敲低RIP3 對缺氧/復氧誘導人腎小管上皮HK2 細胞自噬、細胞焦亡和鐵死亡的影響

［摘 要］ 目的：探討敲低受體相互作用蛋白激酶3（RIP3）對缺氧復氧（H/R）誘導下人腎小管上皮HK2細胞自噬、焦亡和鐵死亡的影響。方法：將慢病毒干擾載體質粒shRIP3和陰性對照慢病毒干擾載體質粒shNC 分別轉染至HK2 細胞中，分為shRIP3 組和shNC 組，另以正常培養未轉染的HK2 細胞作為空白組，轉染48 h 后，采用實時熒光定量PCR （RT-qPCR） 法和Western blotting 法驗證慢病毒轉染效果。將HK2 細胞分為對照組、H/R 組、shNC+H/R 組和shRIP3+H/R 組。CCK-8 法檢測各組HK2 細胞存活率，免疫熒光染色法檢測各組細胞中微管結合蛋白1 輕鏈（LC） 3B 和含核苷酸結合結構域富亮氨酸重復序列（NLR） 家族Pyrin 域蛋白3 （NLRP3） 蛋白熒光強度，Western blotting 法檢測各組HK2 細胞中LC3Ⅱ、LC3Ⅰ、Beclin1、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白酶（Caspase）-1、膜穿孔蛋白D （GSDMD）、白細胞介素（IL）-1β 和IL-18 蛋白表達水平， 試劑盒檢測各組細胞中鐵離子（Fe2+） 水平。結果：與空白組和shNC組比較，shRIP3組HK2細胞中RIP3 mRNA和蛋白表達水平均明顯降低（Plt;0. 05）。CCK-8 法檢測，與對照組比較，H/R 組HK2 細胞存活率明顯降低（Plt;0. 05）；與H/R 組比較，shRIP3+H/R 組HK2 細胞存活率明顯升高（Plt;0. 05）。免疫熒光染色法檢測，與對照組比較，H/R 組HK2 細胞中LC3B 蛋白熒光強度明顯降低（Plt;0. 05），NLRP3 蛋白熒光強度明顯升高（Plt;0. 05）；與H/R 組比較，shRIP3+H/R 組HK2 細胞中LC3B 蛋白熒光強度明顯升高（Plt;0. 05），NLRP3 蛋白熒光強度明顯降低（Plt;0. 05）。Western blotting 法檢測，與對照組比較，H/R 組HK2 細胞中LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值明顯降低（Plt;0. 05），Beclin1 蛋白表達水平明顯降低（Plt;0. 05）； 與H/R 組比較，shRIP3+H/R 組HK2 細胞中LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值明顯升高（Plt;0. 05），Beclin1 蛋白表達水平明顯升高（Plt;0. 05）；與對照組比較，H/R 組HK2 細胞中Caspase-1、GSDMD、IL-1β 和IL-18 蛋白表達水平均明顯升高（Plt;0. 05）；與H/R 組比較，shRIP3+H/R組HK2細胞中Caspase-1、GSDMD、IL-1β 和IL-18 蛋白表達水平均明顯降低（Plt;0. 05）。與對照組比較， H/R 組HK2 細胞中GPX4 和SLC7A11 蛋白表達水平均明顯降低（Plt;0. 05）；與H/R 組比較，shRIP3+H/R 組HK2 細胞中GPX4和SLC7A11 蛋白表達水平均明顯升高（Plt;0. 05）。與對照組比較，H/R 組HK2 中細胞Fe2+水平明顯升高（Plt;0. 05）； 與H/R 組比較， shRIP3+H/R 組HK2 細胞中Fe2+ 水平明顯降低（Plt;0. 05）。結論：靶向敲低RIP3可誘導H/R誘導人腎小管上皮HK2細胞自噬，抑制細胞焦亡和減輕鐵死亡。

［關鍵詞］ 人腎小管上皮HK2 細胞； 缺氧/復氧； 受體相互作用蛋白激酶3； 自噬； 焦亡； 鐵死亡

［中圖分類號］ R692 ［文獻標志碼］ A

急性腎損傷是一種急性危重腎臟疾病，通常由腎缺血/再灌注、腎毒素、腎切除術和膿毒癥引起［1］。目前，重癥監護病房患者急性腎損傷的發病率和死亡率高達50% 以上［2］。腎缺血/再灌注損傷作為急性腎損傷的常見原因之一，主要由于腎臟局部缺血后恢復血供而造成不可逆性腎功能損傷，其發生和進展與多種分子事件有關，如離子蓄積、線粒體功能障礙、氧化應激、炎癥及細胞凋亡［3-4］。因此，探討抑制腎缺血/再灌注損傷的有效治療方法對于預防急性腎損傷較為重要。

