趨化因子CCL19 誘導巨噬細胞M1 極化對小鼠慢性胰腺炎的促進作用及其機制

［摘 要］ 目的：探討趨化因子C-C基序配體19（CCL19） 誘導巨噬細胞M1極化對小鼠慢性胰腺炎的促進作用，并闡明其相關機制。方法：選取10只雄性C57BL/6N小鼠，提取小鼠胰腺腺泡細胞和腹腔巨噬細胞，構建巨噬細胞-腺泡細胞共培養體系，共培養體系細胞分為對照組、模型組和小干擾RNA CCL19 （si-CCL19） 組，顯微鏡下觀察各組腺泡細胞形態表現。隨機選取40 只小鼠，分為正常組和慢性胰腺炎組，每組20 只。HE 染色觀察2 組小鼠胰腺組織病理形態表現，免疫熒光染色法觀察2 組小鼠胰腺組織中角質蛋白19 （CK19）、淀粉酶、M1 型巨噬細胞相關標志物誘導型一氧化氮合酶（iNOS） 和F4/80 表達情況及各組共培養體系細胞中腺泡細胞形態表現及CK19 和淀粉酶表達情況，酶聯免疫吸附試驗（ELISA） 法檢測2 組小鼠血清和各組共培養體系細胞中腫瘤壞死因子α （TNF-α）、白細胞介素（IL）-6 和IL-1β 水平， 免疫組織化學法觀察2 組小鼠胰腺組織中CCL19 蛋白表達情況，Western blotting 法檢測2 組小鼠胰腺組織和各組共培養體系細胞中CCL19 蛋白和關鍵蛋白核因子κB（NF- κB） 信號通路相關蛋白P65、磷酸化P65 （p-P65）、κB 抑制物激酶α/β （IKKα/β）、磷酸化IKKα/β（p-IKKα/β）、IκBα和磷酸化IκBα（p-IκBα） 表達水平。結果：HE染色，正常組小鼠胰腺組織腺泡細胞的緊密排列；與正常組比較，慢性胰腺炎組小鼠胰腺組織腺泡細胞產生了明顯的空泡化，即腺泡細胞導管化，小鼠胰腺炎模型制備成功。免疫熒光染色法，與對照組比較，模型組腺泡細胞嚴重的空泡化明顯，CK19 表達明顯增加，淀粉酶表達明顯減少；與模型組比較，si-CCL19 組中腺泡細胞導管化程度降低，CK19 表達明顯減少，淀粉酶表達明顯增加；與正常組比較，慢性胰腺炎組小鼠胰腺組織中淀粉酶表達明顯減少， CK19 和M1 型巨噬細胞標志物iNOS 及F4/80 表達均明顯增加。ELISA 法， 與正常組比較， 慢性胰腺炎組小鼠血清中TNF-α、IL-6 和IL-1β 水平均明顯升高（Plt;0. 05）；與對照組比較，模型組細胞中TNF-α、IL-6 和IL-1β 水平均明顯升高（Plt;0. 05）；與模型組比較，si-CCL19 組細胞中TNF-α、IL-6 和IL-1β 水平均明顯降低（Plt;0. 05）。免疫組織化學法，與正常組比較，慢性胰腺炎組小鼠胰腺組織中CCL19 蛋白表達明顯增加。Western blotting 法，與正常組比較，慢性胰腺炎組小鼠胰腺組織中CCL19 蛋白表達水平和NF-κB 信號通路相關蛋白p-IKKα/β、p-P65及p-IκBα 蛋白表達水平均明顯升高（Plt;0. 05）。與對照組比較，模型組細胞中CCL19、p-IKKα/β、p-P65和p-IκBα 蛋白表達水平均明顯升高（Plt;0. 05）；與模型組比較，si-CCL19 組細胞中CCL19、p-IKKα/β、p-P65和p-IκBα蛋白表達水平均明顯降低 （Plt;0. 05）。結論：CCL19通過NF-κB信號通路促進巨噬細胞M1 型極化，誘導炎癥微環境的產生，促進胰腺炎的發生發展。

