一種用于防治花椒根腐病復合微生物菌劑GF-1的制備

關鍵詞：花椒；根腐病；微生物菌劑；生物防治

作為甘肅省花椒主產區的隴南市，近年來花椒產量不斷提升，2023年花椒花椒產量4.7萬噸，比2022年增長7.8%.隨著花椒種植面積的不斷擴大和產業的快速發展，研究花椒病害防治也越來越受到學者的重視.其中花椒根腐病是一種嚴重威脅花椒品質和產量的土傳病，病害發生時可使花椒產區90%以上的樹體染病，導致樹勢衰弱而死亡，產量下降50%以上[1].為了進一步明確隴南花椒根腐病的發病因素，田鳳鳴等人獲得了隴南花椒根腐病病原菌腐皮鐮孢菌（Fusariumsolani）[2]，結果與朱天輝和陳第文[3]、李智敏等[4]、李志克等[5]和阮釗等[6]分別對四川漢源、云南昭通、四川茂縣和陜西鳳縣花椒根腐病植株中分離得到的病原菌一致.

化學防治是花椒根腐病防治的主要方式，在實際生產中普遍存在椒農重視化學農藥的治療而忽略生物預防的現象，化學農藥的過度使用造成問題日益嚴重[7]，因此開發利用花椒根腐病的生防資源實現綠色防治顯得尤為重要.郭志斌等[8]研究發現：淡紫擬青霉（Paecilomyceslilacinus）的發酵液對花椒根腐病菌的抑制作用良好.李姝江等[9]從花椒根際土壤中分離到蠟樣芽孢桿菌（Bacilluscereus）B3生防菌，并對其進行突變菌株篩選，最終得到對花椒根腐病有抑制作用且耐鏈霉素300mg/L的突變菌株，突變株的發酵液具有很好的生防效果.田鳳鳴等人發現：用綠色木霉和哈茨木霉按照1∶1的比例復配后對腐皮鐮刀菌的抑制率高達88%[10]，并從隴南花椒根際土壤中分別分離到3株生防菌株：貝萊斯芽孢桿菌（Bacillusvelezensis）T-1[11]、貝萊斯芽孢桿菌（Bacillusvelezensis）W-1[12]和枯草芽孢桿菌W-5[13]，對花椒根腐病病原菌的抑制率分別為70%、89%和82%.卓平清等[14]從健康花椒根部土壤中分離篩選出一株腐皮鐮刀菌較高拮抗作用的細菌KS-16，經鑒定為多粘類芽孢桿菌（Paenibacilluspolymyxa），對病原菌的抑制率為53.6%.丁俊園等[15]研究發現：生防菌貝萊斯芽孢桿菌P87的發酵濾液對花椒根腐病菌的抑菌活性可達70.86%.李夢瑋等[16]從花椒側根中篩選得到一株植物內生菌草酸青霉（Peniciliumoxalicum），其盆栽試驗對花椒根腐病的防效達56%以上.隨著國內外對土壤微生物的深入研究，發現了根際土壤微生物巨大的應用潛力，在農業綠色防控和化學藥劑的減施增效方面表現的尤為突出，是微生物農藥和微生物肥料中的主要菌種來源[17].

微生物菌劑具有改善土壤微生物群落結構、抵御植物病害、增加土壤肥力、減少化肥和農藥使用、提質增產、提高食品安全等特點，是一種環境友好型的綠色環保肥料，是一條重要的實現農業可持續化發展途徑[18-20].單一微生物菌劑相比復合微生物菌劑存在功能單一、適應能力差等問題.將不同功能菌株混合培養后獲得更強、更穩定的微生物復合菌劑，是未來發展微生物菌劑的趨勢[21].近年來越來越多的功能型微生物復合菌劑已研制成功.Siddiqui等[22]將兩種菌根瘤菌（Rhizobia）和熒光假單胞菌（Pseudomonasfluorescens）復配，研制出的復合菌劑在防治豌豆枯萎病中表現出了良好的效果.王文麗等[23]將鏈霉菌WL-3和WL-4進行復配，復合菌劑處理對番茄有顯著的促生作用，對單發青枯病、根結線蟲防效分別為75%、53.57%，對二者復合病害防效達60%.喬柳等[24]將細菌SR13-2、HT-6、ST-1、W-7和放線菌Sy115種菌進行復合發酵，培養后的菌液對致病疫霉菌絲生長和孢子囊萌發的抑制作用顯著優于其中抑菌效果最為突出的單一菌株HT-6；進一步發現5種菌的復合發酵菌液在馬鈴薯離體組織和盆栽植株上對晚疫病的防效也顯著優于HT-6單一菌株的效果.