受體相互作用蛋白激酶（receptor interactingprotein kinase，RIP） 3 是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶，在介導炎癥和細胞死亡中起重要的作用。研究［5］顯示： RIP3 促進膿毒癥誘導的小鼠急性腎損傷，并在脂多糖處理的近端腎小管上皮細胞（renalproximal tubular epithelial cells， PTEC） 中激活，通過促進氧化應激和線粒體功能障礙加重腎小管損傷。此外，抑制RIP3 可以通過恢復膿毒性急性腎損傷期間腎小管細胞的自噬降解起到腎臟保護作用， RIP3 可能參與急性腎損傷的發生發展［6］。本研究通過缺氧復氧（hypoxia reoxygenation， H/R）誘導人腎小管上皮細胞HK2 在體外模擬腎缺血/再灌注模型，探討RIP3 敲低后對H/R 誘導的人腎小管上皮HK2 細胞的影響及其作用機制， 為急性腎損傷的臨床防治提供潛在靶點。

1 材料與方法

1. 1 細胞、主要試劑和儀器 人腎小管上皮細胞HK2 來源于中國科學院細胞庫。胎牛血清、1% 青-鏈霉素及DMEM 培養基購于美國Hyclone 公司，轉染試劑Lipofectamine 2000購于美國Invitrogen公司，TRIzol、反轉錄和鐵SYBR Green 定量檢測試劑盒購于日本TaKaRa 公司， RIPA 裂解液、BCA 蛋白定量試劑盒、超敏ECL 試劑液和DAPI染料購于上海碧云天生物技術有限公司，CCK-8 試劑購于北京康為世紀公司，Triton X-100 購于北京百奧萊博科技有限公司，鐵離子（ferri ion，Fe2+）檢測試劑盒購于北京普利萊基因技術有限公司，兔抗甘油醛3 磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH） 多克隆抗體、兔抗RIP3 多克隆抗體、兔抗微管結合蛋白1 輕鏈（microtubule binding protein 1 light chain， LC）3B多克隆抗體、兔抗Beclin1 單克隆抗體、兔抗含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白酶（cysteinyl aspartatespecific proteinase， Caspase）-1 多克隆抗體、兔抗膜穿孔蛋白D （gasdermin-D，GSDMD） 單克隆抗體、兔抗白細胞介素（interleukin，IL）-1β 單克隆抗體、兔抗IL-18 單克隆抗體、兔抗谷胱甘肽過氧化物酶4 （glutathione peroxidase 4， GPX4） 單克隆抗體、兔抗溶質載體家族7 成員11 （solute carrierfamily 7 member 11， SLC7A11） 多克隆抗體、含核苷酸結合結構域富亮氨酸重復序列（nucleotidebindingdomain leucine-rich repeat， NLR） 家族Pyrin 域蛋白3 （NLR family Pyrin-domain protein 3，NLRP3） 和多克隆抗體及辣根過氧化物酶/花青3（cyanine 3， Cy3） 熒光標記的山羊抗兔IgG 抗體均購于英國Abcam 公司。引物序列、慢病毒干擾載體質粒shRIP3 和陰性對照慢病毒干擾載體質粒shNC 由生工生物工程（上海） 有限公司合成和構建。

1. 2 細胞培養和轉染 將HK2細胞置于含10%胎牛血清與1% 青-鏈霉素混合溶液的DMEM 培養基中，置于37℃、5% CO2 環境下培養，取對數生長期細胞用于實驗。將慢病毒干擾載體質粒shRIP3和陰性對照慢病毒干擾載體質粒shNC 分別轉染至HK2 細胞中，分為shRIP3 組和shNC 組，具體根據Lipofectamine 2000 試劑盒說明書步驟執行。另以正常培養未轉染的HK2 細胞作為空白組，轉染48 h 后，收集細胞并加入新鮮完全培養基，采用實時熒光定量PCR （real-time fluorescence quantitativePCR ， RT-qPCR） 法和Western blotting 法驗證慢病毒轉染效果。

