和類骨質呈紅色，膠原呈藍色；CGF/BMSC-CS組大鼠顱骨缺損組織中可見明顯的新形成的類骨質，新骨形成量最高。結論：CGF可以促進BMSCs 膜片的成骨分化和ECM 的豐富度，含CGF 復合CS 可以高效修復大鼠顱骨缺損，是一種理想和安全的促骨再生材料。

［關鍵詞］ 濃縮生長因子； 細胞膜片； 骨髓間充質干細胞； 骨缺損再生修復

［中圖分類號］ R78 ［文獻標志碼］ A

近年來， 細胞膜片（cell sheet， CS） 技術被廣泛應用于骨缺損的再生修復， 其克服了傳統細胞用于組織工程時的缺點， 如胰酶消化造成的細胞外基質和細胞間連接蛋白減少、細胞存活率低及細胞活性不足等［1］。CS 包含大量種子細胞和細胞外基質（extracellular matrix， ECM）， ECM 作為內源性支架可以增加細胞生物活性，其緊密的片狀結構使細胞保存狀態完好，細胞存活率高且分布均勻，具有較好的黏附和增殖能力，從而提高了修復骨缺損的能力。目前，CS 技術已被用于修復關節軟骨、骨、牙周韌帶、角膜、血管和心肌的損傷［2-3］。骨髓間充質干細胞（bone marrow mesenchymal stem"cells， BMSCs） 因其易獲得性、增殖能力強和成骨分化效果好等優點，是最常用的種子細胞之一。AKAHANE 等［4］ 成功構建大鼠BMSCs 膜片， 植入大鼠皮下部位6 周后，在移植處發現礦化基質和活躍的成骨細胞，證實CS 的成骨性能良好。

生長因子在骨缺損再生中起著關鍵作用，將生長因子或小分子物質復合至膜片中可以提高其成骨能力。QI 等［5］ 將富血小板血漿（platelet-richplasma，PRP） /磷酸鈣（calcium phosphate，CaP）復合物作用于CS，證實其具有更強的促進骨缺損修復的能力。濃縮生長因子（concentrated growthfactor， CGF） 是繼PRP 和富血小板纖維蛋白（platelet rich fibrin，PRF） 之后第三代血小板濃縮物，是富含高濃度生長因子的自體纖維蛋白支架，有利于干細胞的附著［6］。CGF 可通過變速離心法制備，避免血液中的生長因子受到破壞并完全分離血液中的各種細胞成分，因此能夠獲得濃度極高的各種生長因子， 主要包括轉化生長因子β1（transforming growth factor-β1， TGF-β1）、表皮生長因子（epidermal growth factor，EGF）、骨形態發生蛋白（bone morphogenetic proteins，BMPs）、血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF） 和胰島素樣生長因子1 （insulin like growthfactor-1，IGF-1） 等，相關內源性生長因子具有協同效應和級聯效應，明顯影響細胞的增殖、分化和遷移［7-8］。本研究通過維生素C 誘導BMSCs 形成CS，即傳統CS （BMSC-CS），同時在成膜誘導過程中加入CGF，構建復合CS （CGF/BMSC-CS），分析2 種CS 的細胞活性、組織結構和體內外成骨能力， 探討CGF 對BMSCs 膜片生物學性能的影響，并闡明其在骨缺損再生修復應用中的潛能。