［關鍵詞］ 胰腺炎； C-C 基序配體19； 巨噬細胞； M1 型極化； 核因子κB

［中圖分類號］ R364. 5 ［文獻標志碼］ A

胰腺是體內僅次于肝臟的第二大腺體，由內分泌部和外分泌部組成，外分泌部主要由腺泡細胞和導管細胞構成。腺泡細胞可以產生和釋放大量消化酶，包括淀粉酶和脂肪酶等，這些消化酶經過胰腺導管輸送至十二指腸，對機體消化過程發揮重要作用。在胰腺炎過程中，一部分胰腺腺泡細胞發生形態學改變，轉變為管狀結構，成為導管細胞，不再表達腺泡細胞標記物，但在治療后胰腺導管細胞同樣具有向腺泡細胞轉化的潛能［1］。慢性胰腺炎是由多種病因導致的，胰酶在胰腺內被過度激活后引起胰腺組織自身消化、水腫、出血甚至壞死的炎癥反應［2］。

免疫微環境是炎癥微環境的重要組成部分，免疫微環境的改變是導致炎癥產生的主要因素，其中巨噬細胞是免疫微環境的重要組成部分［3］。研究［4］顯示：巨噬細胞的M1 型極化會通過分泌白細胞介素（interleukin， IL）-1β、IL-6 和腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α） 等炎癥因子促進炎癥的產生。核因子κB （nuclear factor-kappa B，NF-κB） 信號通路，即NF- κB/κB 抑制物激酶α/β（inhibitor of κB kinase-α/β， IKKα/β） /磷酸化IKKα/β（phosphorylated IKKα/β， p-IKKα/β） /P65/磷酸化P65 （phosphorylated P65， p-P65） /IκBα/磷酸化IκBα （phosphorylated IκBα， p-IκBα）， 其調控巨噬細胞炎癥反應，是巨噬細胞M1 型極化的重要信號通路［5］。C-C基序配體19（C-C motif ligand 19，CCL19）是CC 類趨化因子家族成員，又稱為巨噬細胞炎性蛋白3β，是內環境穩定性趨化因子。其主要由中性粒細胞、淋巴內皮細胞和淋巴結Ｔ淋巴細胞釋放，趨化幼稚T 淋巴細胞和成熟樹突細胞（dendriticcells，DC）［6］。CCL19 在慢性胰腺炎中對免疫微環境具體的調控機制尚未完全闡明。因此，本研究探討CCL19 對NF-κB 信號通路的調節作用，闡明其誘導巨噬細胞M1 型極化促進胰腺炎發生的作用機制，為慢性胰腺炎的臨床治療提供參考。

1 材料與方法

1. 1 實驗動物、主要試劑和儀器 雄性C57BL/6N小鼠50 只，購自遼寧長生生物技術股份有限公司，實驗動物生產許可證號：SCXK （遼） 2020-0001。RPMI-1640 培養基、Waymouth 培養基、胎牛血清和RIPA 緩沖液購自北京Biosharp 公司， NewSuper ECL 檢測試劑盒購自北京百歐泰生物科技有限公司，兔抗CCL19 多克隆抗體、兔抗p-IKKα/β多克隆抗體、兔抗IKKα/β 多克隆抗體、兔抗p-P65多克隆抗體、兔抗P65 多克隆抗體、兔抗p-IκBα 多克隆抗體、兔抗CCL19 多克隆抗體和兔抗GAPDH多克隆抗體購自英國Abcam 公司， 小干擾RNACCL19 （small interfering RNA CCL19，si-CCL19）購自廣東省廣州銳博生物有限公司， 即用型HRP標記的羊抗兔二抗購自北京欣博盛生物科技有限公司，TNF-α、IL-6 和IL-1β 細胞因子酶聯免疫吸附試驗（enzyme-linked immunosorbent assay， ELISA）檢測試劑盒購自廣東省深圳康肽生物科技有限公司，熒光標記DAPI 購自北京索萊寶科技有限公司，IκBα一抗、 免疫熒光兔抗角質蛋白19（ cytokeratin 19，CK19） 多克隆抗體、兔抗Amylase 多克隆抗體、兔抗F4/80 多克隆抗體、兔抗誘導型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS） 多克隆抗體、Alexa Fluo488 山羊抗兔二抗和Rhodamine 山羊抗兔二抗購自美國Proteintech 公司，免疫組織化學試劑購自青島海氏海諾醫療科技有限公司，其他生化試劑均為進口分裝或國產分析純。低溫高速離心機和-80°C 冰箱購自美國Thermo 公司，酶標儀購自美國Bio-Tek 公司，倒置相差顯微鏡和倒置熒光顯微鏡購自日本Olympus 公司，電泳儀購自北京六一有限公司。