1. 3 H/R細胞模型制備和分組 H/R建模方法［7］：將HK2 細胞置于低氧培養箱內（含94% N2、5%CO2 和1% O2） 持續培養6 h 后， 再移至復氧培養箱內（含74% N2、5% CO2 和21% O2） 中繼續培養6 h，造成HK2 細胞的H/R。將HK2 細胞分為對照組（HK2 細胞在正常環境下培養）、H/R 組（HK2 細胞進行H/R 處理）、shNC+H/R 組（HK2細胞轉染陰性對照慢病毒干擾載體質粒shNC 后進行H/R 處理） 和shRIP3+H/R 組（HK2 細胞轉染慢病毒干擾載體質粒shRIP3 后進行H/R 處理）。

1. 4 RT-qPCR 法 檢 測 各 組 HK2 細 胞 中 RIP3mRNA表達水平 各組 HK2細胞中添加 TRIzol試劑， 按照說明書步驟提取總RNA， 反轉錄合成cDNA。RT-qPCR 法檢測各組HK2 細胞中RIP3mRNA 表達水平， 參照SYBR Green 法熒光定量PCR 試劑盒說明書， 加入各試劑與對應底物cDNA， 反應體系體積共20 μL， 定量檢測系統上設置兩步法反應程序：95 ℃下預變性30 s；95 ℃變性5 s、60 ℃退火/延伸30 s，循環40 次。實驗重復檢測3 次， 以β -actin 為內參， 采用2—△△Ct 法計算RIP3 mRNA 表達水平。引物序列： RIP3 上游引物5'-GGACCTCAAGCCCTCTAACA-3'， RIP3下游引物5'-ACCTCGGAGACAGCAGCATC-3'；β-actin 上游引物5'-TGTTACCAACTGGGACGACA-3'， β-actin 下游引物5'-CTGGGTCATCTTTTCACGGT-3'。

1. 5 Western blotting法檢測各組HK2細胞中相關蛋白表達水平 使用RIPA裂解液提取各組HK2細胞總蛋白，BCA 法進行定量。蛋白樣品經100 ℃金屬浴煮沸變性后， 將等量30 μg 蛋白加入凝膠孔，通過10% SDS-PAGE 電泳分離并轉移至硝酸纖維素膜。再將分離后的膜浸入5% 脫脂奶粉中，室溫封閉2 h，加入兔抗RIP3、LC3Ⅱ、LC3Ⅰ、Beclin1、Caspase-1、GSDMD、IL-1β、IL-18、GPX4 和SLC7A11 抗體作為一抗， 均按1∶ 1 000 稀釋，與膜在4 ℃下共孵育。次日，取膜復溫，TBST 溶液洗滌后，加入對應標記的山羊抗兔IgG 抗體作為二抗， 按1∶ 5 000 稀釋， 與膜在室溫下共孵育，2 h 后再以TBST 溶液洗膜， 超敏ECL 試劑液顯色， 曝光顯影， 圖像掃描儀檢測蛋白條帶， 采用Image J 軟件分析蛋白條帶灰度值， 以GAPDH 作為內參，計算目的蛋白表達水平。目的蛋白表達水平=目的蛋白條帶灰度值/內參蛋白條帶灰度值。

1. 6 CCK-8法檢測各組細胞存活率 將HK2細胞按照每孔3×103 個細胞的密度接種于96 孔細胞培養板，37 ℃、5% CO2 環境下過夜培養。各孔內添加10 μL 新鮮配制的CCK-8 試劑， 繼續孵育2 h，采用酶標儀測定波長450 nm 處各孔吸光度（A） 值， 并計算細胞存活率。細胞存活率=（實驗組A 值- 空白孔A 值） / （對照組A 值-空白孔A 值） ×100%。

1. 7 免疫熒光染色法檢測各組細胞中 LC3B 和NLRP3蛋白熒光強度 取各組HK2細胞進行細胞爬片，4% 多聚甲醛固定后，滴加0. 5%Triton X-100滲透15 min， 磷酸鹽緩沖液（phosphate bufferedsaline， PBS） 清洗后， 5% 山羊血清封閉1 h。甩去多余封閉液，加入兔抗LC3B 多克隆抗體或兔抗NLRP3 多克隆抗體分別作為一抗，均按照1∶100稀釋，4 ℃下孵育過夜。次日，PBS 緩沖液再次清洗，加入Cy3 熒光標記的二抗，按照1∶200 稀釋，避光室溫孵育2 h，DAPI 染色液染核15 min，抗淬滅封片劑封片，在熒光顯微鏡下觀察染色情況，攝取圖像，采用Image J 軟件分析LC3B 和NLRP3 蛋白熒光強度。蛋白熒光強度= 實驗組蛋白熒光強度/對照組蛋白熒光強度。

