假地藍組培快繁體系的初步建立

關鍵詞：假地藍；組織培養；快繁技術；植物激素

假地藍（CrotalariaferrugineaGrah.）為豆科（Leguminosae）豬屎豆屬（Crotalaria）植物，別名黃花野百合，屬多年生草本，具有多種活性成分.其干燥全草入藥可滋腎養肝，止咳平喘，利濕解毒，用于耳鳴，耳聾，頭目眩暈，久咳痰血，腎炎，疔瘡腫毒等癥狀[1-2]，主要分布在貴州、云南、四川等地，是四川、云南、貴州白族、彝族和侗族常用的民間藥材[3].在現代醫學應用中，其提取物還具有重要的抗癌和抗菌作用，具有較高的藥用價值，應用前景廣闊[4-6].假地藍還可以殺滅蠅蛆、孑孓，也能作為綠肥使用.

近年來，假地藍藥用價值的發掘越來越深，但由于生態環境被破壞，假地藍的數量減少，現有野生資源無法滿足臨床上對慢性腎炎、支氣管炎和膀胱炎等癥治療的持續需求.而國內對假地藍組培快繁體系的相關研究成果少，多數集中在藥用及化學成分研究.周英等[7]報道了假地藍干草響鈴草的體外抑菌作用，其不同溶劑提取物對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、藤黃微球菌、綠膿桿菌以及黃霉菌均有一定的抑制作用.張旭[8]報道了響鈴草的化學成分，從中分離催吐蘿芙木葉醇（3-氧化-6-羥基紫羅蘭醇，Ⅰ）、染料木素（Ⅱ）、對羥基苯甲酸（Ⅲ）、5，7-二羥基-4-甲氧基黃酮-7-O-β-D-葡萄糖苷（Ⅳ）等10種化合物.夏勇兵等[9]確定了響鈴草正丁醇萃取部位為響鈴草的抗炎鎮痛部位.但針對假地藍組織培養及快繁體系的建立，尚未見文獻報道.本實驗以假地藍無菌苗葉片為外植體，通過愈傷組織誘導、增殖、不定芽分化以及生根培養建立假地藍的組織培養體系，縮短種植周期，提高資源利用，實現持續大批量藥材供應，彌補假地藍以及豬屎豆屬等近緣植物再生技術研究的空白，實現假地藍的資源充分利用.

1 材料與方法

1.1 試驗材料

自然條件下種植的假地藍植株，其莖上密布絨毛，攜帶大量微生物，常規方法難以獲得無菌材料，本實驗以宜賓市翠屏區金秋湖鎮邱場社區野外采集的假地藍成熟種子為材料，獲得無菌苗，以開展組培相關研究.

1.2 培養基及培養條件

基本培養基采用MS，添加不同種類和濃度的6-BA（6-芐氨基嘌呤）、2，4-D（2，4-二氯苯氧乙酸）、NAA（a-萘乙酸）、IBA（吲哚丁酸）和TDZ（噻苯隆），添加瓊脂5g/L，蔗糖30g/L，按配方添加0.5g/LPVP，pH6.0，高壓滅菌鍋（121℃）滅菌20min.培養室溫度23±2℃，每日光照12h.

1.3 試驗方法

（1）無菌苗的獲取.選擇成熟飽滿的假地藍種子，流水沖洗干凈，用75%的酒精表面消毒，移入超凈工作臺內，0.1%的升汞處理8min進行消毒，用無菌水清洗2～3次，在無菌濾紙上擦干水分，將種子接入1/2MS+6-BA1.0mg/L+2，4-D1.5mg/L+NAA0.5mg/L培養基中，獲得無菌苗，待無菌苗長到7～8cm高、葉片長2cm時，進行后續實驗.

（2）愈傷組織誘導.取無菌苗上的嫩葉葉片，切割成0.5cm×0.5cm大小，接種在表1的培養基上，每組處理接20瓶，1-2片/瓶，觀察愈傷組織誘導情況，30d記錄誘導率、褐化率及愈傷情況.

（3）愈傷組織增殖.取30d后成功誘導的愈傷組織，切割成0.5cm×0.5cm小塊，接種在表2培養基上，每組處理接20瓶，1塊/瓶，30d記錄愈傷情況及褐化率.

（4）叢生芽誘導.取增殖20d的愈傷組織，切割成0.5cm×0.5cm小塊，接種在表3培養基上，每組處理接20瓶，2塊/瓶，觀察叢生芽誘導情況，90d計算誘導率.

（5）生根培養.取分化出的叢生芽，保留其頂端2～3片較小葉片，接種在表4培養基上，每組處理接20瓶，2根/瓶，觀察莖段生根情況，60d計算生根率.

1.4 數據統計與計算

污染率=污染數／接種數×100%

萌發率=萌發個體數／接種數×100%

誘導率=誘導成功個體數/接種數×100%

褐化率=褐化個體數/接種數×100%

增值倍數=增值后愈傷數/增殖前愈傷數

平均株高=總株高/總株數

平均叢生芽數=總叢生芽數/總株數

生根率=生根數/接種數×100%

平均根長=總根長/接種數

平均主根數=總主根數/接種數

2 結果與分析

按試驗設計建立假地藍再生體系如圖1所示.

2.1 無菌苗培養

假地藍種子萌發較快，在添加有6-BA、2，4-D和NAA的培養基中培養，45d開始萌發出白色的芽，60d種子長出葉片（圖1A）.