目前關于腐皮鐮孢菌引起花椒根腐病的生物防治研究方面也只是單一菌株的研究與開發[18]，而對于利用不同菌株進行復配來提高花椒根腐病生防效果的研究尚未見.本研究擬在前期試驗的基礎上對已篩選出的貝萊斯芽胞桿菌T-1、貝萊斯芽胞桿菌W-1和枯草芽胞桿菌W-5進行復配，對其最佳配方進行研究并測定復合菌劑對病原菌的抑菌效果和廣譜抑菌效果，以期為花椒根腐病的生防菌資源的深入研究和開發提供科學依據.

1 材料與方法

1.1 供試菌種

3種生物拮抗菌貝萊斯芽孢桿菌T-1[11]、貝萊斯芽孢桿菌W-1[12]和枯草芽孢桿菌W-5[13]是前期試驗中分離于健康花椒根系土壤，花椒根腐病病原菌腐皮鐮孢菌分離于患病花椒根部，以上試驗菌均已進行形態學和分子生物學鑒定，保存于研究組實驗室.

1.2 主要培養基

PDA培養基：馬鈴薯200.0g/L，葡萄糖20.0g/L，瓊脂15.0～20.0，搖動容器直至溶質溶解，用離子水定容至1L，103.4kPa滅菌21min后倒平板.

LB培養基：胰蛋白胨10.0g/L，酵母提取物5.0g/L，NaCl10.0g/L，5.0mol/LNaOH調pH值至7.0，去離子水定容至1L，103.4kPa滅菌21min.

NYBD培養基：酵母浸粉5.0g/L，牛肉浸粉8.0g/L，葡萄糖10.0g/L，調pH值至7.5，加蒸餾水至1L.

1.3 主要試劑及儀器設備

孔雀石綠染色液和番紅O染色液（北京索萊寶科技有限公司）；氣浴式搖床（常州高德儀器制造有限公司）；立式壓力蒸汽滅菌器（上海申安醫療器械廠），臺式高速離心機（湖南湘儀），722N可見分光光度計（上海儀電分析儀器有限公司產品），超凈工作臺（蘇州凈化設備有限公司）

1.4 試驗方法

1.4.1 生防菌間的拮抗作用

將需檢測的三株花椒根腐病拮抗菌W-1、W-5和T-1分別接種于LB瓊脂培養基上，在32℃恒溫培養箱中倒置培養48h，根據生長程度來判斷生防菌間是否存在拮抗作用.

1.4.2 芽孢率的測定

采用Scharffer-Fulton法進行芽孢率的測定：在載玻片上滴加一滴無菌水，將培養好的生防菌用無菌接種環取菌，制成適當厚度的細菌涂片，自然干燥，快速通過火焰外焰4次來加熱固定.在固定好的載玻片上滴加適量孔雀石綠染色液于涂片上染色10min，同時水洗至無明顯染色液脫出.然后滴加番紅O染色液進行復染約2～3min，水洗至無染液脫出為止.待干后油鏡觀察，菌體呈紅色，芽孢呈綠色.每個樣品取3個視野計數，在油鏡視野下計數芽孢的個數及總體菌數.直到芽孢率達80%停止發酵（芽孢率=芽孢數/總菌數×100%）

1.4.3 復合生防菌發酵濃縮液的制備

在前期試驗中通過響應面法確定了生防菌的最佳發酵條件[25，12-13]，以最優的發酵條件培養生防菌，且直到發酵液中的芽孢率達到80%時停止發酵，將3種生防菌發酵液按照1∶1∶1的比例混合，4000r/min轉速離心15min，使得濃縮液的活菌量達到2.0×108CFU/mL備用.