1. 8 采用試劑盒檢測各組細胞中 Fe2+水平 各組HK2 細胞采用PBS 緩沖液洗滌后加入200 μL 裂解液裂解細胞，置于搖床處理2 h。將緩沖液與4. 5% 高錳酸鉀溶液按照1∶1 比例混勻，設置空白對照管、標準品管和樣品管，根據試劑盒說明書添加各試劑和樣品，混勻后于60 ℃條件下孵育1 h，冷卻至室溫后， 加入30 μL Fe2+檢測劑， 室溫下孵育30 min，采用酶標儀檢測波長550 nm 處各孔A 值，繪制標準曲線并計算Fe2+水平。

1. 9 統計學分析 采用GraphPad Prism7. 0統計軟件進行統計學分析并繪制圖像。各組HK2 細胞中RIP3 mRNA 表達水平、細胞存活率、HK2 細胞中LC3B 蛋白熒光強度和RIP3、Beclin1、Caspase-1、GSDMD、IL-1β、IL-18、GPX4 及SLC7A11 蛋白表達水平以及LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值均符合正態分布，以x±s 表示， 多組間樣本均數比較采用單因素方差分析，組間樣本均數兩兩比較采用LSD-t 檢驗。以Plt;0. 05 為差異有統計學意義。

2 結 果

2. 1 各組HK2細胞中RIP3 mRNA和蛋白表達水平 與空白組（1. 00±0. 08 和0. 84±0. 07） 和shNC 組（1. 03±0. 10 和0. 83±0. 08） 比較，shRIP3 組HK2細胞中RIP3 mRNA 和蛋白表達水平（0. 24±0. 02和0. 26±0. 02） 均明顯降低（Plt;0. 05）。見圖1。

2. 2 各組HK2細胞存活率 與對照組比較，H/R組HK2 細胞存活率明顯降低（Plt;0. 05）。與H/R 組比較， shRIP3+H/R 組HK2 細胞存活率明顯升高（Plt;0. 05）， shNC+H/R 組HK2 細胞存活率差異無統計學意義（Pgt;0. 05）。見圖2。

2. 3 各組 HK2 細胞中 LC3B 和 NLRP3 蛋白熒光強度 與對照組（1. 00±0. 04 和1. 00±0. 05） 比較，H/R 組HK2 細胞中LC3B 蛋白熒光強度（ 0. 24±0. 02 ） 明顯降低（Plt;0. 05）， NLRP3蛋白熒光強度（2. 38±0. 25） 明顯升高（Plt;0. 05）。與H/R 組比較， shRIP3+H/R 組HK2 細胞中LC3B 蛋白熒光強度（1. 23±0. 11） 明顯升高（Plt;0. 05）， NLRP3 蛋白熒光強度（1. 17±0. 13）明顯降低（Plt;0. 05），shNC+H/R 組HK2 細胞中LC3B 和NLRP3 蛋白熒光強度（0. 25±0. 03 和2. 29±0. 25） 差異均無統計學意義（Pgt;0. 05）。見圖3 和4。

2. 4 各組HK2細胞中LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值和Beclin1蛋白表達水平 與對照組比較，H/R組 HK2細胞中LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值明顯降低（Plt;0. 05），Beclin1蛋白表達水平明顯降低（Plt;0. 05）。與H/R 組比較，shRIP3+H/R 組HK2 細胞中LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值明顯升高（Plt;0. 05）， Beclin1 蛋白表達水平明顯升高（Plt;0. 05）， shNC+H/R 組HK2 細胞中LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值和Beclin1 蛋白表達水平差異均無統計學意義（Pgt;0. 05）。見圖5。

2. 5 各組 HK2 細胞中 Caspase-1、GSDMD、IL-1β和 IL-18 蛋白表達水平 與對照組比較，H/R 組HK2 細胞中Caspase-1、GSDMD、IL-1β 和IL-18蛋白表達水平均明顯升高（Plt;0. 05）。與H/R 組比 較， shRIP3+H/R 組HK2 細胞中Caspase-1、GSDMD、IL-1β 和IL-18 蛋白表達水平均明顯降低（Plt;0. 05），shNC+H/R 組HK2 細胞中Caspase-1、GSDMD、IL-1β 和IL-18 蛋白表達水平差異均無統計學意義（Pgt;0. 05）。見圖6 和7。