1. 2 小鼠胰腺腺泡細胞和腹腔巨噬細胞提取 提取胰腺腺泡細胞： 胰蛋白酶抑制劑加入1% 青-鏈霉素雙抗和血清培養基混勻，磷酸二氫鉀溶液、丙酮酸鈉和1% 青-鏈霉素雙抗消化液備用。取5 只小鼠，脫臼處死，置于75% 乙醇溶液浸泡，立即切取小鼠胰腺組織，磷酸鹽緩沖液（phosphate bufferedsaline，PBS） 洗滌2 次，置于消化液中剪碎消化20 min。吸取上清液至離心管中， 皿中加入消化液，二次消化。吸出所有消化液，加入含大豆酶抑制劑的Waymouth 培養基終止消化， 1 720 r·min－1離心2 min， 棄上清液， 加入培養基， 重復離心1 次，棄上清。乙酸溶液中里加入鼠尾膠原后，加入到培養皿中，沖洗內壁。紫外照射放置1 h，PBS 緩沖液沖洗2 次，獲得胰腺腺泡細胞，吸取培養液并加入新的培養基培養。提取腹腔巨噬細胞： 取5 只小鼠， 脫臼處死，置于75% 乙醇溶液中浸泡， 切開小鼠腹腔， 后用鑷子夾起腹膜， 吸取冷PBS 和酶緩沖液注入至腹腔中灌洗，手指揉小鼠腹部，用鑷子夾起腹膜再用針管吸出灌洗液，灌洗液中含有的巨噬細胞即為被采集的腹腔巨噬細胞。

1. 3 小鼠胰腺腺泡細胞與巨噬細胞共培養體系制備和分組 采用巨噬細胞-腺泡細胞共培養體系，Transwell 小室培養， 下室為巨噬細胞， 上室為腺泡細胞。共培養體系分為對照組、模型組和si-CCL19 組， 對照組下室的巨噬細胞為未極化的原代巨噬細胞，模型組下室的巨噬細胞為40 μg·L－1γ 干擾素（interferon-γ，IFN-γ） 和400 μg·L－1 脂多糖（lipopolysaccharide， LPS） 誘導的與炎癥發展密切相關的M1 型巨噬細胞， si-CCL19 組下室為M1 型巨噬細胞并轉染si-CCL19，3 組培養體系的上室均為提取的原代腺泡細胞［7］。按照參考文獻［8］中方法培養腺泡細胞。共培養體系中的細胞制備結束后，加入RPMI-1640 培養基，孵育18 h，顯微鏡觀察腺泡細胞形態表現。

1. 4 小鼠胰腺炎模型制備 選取 40 只體質量為20～22 g 的C57BL/6N 小鼠， 分為正常組和慢性胰腺炎組， 每組20 只。慢性胰腺炎組小鼠腹腔注射雨蛙素50 μg·kg－1 誘導小鼠胰腺炎模型，每周給藥3 d，每日6 次，每次間隔1 h；正常組小鼠注射同等次數和劑量的生理鹽水，至第4 周造模結束，處死小鼠后解剖，取出小鼠胰腺組織［9］。顯微鏡下觀察胰腺炎模型小鼠胰腺組織導管化情況和CK19和淀粉酶表達情況，判定小鼠胰腺炎模型制備情況。