1 材料與方法

1. 1 實驗動物、主要試劑和儀器 5 只 2～3 周齡SD 大鼠，體質量50～100 g，15 只7～8 周齡SD 大鼠，體質量200～250 g，購自長春億斯實驗動物技術有限責任公司，實驗動物使用許可證號：SYXK（吉） 2023-0010。實驗動物飼養于吉林大學基礎醫學院動物房中，環境清潔，恒溫恒濕，定期消毒和通風，實驗前所有大鼠適應性喂養1 周。本研究經過吉林大學基礎醫學院動物倫理委員會批準（倫理審批號： 2022450）， 實驗過程均符合實驗室動物倫理準則。胎牛血清（fetal bovine serum， FBS）購自杭州四季青公司， 磷酸鹽緩沖液（phosphatebuffered saline，PBS） 購自美國Gibco公司，α-MEM培養基和DMEM 高糖培養基購自美國HyClone公司，抗壞血酸購自美國Sigma 公司，TRIzol 裂解液購自日本TaKaRa 公司。CGF 變速離心機購自北京創英科技有限公司， 超凈工作臺購自日本AIRTECH 公司，PCR 儀購自瑞士Roche 公司。

1. 2 大鼠 BMSCs分離、培養和鑒定 取 2只 3周齡SD 大鼠，頸椎脫臼法處死，75% 乙醇溶液浸泡10 min。剝去皮毛，取雙側股骨和脛骨，于超凈臺上剪除兩端骨骺端，用1 mL 無菌注射器吸取含1%雙抗和10% FBS 的α -MEM 培養基， 反復沖洗3 次，直至骨髓腔變白，收集骨髓沖出液，反復吹打使骨髓組織均勻分布。于37 ℃、5% CO2和100%飽和濕度環境細胞培養箱中靜置培養，培養48 h 待細胞貼壁完全后首次換液，以后每2～3 d 換液。約6～8 d 后細胞生長至培養皿80%～90%，進行傳代培養。取第3 代BMSCs，以2×106 mL-1的細胞密度接種于6孔細胞培養板中，含10% FBS 的α-MEM 培養基培養，至細胞生長至80% 融合時， 將培養基更換為含50 mg·L-1 維生素C、10 mmol·L-1 β-甘油磷酸鈉、10 nmol·L-1 地塞米松和10%FBS 的DMEM 高糖培養基成骨誘導液，成骨誘導21 d 后，PBS 緩沖液沖洗， 4% 多聚甲醛溶液固定30 min，1% 茜素紅染液染色3～5 min，倒置顯微鏡下觀察細胞成骨情況并拍照。更換成脂誘導液， 誘導3 周， PBS 緩沖液沖洗， 4% 多聚甲醛溶液固定30 min，油紅O 染色3～5 min，倒置顯微鏡下觀察脂滴形成情況并拍照。

1. 3 CGF液態提取物（CFG liguid extracts，CGFe）制備 3只3周齡SD大鼠，1%戊巴比妥鈉麻醉，腹主靜脈采血并置于變速離心機內離心，加速30 s，2 700 r·min-1、 2 min； 2 400 r·min-1、 4 min；2 700 r·min－1、4 min； 3 000 r·min-1、3 min， 減速36 s 后停止。離心后血液樣本分為3 層， 上層為PRP，中層為富含生長因子的淡黃色凝膠樣CGF，下層為紅細胞（red blood cell，RBC） 層。剪取中間凝膠層，PBS 緩沖液沖洗，-80 ℃冷凍1 h，解凍后于4 ℃ 下， 230 g 離心5 min， 然后加入5 mLα-MEM 培養基，37 ℃孵育24 h，400 g 離心5 min。收集5 mL 上清液， 0. 22 μm 過濾器過濾， 作為CGFe［9］。根據HONDA 等［10］ 的研究方法， 選擇促進BMSCs 成骨分化的最佳濃度10% CGFe 進行后續實驗。

1. 4 細胞分組和培養 選擇第 3 代 BMSCs，以2×106 mL-1 的細胞密度接種于6 孔細胞培養板中。將細胞分為對照組、BMSC-CS 組和CGF/BMSCCS組。待細胞密度達到70%～80% 時，對照組僅用高糖DMEM 培養基培養， BMSC-CS 組更換為含100 mg·L-1維生素C 和10% FBS 的高糖DMEM培養基成膜誘導液， CGF/BMSC-CS 組加入含10%CGF 的成膜誘導液， 每2～3 d 換液， 連續培養14 d，孔底可見白色膜片形成，用細胞刮刀小心獲取完整膜片用于后續實驗。