2. 6 各組 HK2 細胞中 GPX4 和 SLC7A11 蛋白表達水平 與對照組比較，H/R組HK2細胞中GPX4和SLC7A11 蛋白表達水平均明顯降低（Plt;0. 05）。與H/R 組比較， shRIP3+H/R 組HK2 細胞中GPX4 和SLC7A11 蛋白表達水平均明顯升高（Plt;0. 05）， shNC+H/R 組HK2 細胞中GPX4 和SLC7A11 蛋白表達水平差異均無統計學意義（Pgt;0. 05）。見圖8 和9。

2. 7 各 組 HK2 細 胞 中 Fe2+ 水 平 與 對 照 組［ （1. 00±0. 03） μmol·g－1］ 比較， H/R 組HK2細胞中Fe2+水平［（1. 67±0. 19） μmol·g－1］ 明顯升高（Plt;0. 05）。與H/R 組比較，shRIP3+H/R 組HK2 細胞中Fe2+ 水平［ （1. 22±0. 14） μmol·g－1］明顯降低（Plt;0. 05），shNC+H/R 組HK2 細胞中Fe2+水平［（1. 69±0. 18） μmol·g－1］ 差異無統計學意義（Pgt;0. 05）。

3 討 論

臨床上，急性腎損傷患者的腎功能迅速惡化，表現為腎小球濾過率降低、體液和電解質失衡及代謝廢物的積累， 給患者生命健康造成了嚴重威脅［8］。急性腎損傷的嚴重程度與多種因素有關，確切發病機制有待深入研究。RIP3 作為程序性壞死的關鍵調節因子，可以控制腫瘤壞死因子受體家族的下游信號傳導， 并通過與RIP1 相互作用導致RIP3-RIP3 同源相互作用及RIP3 磷酸化， 磷酸化的RIP3 募集并激活混合系列蛋白激酶樣結構域（mixed lineage kinase domain-like， MLKL）， 使MLKL 易位至細胞膜誘導壞死性病變［9］。WANG 等［10］研究發現： RIP3 缺乏減輕了氧嗪酸鉀誘導的小鼠高尿酸血癥，降低了腎臟促炎細胞因子表達水平，對腎臟損傷起保護作用。FENG 等［11］ 研究發現：RIP3 易位至線粒體， 促進線粒體降解， 增加腎缺血再灌注后炎癥反應和腎組織損傷；WANG 等［12］發現：急性DeBakeyⅠ型主動脈夾層患者血漿RIP3水平與術后急性腎損傷和炎癥反應有關，且患者血漿RIP3 水平越高，患者生存率越低。因此，RIP3在急性腎損傷中發揮了重要作用，可能是未來治療策略的重要靶點。本研究在H/R 誘導的HK2 細胞中轉染慢病毒干擾載體質粒shRIP3， 并成功敲低了RIP3 的mRNA 和蛋白表達。本研究結果顯示：敲低RIP3 表達能夠減輕H/R 誘導的HK2 細胞焦亡和鐵死亡， 誘導HK2 細胞自噬， 并使細胞存活率升高。

自噬是一種高度保守的過程，通過溶酶體降解和回收錯誤折疊蛋白質及衰老細胞器，以維持細胞穩態［13］。自噬功能障礙與多種疾病的發病機制有關，激活自噬對急性腎損傷具有保護作用。恩格列凈可通過促進自噬和降低氧化應激、炎癥及凋亡改善非糖尿病大鼠的腎缺血再灌注損傷［14］。缺血預處理通過激活近端腎小管細胞自噬，進而減少缺血再灌注急性期腎組織中巨噬細胞浸潤，介導腎內膜的保護作用［15］。LC3B 屬于哺乳動物細胞中自噬相關蛋白8 （autophagy-related protein，ATG8） 基因的同系物，定位于自噬囊泡膜表面，參與自噬體形成。自噬過程涉及LC3-Ⅰ 向LC3-Ⅱ 的轉化，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值可被視為反映自噬水平的主要指標［16］。Beclin1 是自噬的成熟調節因子，與Ⅲ類磷脂酰肌醇3 激酶復合物相互作用，產生磷酸化磷脂酰肌醇后，通過與相關核心成分結合以促進自噬體的形成和成熟［17］。本研究結果顯示： H/R 誘導的HK2 細胞中LC3B 蛋白熒光強度降低， LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值降低，Beclin1 蛋白表達水平降低，表明H/R 處理抑制了HK2 細胞自噬；敲低RIP3 后可升高HK2 細胞中LC3B 蛋白熒光強度，LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值升高， Beclin1 蛋白表達水平升高， 提示敲低RIP3 可誘導H/R 誘導的HK2 細胞自噬。