1.4.4 載體的篩選及母粉的制備

稱量30g載體置于燒杯中，將濃縮好的發酵液倒入盛有載體的燒杯中，同時用玻璃棒不斷地進行攪拌，觀察到燒杯中不結塊且無流水時停止發酵液的加入，記錄好濃縮液的使用量，用v做標記，每個載體樣本重復3次，計算載體的最大吸附量，用H標記.將加好濃縮液的載體，在室溫吸附2h，32℃恒溫干燥箱中直至烘干，粉碎機烘干成粉末后作為母粉測定其活菌數，每個處理重復3次.載體的篩選以吸附量和活菌數作為篩選指標，吸附量的計算式為：H=v/m，其中v為發酵液的使用量（L），m為載體質量（g）

1.4.5 分散劑的篩選

以試驗方法1.4.4中篩選到的最佳載體為基礎，以5%的增加量將聚乙烯醇、吐溫80、羧甲基纖維素鈉、十二烷基硫酸鈉、木質素磺酸鈉分別與同等質量的母粉混合均勻，每個處理重復3次，測定復合菌劑的活菌量，篩選最佳分散劑.

1.4.6分散劑用量的篩選

將試驗方法1.4.5中篩選的最佳分散劑按2%、4%、6%、8%、10%、12%、14%、16%的增加量與同等質量的復合菌劑混勻，測定復合菌劑的活菌量，篩選最佳分散劑用量，每個處理重復3次.

1.4.7 紫外保護劑的篩選

以上述的復合菌劑作為基礎，以5%的增加量分別將海藻酸鈉、羧甲基纖維素、糊精添加到復菌劑中，置于超凈工作臺距紫外燈管（UVC200-280nm，100μW/cm2）15cm處的正下方照射30min，以不加保護劑作對照，測定對照組和處理組的活菌量，每個處理重復3次.

1.4.8 紫外保護劑用量的篩選

在以上復合菌劑的基礎上，將篩選最佳紫外保護劑按2%、4%、6%、8%、10%、12%的增加量與同等質量復合菌劑混合均勻，采用1.4.7中的方法進行處理，測定復合菌劑的活菌數，每個處理重復3次.

1.5 復合菌劑的質量檢測及生防效果測定

1.5.1 復合生防菌粉有效活菌數的測定

有效活菌數測定參照GB20287-2006的方法：精確稱取1g復合菌劑，置于20mL無菌水三角瓶中，將滅好菌的玻璃珠加入三角瓶，室溫靜置20min后，30oC搖床200r/min充分振蕩混勻30min，即成母液菌懸液.將上述懸液用移液器移取1mL置于10mL的滅菌離心管中，加入9mL的無菌水混勻，以無菌水進行10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8梯度稀釋，以后面三個梯度為樣品，分別用移液槍取0.1mL涂布到瓊脂計數培養基（NA）中，在恒溫培養箱30℃培養24h后，單菌落出現時計算菌落數，每個梯度3個重復.

1.5.2 復合生防菌粉水分的測定

水分的測定參照GB20287-2006的方法：將帶蓋鋁盒置于105℃±2K干燥箱中烘干至恒重，帶蓋鋁盒冷卻30min后稱量并記錄質量m0.然后稱取樣品2g（精確到0.01g），每份樣品設置三個平行樣，分別加入鋁盒中后稱重并記錄質量m1.將裝有樣品的鋁盒按照上述方法進行烘干，6h后至恒重后取出，冷卻30min后稱重記錄質量m2.水分含量計算為：ω（%）=（m1-m2）（m1-m0）×100%.

1.5.3 復合生防菌粉pH值的測定

pH值的測定參照GB20287-2006方法：將復合菌劑稱取1g置于滅菌的燒杯中，按照1∶5的比例加入無菌水，玻璃棒攪拌均勻后，室溫靜置30min后測樣品懸液的pH值，做3次平行.

1.5.4 復合生防菌粉廣譜抑菌測定試驗

采用平板對峙法：將直徑為6mm病原菌菌餅腐皮鐮孢菌、梅毒鐮刀菌、松針刺盤孢菌、禾谷鐮刀菌、核桃炭疽病置于PDA固體培養基中央，距離病原菌菌餅2cm處接種復合菌劑，28℃恒溫培養5天后測定各病原菌菌絲直徑，設置3個平行.計算：抑制率（%）＝（對照組菌落直徑-處理組菌落直徑）／（對照組菌落直徑-菌餅直徑）×100%.

1.5.5 不同稀釋倍數復合生防菌粉對花椒根腐病病原菌菌絲的抑制效果

稱取1g復合菌劑溶解于10mL的無菌水中混勻，用無菌水稀釋500、1000、2000的倍數，取0.1mL的混勻液涂布于PDA培養基上，再在培養基中央接入6mm花椒根腐病菌餅，然后測定其抑制率.

1.6 數據統計分析

數據用SPSS18.0軟件進行分析處理.