1. 5 HE染色觀察 2組 CS形態表現 CS成熟后，吸棄培養液，獲取完整膜片，PBS 緩沖液沖洗3 次，4% 多聚甲醛固定4 h， PBS 緩沖液再次沖洗3 次，掃描記錄其大體形態。隨后常規脫水，石蠟包埋，組織學切片，HE 染色，于光學顯微鏡下觀察2 組CS 形態表現并記錄。

1. 6 茜素紅和堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）染色檢測各組 CS 體外成骨情況 獲取 CS，PBS 緩沖液沖洗3 次， 4% 多聚甲醛固定30 min，PBS 緩沖液再次沖洗3 次， 分別進行茜素紅和ALP 染色， 顯微鏡下觀察各組CS 體外成骨情況，采用Image J 軟件分析吸光度（A） 值， 計算各組CS 礦化提升值和ALP 活性。礦化提升值= 茜素紅染色實驗孔A 值/茜素紅染色對照孔A 值；ALP活性=ALP 染色實驗孔A 值/ALP 染色對照孔A 值。

1. 7 細胞劃痕實驗檢測各組細胞遷移能力 在6孔細胞培養板底部等間距畫出3 條平行直線，將P3 代BMSCs 消化后，均勻接種至6 孔細胞培養板，每孔5×105個，置于細胞培養箱內培養；當細胞長滿孔底時，用200 μL 滅菌槍頭沿標記劃直線，PBS 緩沖液小心沖洗后更換為成膜培養基，0、24 和48 h 后觀察拍照， 采用Image J 軟件檢測細胞遷移面積，計算各組細胞遷移率，代表各組細胞遷移能力。細胞遷移率= （0 h 劃痕面積-24 h 或48 h 劃痕面積） /0 h 劃痕面積×100%。

1. 8 實 時 熒 光 定 量 PCR（real-time fluorescencequantitative PCR，RT-qPCR）法檢測各組細胞中ALP、膠 原 酶 Ⅰ 型（collegenase type 1，COL-1）、Runt 相 關 轉 錄 因 子 2（runt-related transcriptionfactor 2，RUNX2）和骨鈣蛋白（osteocalcin，OCN）mRNA 表達水平 分別提取各組細胞總 RNA，DEPC 水溶解， Nanodrop 測定RNA 濃度， 逆轉錄為cDNA， SYBR 法擴增， 以GAPDH 作為內參，采用2—ΔΔCt 法計算各組細胞中成骨相關因子ALP、COL-1、RUNX2 和OCN mRNA 表達水平， 至少3 次獨立重復實驗。引物序列見表1。

1. 9 大鼠顱骨缺損模型制備和膜片植入 15 只7～8 周齡SPF 級雄性SD 大鼠，體質量（250±25）g，隨機分為對照組、BMSC-CS組和CGF/BMSC-CS組，每組5 只。清潔環境飼養，自由進食和飲水，定期環境消毒。腹腔注射2% 戊巴比妥鈉麻醉大鼠，仰臥位固定大鼠四肢， 脫去頭部毛發， 消毒頭皮部位，鋪巾完畢，在無菌條件下利用手術刀片沿顱中縫作長約2 cm 的縱形切口，切開皮膚、皮下組織、肌層和骨膜層，鈍性分離暴露顱骨骨板，建造全層圓形缺損，不損傷硬腦膜。用外科電動空心環鉆于顱骨制備直徑為5 mm、厚度為1 mm 的全層圓形骨缺損，操作過程中利用生理鹽水持續沖洗。對照組大鼠不放置任何材料， 其余2 組大鼠放置等量BMSC-CS 和CGF/BMSC-CS，填充整個圓形骨缺損區，對位縫合傷口。