1. 5 HE 染色觀察 2組小鼠胰腺組織病理形態表現 小鼠胰腺組織石蠟切片脫蠟后， 蘇木素染色3～8 min，自來水沖洗，于1% 鹽酸乙醇溶液分化數秒， 自來水沖洗， 0. 6% 氨水返藍， 流水沖洗，伊紅染色1～3 min。切片脫水，中性樹膠封片，顯微鏡觀察2 組小鼠胰腺組織病理形態表現。

1. 6 免疫熒光染色法觀察 2 組小鼠胰腺組織中CK19、淀粉酶、iNOS和F4/80表達情況及各組共培養體系細胞中腺泡細胞形態表現及CK19和淀粉酶表達情況 小鼠胰腺組織石蠟切片脫蠟后進行抗原修復，置于抗原修復液體中，放入微波爐，中火處理30 min。冷卻至室溫后，回收抗原修復液。加入3% 過氧化氫溶液浸泡10 min， 沖洗。5% 山羊抗兔血清封閉， 水洗。加入兔抗CK19 一抗、兔抗Amylase 一抗、兔抗F4/80 一抗和兔抗iNOS 一抗，室溫孵育2 h。回收一抗， PBS 緩沖液洗滌3 次。孵育山羊抗兔二抗，置于室溫避光1 h，回收二抗，使用PBS 緩沖液沖洗。DAPI 染色5 min 后沖洗，顯微鏡觀察2 組小鼠胰腺組織中CK19、淀粉酶、iNOS 和F4/80 免疫熒光強度及各組共培養體系細胞中腺泡細胞形態表現及CK19 和淀粉酶免疫熒光強度。

1. 7 ELISA法檢測 2組小鼠血清和各組共培養體系細胞中TNF-α、IL-6和IL-1β水平 取2組小鼠血清，根據試劑盒說明書操作，檢測2 組樣本中炎癥因子TNF-α、IL-6 和IL-1β 水平。酶標儀檢測波長450 nm 處各樣本吸光度（A） 值，繪制標準曲線，計算2 組小鼠血清和各組共培養體系細胞中TNF-α、IL-6 和IL-1β 水平。

1. 8 免疫組織化學法觀察 2 組小鼠胰腺組織中CCL19 蛋白表達情況 小鼠胰腺組織石蠟切片脫蠟后抗原修復， 血清封閉， 水洗。加入兔抗CCL19 一抗孵育1. 5 h。PBS 緩沖液洗滌3 次， 孵育山羊抗兔二抗，置于室溫30 min，蘇木素染色。將復染后切片置于水中， 沖洗后脫水， 中性樹膠封片。顯微鏡觀察2 組小鼠胰腺組織中CCL19 蛋白表達情況。

1. 9 Western blotting 法檢測 2 組小鼠胰腺組織和各組共培養體系細胞中CCL19蛋白及NF-κB信號通路相關蛋白表達水平 將巨噬細胞和小鼠胰腺組織于RIPA 緩沖液中裂解，細胞置于冰上快速充分研磨1 min，胰腺組織于液氮中取出后，置于破碎機研磨充分破碎。冰上放置15 min。置于4 ℃、11 000 r·min－1 離心15 min， 吸上清于新的離心管中。加入含β-巰基乙醇的上樣緩沖液； 置于95 ℃的金屬浴模塊中加熱變性10 min。制備10%SDS-PAGE 濃縮膠和分離膠進行電泳操作。使用聚偏二氟乙烯膜于300 mA 電流條件下進行轉膜。TBST 溶液洗膜，脫脂牛奶封閉，兔抗CCL19 一抗（1∶ 1 000）、兔抗p-IKKα/β 一抗（1∶ 1 000）、兔抗IKKα/β 一抗（1∶ 1 000）、兔抗p-P65 一抗（1∶1 000）、兔抗P65 一抗（1∶1 000）、兔抗p-IκBα一抗（1∶ 1 000）、兔抗GAPDH 一抗（1∶ 1 000）和兔抗IκBα 一抗（1∶ 1 000）， 室溫孵育2 h 后回收， 再用TBST 溶液清洗3 次， 加入即用型HRP標記的羊抗兔二抗。孵育1h 后回收清洗。配制顯影液，均勻灑在PVDF 膜上，將膜置于顯影儀中顯影， 采用Image J 軟件分析蛋白條帶灰度值， 以GAPDH 為內參，計算目的蛋白表達水平。目的蛋白表達水平=目的蛋白條帶灰度值/內參蛋白條帶灰度值。