2 結果分析

2.1 生防菌間的拮抗作用測定

三株生防菌間的拮抗作用測定結果顯示：拮抗菌W-1、W-5和T-1在LB固體瓊脂培養基上生長狀態良好，相互之間沒有出現拮抗作用，可用于復合菌劑的相互混合使用（如圖1）.

2.2 載體吸附能力的測定及載體的篩選

對5種載體（硅藻土、蛭石粉、輕質碳酸鈣、高嶺土、滑石粉）的吸附效果和不同載體對復合發酵液活菌量的影響進行測定的結果表明，載體對復合發酵液的吸附能力依次是：硅藻土gt;蛭石粉gt;輕質碳酸鈣gt;高嶺土gt;滑石粉，硅藻土的吸附量高達2.48mL/g，而滑石粉的吸附能力最差，為0.39mL/g（圖2）.將各載體制備的母粉干燥研磨粉碎后測定其活菌數，結果表明：硅藻土制備的載體活菌數最高，為3.83×108CFU/g，高嶺土活菌量最低，僅為1.63×108CFU/g（圖3）.綜合考慮載體的吸附效果及所含活菌量，選擇硅藻土作為生防菌粉劑GF-1的載體.

2.3 分散劑的篩選

將5種不同的分散劑（聚乙烯醇、吐溫80、羧甲基纖維素鈉、十二烷基硫酸鈉、木質素磺酸鈉）分別加入以硅藻土為載體的復合母粉中測定不同分散劑對復合菌劑GF-1的活菌數量.結果表明：聚乙烯醇和木質素磺酸鈉效果較好（如圖4），活菌數量均高于對照組CK，其中木質素磺酸鈉效果最佳，活菌量最高達4.20×108CFU/g，顯著高于母粉對照組活菌量3.10×108CFU/g；聚乙烯醇效果次之，活菌量達3.17×108CFU/g，與母粉對照組差異不顯著；吐溫80、羧甲基纖維素鈉、十二烷基硫酸鈉效果較差，其所含活菌量均低于母粉對照組.綜上考慮，選擇木質素磺酸鈉作為生防菌GF-1粉劑最佳分散劑.

2.4 復合菌劑GF-1分散劑用量的篩選

以木質磺酸鈉作為復合菌劑的分散劑，對其增加量進行了篩選，由圖5可知，隨著木質磺酸鈉用量的增加，生防菌GF-1母粉活菌量逐漸提高.當木質磺酸鈉增加量為母粉的6%時，母粉活菌量最高達4.53×108CFU/g，當增加量超過母粉的6%時，其母粉活菌量逐漸下降，增加量在4%～12%之間，其母粉的活菌數均高于對照組.從節約成本考量，選擇6%木質磺酸鈉為復合菌劑GF-1的最佳增加量.

2.5 紫外保護劑的篩選

以3種紫外保護劑（海藻酸鈉、羧甲基纖維素、糊精）作為篩選對象，測定對復合菌劑活菌數的影響.結果表明（圖6）：復合菌劑在未經紫外照射處理時，添加海藻酸鈉的菌劑所含活菌量高于羧甲基纖維素、糊精及處理組，達4.33×108CFU/g；在經30min的紫外照射后，添加了3種紫外保護劑的復合菌劑的活菌數菌出現下降的現象，在單處理組中，海藻酸鈉的活菌數依然高于其他紫外保護劑和對照組，達3.76×108CFU/g.綜上考慮，選擇海藻酸鈉為復合生防菌粉劑GF-1最佳的紫外保護劑.

2.6 紫外保護劑用量的篩選

以海藻酸鈉為最佳的紫外保護劑的基礎上對其增加量進行了研究，結果表明（圖7）：在未經紫外照射處理時，隨著海藻酸鈉用量的增加，混合制劑的活菌量也逐漸增加；當海藻酸鈉用量8%時，混合制劑的活菌量達最高，為4.33×108CFU/g，在8%～10%之間均高于其他增加量的處理組和對照組；在30min紫外照射處理后，隨著海藻酸鈉用量的增加，混合制劑的活菌量呈逐漸遞增趨勢；當用量8%時，混合制劑的活菌量達最高，為3.17×108CFU/g，與對照組制劑和其他處理組的制劑相比，其活菌數達到最高，效果最佳，因此，復合菌劑紫外保護劑的用量以8%的增加量為最佳效果.