1. 10 顯 微 計 算 機 斷 層 掃 描（micro-computedtomography，Micro-CT）檢測各組大鼠顱骨缺損處骨形成參數 術后6周處死大鼠，10%多聚甲醛固定48 h。進行Micro-CT 掃描， 三維重建。選擇所制備的5 mm×1 mm 顱骨缺損區為感興趣區域（region of interest， ROI） 進行掃描， 獲取各組大鼠顱骨骨體積（bone volume， BV）、骨體積分數［BV/組織體積（tissue volume，TV）］、骨小梁數目（trabecular number， Tb. N） 和骨小梁間距（trabecular thickness，Tb. Th）。

1. 11 HE 染色和 Masson 染色觀察各組大鼠顱骨缺損組織形態表現 將大鼠顱骨標本使用 EDTA脫鈣50 d，石蠟包埋，制備成5 μm 厚的切片。HE 染色，光學顯微鏡下觀察并采集圖像，觀察新生骨組織形態表現。Masson 染色，切片按照Masson 染液套裝說明書進行操作，封片，倒置相差顯微鏡下觀察骨組織形態表現并采集圖像。

1. 12 統計學分析 采用 GraphPad Prism 9. 0統計軟件進行統計學分析。各組CS 礦化提升值和ALP 活性，各組細胞遷移率和BMSC-CS及CGF/BMSC-CS成骨相關基因mRNA 表達水平， 各組大鼠顱骨缺損處骨形成參數均符合正態分布，以x±s 表示，多組間樣本均數比較采用單因素方差分析，組間樣本均數兩兩比較采用Student’s t 檢驗。以Plt;0. 05 為差異有統計學意義。

2 結 果

2. 1 大鼠BMSCs鑒定 倒置顯微鏡下可見第3代BMSCs 為梭形， 排列緊密， 呈漩渦團簇狀生長；茜素紅染色有明顯的鈣結節生成，油紅O 染色有紅色脂滴形成，證實細胞具有良好的成骨和成脂分化的能力。見圖1。

2. 2 2組 CS形態表現 CS為白色半透明狀，邊緣輕微卷曲， 剝離后的CS 卷曲皺縮為不規則狀。與BMSC-CS 組比較， CGF/BMSC-CS 組CS 白色更深，透明程度較低，在厚度和延展性方面明顯增加，不易破損，有一定黏性和可塑性。HE 染色結果顯示：與BMSC-CS 組比較，CGF/BMSC-CS 組CS 細胞數增加，排列密集，ECM 更豐富，包裹連接細胞形成一個整體的片狀結構。見圖2 和3。

2. 3 各組 CS 體外成骨情況 與對照組比較 ，BMSC-CS 組CS 的ALP 活性和礦化提升值均明顯升高（Plt;0. 05）。與對照組和BMSC-CS 組比較，CGF/BMSC-CS 組CS 的成骨細胞及紅色礦化結節數明顯增多，染色明顯加深，陽性面積增大，ALP 活性和礦化提升值均明顯升高（Plt;0. 05）。見圖4～7和表2。

2. 4 各組細胞遷移率 培養24 h，與對照組比較，BMSC-CS 組和CGF/BMSC-CS 組細胞遷移率均明顯升高（Plt;0. 05）； 與BMSC-CS 組比較， CGF/BMSC-CS 組細胞遷移率明顯升高（Plt;0. 01）。培養48 h，與對照組比較，BMSC-CS 組細胞遷移率升高， 但差異無統計學意義（Pgt;0. 05）， CGF/BMSC-CS 組細胞遷移率明顯升高（Plt;0. 05）；與BMSC-CS 組比較，CGF/BMSC-CS 組細胞遷移率升高， 但差異無統計學意義（Pgt;0. 05）。見圖8和表3。