1. 10 統計學分析 采用GraphPad Prism 7. 0 統計軟件進行統計學分析。2 組小鼠血清和各組共培養體系細胞中TNF-α、IL-6 及IL-1β 水平，CCL19 蛋白和NF-κB 信號通路相關蛋白表達水平均符合正態分布，以x±s 表示。2 組間樣本均數比較采用兩獨立樣本t 檢驗。以Plt;0. 05 為差異有統計學意義。

2 結 果

2. 1 2組小鼠胰腺組織病理形態表現 正常組小鼠胰腺組織腺泡細胞緊密排列。與正常組比較，慢性胰腺炎組小鼠胰腺組織腺泡細胞產生了明顯的空泡化，即腺泡細胞導管化，小鼠胰腺炎模型制備成功。見圖1。

2. 2 各組 M1極化巨噬細胞-腺泡細胞共培養體系中腺泡細胞形態表現和細胞中 CK19 和淀粉酶表達情況 熒光顯微鏡下，綠色熒光強度代表CK19的表達，紅色熒光強度代表淀粉酶的表達。與對照組比較， 模型組腺泡細胞嚴重的空泡化明顯，CK19 表達明顯增加，淀粉酶表達明顯減少。與模型組比較， si-CCL19 組中腺泡細胞導管化程度降低， CK19 表達明顯減少， 淀粉酶表達明顯增加。見圖2～5。

2. 3 2組小鼠胰腺組織中 CK19、淀粉酶、iNOS和F4/80表達情況 與正常組比較，慢性胰腺炎組小鼠胰腺組織中淀粉酶表達明顯減少，CK19 和M1 型巨噬細胞標志物iNOS 及F4/80 表達均明顯增加。見圖6 和7。

2. 4 2 組 小 鼠 血 清 和 各 組 共 培 養 體 系 細 胞 中TNF-α、IL-6及 IL-1β水平 與正常組比較，慢性胰腺炎組小鼠血清中TNF-α、IL-6 和IL-1β 水平均明顯升高（Plt;0. 05）。與對照組比較，模型組細胞中TNF- α、IL-6 和IL-1β 水平均明顯升高（Plt;0. 05）。與模型組比較，si-CCL19 組細胞中炎癥因子TNF- α、IL-6 和IL-1β 水平均明顯降低（Plt;0. 05）。見圖8～9。

2. 5 2 組小鼠胰腺組織中 CCL19 蛋白表達情況 與正常組比較， 慢性胰腺炎組小鼠胰腺組織中CCL19 蛋白表達明顯增加。見圖10。

2. 6 2組小鼠胰腺組織和各組共培養體系細胞中CCL19蛋白及 NF-κB信號通路相關蛋白表達水平 與正常組比較， 慢性胰腺炎組小鼠胰腺組織中CCL19、p-IKKα/β、p-P65 和p-IκBα 蛋白表達水平均明顯升高（Plt;0. 05）。與對照組比較， 模型組細胞中CCL19、p-IKKα/β、p-P65 和p-IκBα 蛋白表達水平均明顯升高（Plt;0. 05）。與模型組比較，si-CCL19 組細胞中CCL19、p-IKKα/β、p-P65 和p-I κ B α 蛋白表達水平均明顯降低（Plt;0. 05）。圖11～13。