腎臟疾病的發生和發展均與細胞焦亡有關。焦亡導致的細胞死亡與凋亡相似，均以DNA 斷裂為特征。然而，焦亡是依賴炎癥反應的程序性壞死，該過程不由經典的凋亡相關途徑所調節［18］。H/R 中產生的大量活性氧加劇了炎癥活動，有助于炎癥信號因子的形成，包括NLRP3 炎性體，其激活可進一步誘發焦亡［19］。NLRP3 炎性小體由NLRP3、Caspase-1 前體（pro-Caspase-1） 和凋亡相關斑點樣蛋白（apoptosis-associated speck-like proteincontaining a card，ASC） 組成，其催化pro-Caspase-1轉化為活化的Caspase-1， 從而促進IL-1β 和IL-18的成熟和分泌，并激活GSDMD 產生N 末端片段寡聚物，導致細胞膜破裂，誘導焦亡發生［20］。因此，抑制NLRP3 炎性體介導的焦亡是抑制腎缺血/再灌注后腎損傷的重要途徑。本研究結果顯示： H/R誘導的HK2 細胞中NLRP3 蛋白熒光強度升高，Caspase-1、GSDMD、IL-1β 和IL-18 蛋白相對表達量均上調，提示H/R 處理促進了HK2 細胞焦亡發生； 在敲低RIP3 后HK2 細胞中NLRP3 蛋白熒光強度降低，Caspase-1、GSDMD、IL-1β 和IL-18 蛋白表達均下調，提示敲低RIP3 能夠抑制H/R 誘導的HK2 細胞焦亡。

本研究結果顯示：H/R 誘導后HK2 細胞中Fe2+ 水平升高， 鐵死亡負調節蛋白GPX4 和SLC7A11 蛋白表達下調。鐵死亡是一種新型細胞死亡調節方式，由鐵介導的脂質過氧化積累、質膜破裂和損傷相關分子的釋放所誘導。特定小分子化合物作用于細胞各向異性靶標，導致抗氧化劑谷胱甘肽或GPX4 表達下調，導致細胞中活性氧積累和脂質過氧化，在Fe2+的協同作用下，細胞發生鐵死亡［21］。SLC7A11 是胱氨酸/谷氨酸反向轉運蛋白的一個亞基，主要功能是跨細胞膜交換胱氨酸和谷氨酸， 從而抑制鐵死亡［22］。鐵死亡失調已在多種生理和病理過程中得到證實，如癌癥、組織損傷和T 淋巴細胞免疫等。此外，人尿源性干細胞來源的外泌體攜帶的長鏈非編碼RNA （long non-codingRNA， lncRNA） 中磺酸上調基因1 （taurineupregulated 1， TUG1） 通過抑制酰基輔酶A 合成酶長鏈家族成員4 （acyl-CoA synthetase long-chainfamily member 4， ACSL4） 介導的鐵死亡來緩解缺血再灌注誘導的急性腎損傷［23］。核苷治療減輕了葉酸誘導的急性腎損傷小鼠腎組織病變，抑制了炎癥細胞浸潤并改善了腎功能障礙，這一作用機制與抑制鐵死亡有關，提示鐵死亡可能是腎臟損傷治療的新靶點［24］。本研究結果顯示：敲低HK2 細胞中RIP3 后，細胞中Fe2+水平降低，鐵死亡負調節蛋白GPX4 與SLC7A11 蛋白表達水平升高， 提示敲低RIP3 能夠減輕H/R 誘導的HK2 細胞鐵死亡。

綜上所述，靶向敲低RIP3 可誘導H/R 人腎小管上皮HK2 細胞自噬、抑制細胞焦亡和減輕鐵死亡，對H/R 環境下的HK2 細胞發揮保護效果，本研究結果為臨床上預防和治療缺血再灌注誘導的急性腎損傷提供了新的思路。

利益沖突聲明：所有作者聲明不存在利益沖突。

作者貢獻聲明：何國斌參與數據統計學分析和文章撰寫，王煥參與研究設計。

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