2. 5 各 組 細 胞 中 ALP、COL-1、Runx2 和 OCNmRNA 表達水平 與對照組比較，BMSC-CS 組細胞中COL-1 和OCN mRNA 表達水平均明顯升高（Plt;0. 01），ALP 和RUNX-2 mRNA 表達水平升高，但差異均無統計學意義（Pgt;0. 05）；CGF/BMSC-CS 組細胞中ALP、COL-1、OCN 和RUNX-2 mRNA 表達水平均明顯升高（Plt;0. 01）。與BMSC-CS 組比較， CGF/BMSC-CS 組細胞中ALP、COL-1 和OCN mRNA 表達水平均明顯升高（Plt;0. 01）， RUNX-2 mRNA 表達水平升高， 但差異無統計學意義（Pgt;0. 05）。見表4。

2. 6 各組大鼠顱骨缺損處骨形成參數 對照組大鼠顱骨缺損區域邊界清晰， 幾乎無新骨生成；BMSC-CS 組大鼠顱骨僅在骨缺損邊緣有少量新骨形成， 缺損中心區域有明顯空缺； CGF/BMSCCS組大鼠顱骨新骨沿骨缺損邊緣向中心區域生成，修復大部分骨缺損。與對照組比較，BMSC-CS 組大鼠顱骨BV/TV 和Tb. N 均明顯升高（Plt;0. 05），BV 和Tb. Th 升高， 但差異無統計學意義（Pgt;0. 05），CGF/BMSC-CS 組大鼠顱骨BV、BV/TV、Tb. Th 和Tb. N 均明顯升高（Plt;0. 05）。與BMSC-CS 組比較， CGF/BMSC-CS 組大鼠顱骨BV、BV/TV、Tb. Th 和Tb. N 均明顯升高（Plt;0. 01）。見圖9 和表5。

2. 7 各組大鼠顱骨缺損組織形態表現 選取骨缺損邊緣略靠近中間部位進行放大， 兩側為骨缺損邊緣， 中心為骨缺損區域。HE 染色觀察可見，對照組大鼠顱骨缺損組織幾乎無新骨生成， 僅見大量膠原纖維連接兩側骨斷端；BMSC-CS 組大鼠顱骨缺損組織僅在骨缺損邊緣有少量新骨形成，中央為致密的膠原纖維與缺損邊緣的新生骨連接；CGF/BMSC-CS 組大鼠顱骨缺損組織除在骨缺損邊緣可以看到新生骨組織外， 缺損中央亦有骨島形成， 骨島周圍可見骨細胞及大量的膠原纖維。Masson 染色可見細胞質和類骨質呈紅色， 膠原呈藍色。CGF/BMSC-CS 組大鼠顱骨缺損組織中可見明顯的新形成的類骨質， 新骨形成量最高。見圖10 和11。

3 討 論

CS 是一種新型培養和獲取細胞的方法，而機械法是目前制備干細胞膜片最簡單的一種方法［2，11］。CS 可以保留一個相對完整的ECM，從而通過旁分泌作用促進周圍細胞的生長和增殖［12］。同時ECM 儲存了大量生長因子和功能性蛋白，參與細胞與細胞和細胞與組織之間的信號傳遞，提供并維持細胞微環境，對細胞功能至關重要。CS 是一種具有發展前景的基于細胞的治療方法，在骨組織修復中發揮關鍵作用［13-14］。然而，傳統的細胞膜片存在細胞分化能力不足、可塑性差和成骨能力欠缺等缺點，尤其是由于缺乏可靠的血液供應，無法滿足大面積骨缺損的再生修復［15-16］。因此， 提高CS 的均勻性，促進微血管網絡的形成和ECM 的發展是CS 制備的主要目標［17-18］。

研究［19］ 顯示： 10% CGF 能明顯促進BMSCs的增殖和成骨分化。本研究采用10% CGFe 作用于細胞， 促進BMSCs 增殖、成骨向分化和ECM 分泌， 彌補傳統CS 的不足。本研究結果顯示： 與BMSC-CS 組比較， CGF/BMSC-CS 組CS 在韌性及厚度方面更有優勢，方便獲取緊密連接的完整膜片，含有更多數量的細胞，ECM 更加豐富，加強了細胞與細胞的連接及信號通路作用。同時豐富的ECM 包裹細胞連成一個整體結構，為細胞的生長、增殖和分化提供良好的支架，有利于細胞與細胞之間的相互作用。