2.7 復合菌劑GF-1的質量檢測

以最佳載體、最佳分散劑、最佳紫外保護劑和混合發酵液混勻制成復合生防菌劑.該菌劑的自然狀態為粉劑、無結塊、無聚集、顏色為淡黃色（如圖8）.復合生防菌劑的質量指標的測定結果見表2.

2.8 復合生防菌劑的廣譜抑菌測定

經平板對峙法測定復合菌劑的廣譜抑菌實驗顯示：復合菌劑對供試的5種植物病原菌均表現出良好抑菌效果（如圖9），對腐皮鐮孢菌、梅毒鐮刀菌、松針刺盤孢菌、禾谷鐮刀菌、核桃炭疽病病原菌菌絲的抑制率分別為83.3%、79.3%、74.7%、89%、83.7%.以上結果表明：復合菌劑良好的抑菌效果，可用于后續的生產實踐.對復合菌劑進行不同倍數的稀釋后測定對花椒根腐病腐皮鐮孢菌的抑菌效果（圖10），發現復合菌劑的原粉劑、500倍的稀釋、1000倍的稀釋均能完全抑制住病原菌菌絲的生長，2000的稀釋倍數使病原菌菌絲的抑制率在95%以上.

3 討論

為了確保復合生防菌劑的防治效果，本研究對復合菌劑GF-1進行了最佳載體、分散劑和紫外保護劑的篩選.將硅藻土作為復合菌劑的最佳載體，這與賀振寧等[26]、應萬里[27]、朱海霞等[28]分別對枯草芽孢桿菌B1514可濕性粉劑載體、解淀粉芽孢桿菌GZ-5菌株可濕性粉劑最佳載體和制備內生菌株HL-1可濕性粉劑的載體篩選結果一致.與蛭石粉、輕質碳酸鈣、高嶺土、滑石粉載體相比，復合菌液與載體硅藻土的相容性更好.據研究發現，硅藻土有著豐富的資源且價格低廉，因其結構疏松多孔，具有良好的吸附性，為生防菌的生存環境提供良好的空間[29].在微生物菌劑研制中硅藻土有著廣泛的應用價值.

除此之外，本研究對復合菌劑的助劑也進行了篩選.發現木質磺酸鈉為最佳分散劑，分散劑的添加進一步防止了菌粉凝聚結塊，同時提高了菌粉的均勻程度和分散性.木質素類分散劑具有價格低廉來源廣、良好的分散性能等優勢，在國內外均有大量的研究與應用[28].生防菌劑富含有效菌受室外紫外線的干擾，篩選最佳的紫外保護劑對菌劑的活性十分重要.本研究選取海藻酸鈉作為復合生防菌粉劑GF-1的紫外保護劑.同時對其用量進行了初步篩選，最終獲得復合生防菌粉劑GF-1的配方為：載體為硅藻土，按吸附量2.48mL/g，制備母粉，烘干粉碎，以母粉的增加量分別添加分散劑（木質磺酸鈉）6%和紫外保護劑（海藻酸鈉）8%.

本研究對粉劑質量進一步檢測，確定其使用的有效性和穩定性.根據初步篩選的配方制備的復合生防菌粉劑GF-1，其活菌量達到3.17×108CFU/g超過農用微生物菌劑的國家標準2.0×108CFU/g.

pH值作為微生物菌劑有效活菌數生存的重要環境條件之一，過高或者過低均會加速有效活菌的死亡，在復合生防粉劑GF-1中檢測到的pH值為6.75，該值在農用微生物菌劑國家標準規定微生物菌劑pH的范圍之內，這說明本文研制的復合生防粉劑GF-1的pH值是符合三種拮抗菌生長要求的.同時試驗還測定出了復合生防粉劑GF-1的水分含量為0.25%，該菌劑的水分含量達到GB20287-2006農用微生物菌劑國家標準，但該菌劑水分含量遠低于國家標準，是否會對菌劑中復合生防粉劑GF-1有效活菌數造成影響，還需進一步研究.

本研究最后采用平板對峙試驗，初步研究了復合生防粉劑GF-1的生防效果，結果顯示該復合菌劑具有較為廣泛的抑菌活性，且在稀釋2000倍時對花椒根腐病致病菌腐皮鐮孢菌抑菌率達到95%，進一步驗證了粉劑的生防效果.復合生防粉劑GF-1在未來花椒生產中具有較好的應用潛力，可進一步的推廣試用.