3 討 論

慢性胰腺炎是一種胰腺進行性炎癥， 病發后會伴隨出現腹痛及內、外分泌失調等癥狀［10］。長期的慢性胰腺炎是誘發胰腺癌的主要誘因之一，因此治療慢性胰腺炎對預防胰腺癌的發生具有重要意義［11-12］。慢性胰腺炎患者胰腺腺泡細胞導管化的過程可以通過多種機制發生， 包括細胞類型的選擇性增殖或丟失及祖細胞的分化或轉分化［13-14］。胰腺炎患者胰腺組織中CK19 表達增加，淀粉酶表達減少［10］。本研究結果顯示： 胰腺炎小鼠胰腺組織中M1 型巨噬細胞數量增加， CCL19蛋白及NF- κB 信號通路相關蛋白表達水平升高，提示CCL19 可能與小鼠慢性胰腺炎中M1 型巨噬細胞NF- κB 信號通路有密切關聯。敲低CCL19后，NF-κB 信號通路相關蛋白表達水平明顯降低，且si-CCL19 組腺泡細胞導管化程度降低， 提示抑制CCL19 蛋白表達可以抑制NF- κ B 信號通路， 進而抑制巨噬細胞M1 型極化，抑制慢性胰腺炎的產生。

在慢性胰腺炎中，免疫微環境的改變是導致慢性胰腺炎發生發展的重要因素［15］。巨噬細胞是胰腺炎中豐富的免疫細胞群體，且具有高度異質性，可以響應微環境發生表型轉化， 包括經典激活巨噬細胞（M1 型） 和交替激活巨噬細胞（M2 型）［16］。M1 型巨噬細胞具有促炎作用， 會在炎癥部位富集并產生多種促炎細胞因子， 如IL-1β、IL-6 和TNF-α 等［17-18］。CK19 和淀粉酶表達情況為評價慢性胰腺炎的重要指標，而iNOS 和F4/80 表達情況是評價M1 巨噬細胞的指標。本研究結果顯示：M1 型巨噬細胞-腺泡細胞共培養體系中，模型組腺泡細胞出現了明顯的空泡化，即腺泡細胞導管化，且CK19 表達增加， 淀粉酶表達減少， 證實M1 型極化的巨噬細胞誘導腺泡細胞導管化，進而導致胰腺炎的產生。

CCL19 是CC 類趨化因子家族成員，是內環境穩定性趨化因子［19］。CCL19 與免疫微環境有密切關聯，同時還可以通過調控免疫微環境對多種炎癥具有促進作用［20］。例如，CCL19 可以通過趨化巨噬細胞加重小鼠結腸炎，通過招募中性粒細胞加重LPS 誘導的急性肺部炎癥， 也可通過抑制中性粒細胞的積累抑制皮膚炎癥的發生［21-23］。本研究成功構建小鼠胰腺炎模型，胰腺炎小鼠胰腺組織中CCL19 蛋白表達水平明顯升高， 并伴有巨噬細胞浸潤增加。在脂多糖處理的肝細胞中，多功能干細胞與轉錄激活因子相互作用激活了CCL19 的轉錄，CCL19 反作用于巨噬細胞， 促進了其在肝臟中的積累［24］。本研究結果顯示：CCL19 可以通過促進NF-κB 信號通路相關蛋白表達， 進而對巨噬細胞M1 型極化發揮促進作用，誘導小鼠慢性胰腺炎的發生發展， 提示CCL19 在炎癥中是一個重要的免疫微環境調控靶點， 可以通過干預CCL19 對炎癥過程中的免疫微環境起調控作用， 從而達到治療目的。

綜上所述， CCL19 通過NF-κB 信號通路促進巨噬細胞M1 型極化，誘導炎癥微環境的產生，從而促進胰腺炎的發生發展。CCL19 可以作為治療慢性胰腺炎的靶點，本研究為后續胰腺炎相關疾病的臨床治療提供了新的思路。

利益沖突聲明：所有作者聲明不存在利益沖突。

作者貢獻聲明：崔連鷙參與實驗設計、細胞實驗和論文撰寫，張曉偉參與細胞實驗和實驗數據整理，翟悅和潘悅參與動物實驗，于秀艷參與實驗設計和數據整理。

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