ALP 作為成骨細胞分化的標志物， 最先出現于細胞礦化的早期階段，可作為早期成骨標志物，鈣鹽水平代表了骨細胞增殖、分化和骨組織的成骨潛能， 因此采用ALP 染色和茜素紅染色分別評價早期和晚期成骨作用［19-20］。本研究中茜素紅和ALP染色結果顯示： CGF/BMSC-CS 組成骨細胞及鈣化結節數最多，提示其成骨能力較強。與BMSCCS組比較，CGF/BMSC-CS 組ALP 活性和礦化提升值明顯升高，提示CGF 在整個成骨過程中均促進了BMSCs 的成骨分化，維持了成骨誘導的連續性。細胞劃痕實驗結果顯示： CGF 可以有效促進BMSCs 的增殖和遷移，提高細胞的再生修復作用。CGF/BMSC-CS 通過上調成骨相關基因ALP、COL-1、OCN 和RUNX-2 mRNA 表達， 促進BMSCs 的增殖和成骨分化，其中對ALP 的上調作用最為明顯，可能是由于豐富的ECM 提供了良好的成骨微環境。

三維重建圖和HE 及Masson 染色結果顯示：CGF/BMSC-CS 組大鼠顱骨缺損處新骨不僅沿骨缺損邊緣形成， 同時在缺損中心區域也有新骨單獨形成。一般情況下， 誘導骨形成的細胞主要來源于骨缺損區的邊緣， 新骨主要從骨缺損周圍逐漸向中心發展［21］。本研究結果顯示： CGF/BMSC-CS 組大鼠顱骨缺損處形成了不與缺損邊緣相連的新骨， 提示CGF 不僅促進BMSCs 的成骨向分化，同時也促進BMSCs 生成新骨并促進新骨成熟。本研究結果顯示：CGF/BMSC-CS 組CS 對新生骨形成和成熟均具有促進作用， CGF/BMSC-CS 組大鼠顱骨缺損組織新生骨周圍也存在新生血管， CGF 中包含CD34 陽性細胞及VEGF、堿性成纖維細胞生長因子（basic fibroblast growthfactor， bFGF）、基 質 金 屬 蛋 白 酶（matrixmetalloproteinase， MMP）-2 和MMP-9 等多種血管生成生長因子， 可以刺激受損血管生成， 為組織再生提供足夠的營養、生長因子、礦物質和氧，血液的供應有利于成骨，證實CGF 具有指導骨再生和促進局部血管化的雙重作用， 在一定程度上彌補了傳統CS 因缺乏血液供應導致的骨再生能力不足［22-24］。

研究［25］ 顯示：CGF 中IGF-1 可以促進軟骨細胞ECM 的合成。本研究結果顯示：ECM 豐度升高提示CGF 可能通過IGF-1 促進BMSCs 的ECM 合成；同時ECM 蛋白可結合并儲存CGF 釋放出的生長因子，調節其在細胞中的分布、激活和呈遞，達到長期的效果。此相互作用可能是CGF/BMSCCS表現出良好成骨能力的原因之一。

綜上所述， CGF 可以提供細胞增殖和分化所需的因子，促進ECM 分泌，CGF/BMSC-CS 復合膜片具有適宜的厚度，增強了可塑性，且細胞成骨向分化明顯，細胞狀態良好，ECM 豐富，同時具備了較強的骨再生能力，是一種理想和安全的促骨再生材料。

利益沖突聲明：所有作者聲明不存在利益沖突。

作者貢獻聲明：石劍虹參與文獻檢索、實驗設計、實驗操作、數據整理和論文撰寫，田原野、陳楷、孫高和吳國民參與文獻檢索及論文審校。

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