2.2 愈傷組織誘導

在添加有不同濃度的6-BA、2，4-D和NAA的培養基中培養30d，愈傷組織切口處膨大，且均有小顆粒黃綠色組織出現，愈傷組織生長速度快且長勢好，45d時愈傷組織均開始不同程度的褐化.在MS培養基中，當添加2，4-D濃度為1.0mg/L不變時，添加不同濃度的6-BA與NAA組合對假地藍葉片的愈傷組織誘導率無明顯影響，但誘導效果不同（表5）.當6-BA濃度不變時，隨著NAA濃度的升高，愈傷膨大效果和長勢呈下降趨勢，褐化率呈上升趨勢，NAA濃度為2.0mg/L時愈傷誘導率為98.33%，其余組合愈傷誘導率均為100%.當NAA濃度不變時，隨著6-BA濃度的升高，愈傷組織誘導率均為100%，愈傷膨大效果呈上升趨勢，褐化率先升高后降低，6-BA濃度為0.5mg/L時褐化率最低，6-BA濃度為1.5mg/L時褐化率最高.6-BA濃度為2.0mg/L時，在30d的愈傷組織呈現為與其他濃度不同的淡黃綠色，45d時愈傷組織生長為綠色.當NAA濃度為0.5～1.5mg/L、6-BA濃度為0.5～1.0mg/L時愈傷組織呈綠色，膨大較明顯，長勢好.其中，當添加1.0mg/L6-BA、0.5mg/LNAA時，誘導率達100%的同時，愈傷組織呈翠綠色，膨大最明顯，褐化率低，長勢最好（圖1B）.因此，愈傷組織誘導的適宜培養基為MS+6-BA1.0mg/L+NAA0.5mg/L+2，4-D1.0mg/L.

2.3 愈傷組織增殖

假地藍愈傷組織生長速度快，均在20d形成大塊愈傷組織，30d開始褐化且褐化速度快.不同濃度激素配比對假地藍愈傷組織增殖的差異顯著（表6）.當2，4-D濃度為0mg/L時，愈傷組織仍膨大生長，但褐化率高，愈傷膨大較慢.當6-BA和NAA濃度為0.5mg/L時，隨著2，4-D的濃度升高，愈傷組織褐化率呈下降趨勢，愈傷組織膨大速度呈上升趨勢.當2，4-D濃度為0.7～0.8mg/L時，愈傷組織30d時呈黃綠色，45d時呈綠色，膨大速度快，長勢好，褐化率低.其中，當添加0.8mg/L2，4-D時褐化率最低，為11.6%，愈傷組織呈翠綠色，膨大最明顯，長勢最好（圖1C）.PVP對避免假地藍的愈傷組織褐化有顯著作用效果，但對其膨大生長速度有一定抑制作用.當6-BA、2，4-D和NAA的濃度不變時，添加PVP的組合在45d時的褐化率低于不加PVP的組合，但不加PVP的組合愈傷組織的膨大速度更快.因此，愈傷組織增殖的適宜培養基為MS+6-BA0.5mg/L+NAA0.5mg/L+2，4-D0.8mg/L.

2.4 叢生芽誘導

假地藍的愈傷組織45d左右開始分化，當TDZ濃度為0mg/L時，愈傷組織可以分化成功，添加不同濃度TDZ的MS培養基均能誘導愈傷組織分化，但對誘導分化的影響差異顯著（表7）.當6-BA濃度為1.5mg/L、NAA濃度為0.1mg/L時，隨著TDZ濃度的升高，分化率呈先升高后降低的趨勢.當TDZ的濃度為0.01～0.05mg/L時，30d愈傷組織開始褐化，60d時愈傷組織嚴重褐化，此時開始分化出叢生芽，90d時分化率高達100%；此范圍內隨TDZ濃度升高，愈傷組織的分化效果顯著變好.其中，當TDZ的濃度為0.05mg/L時，誘導分化的叢生芽數目最多，葉色綠、葉片大而多，莖較粗壯，節間均勻，株型統一（圖1D）.TDZ濃度過高不利于愈傷組織分化，當TDZ濃度大于1.0mg/L時，愈傷組織90d后分化出小芽，分化率低，分化時間長，分化后芽的生長狀況一般，植株矮，莖粗壯.因此，誘導叢生芽分化的適宜培養基為MS+6-BA1.5mg/L+NAA0.1mg/L+TDZ0.05mg/L.

在誘導叢生芽的過程中，發現處理C1、C2、C3都會發生瓶內開花現象（圖1E），且部分叢生芽在后期會自主生根，較多數的根系生理狀態較差（圖1F），極少部分的生理狀態較好（圖1G）.

2.5 生根培養

添加不同濃度NAA和IBA的1/2MS培養基均能誘導假地藍莖段生根，但對生根誘導的影響差異顯著（表8），在不添加激素的1/2MS培養基中不能誘導生根，30d后苗的長勢變差，葉片變黃，逐漸死亡.隨著NAA和IBA濃度的升高，根長、根數及生根率呈上升趨勢.當NAA和IBA濃度為1.0～1.5mg/L時，生根率高，平均生根數多且粗壯，平均根長較長，須根多，長勢好.其中，當添加1.0mg/LNAA和IBA時，生根率最高達100%；當添加1.5mg/LNAA和IBA時，60d生根率高達98.89%，平均根長達4cm，平均主根5條，須根最多，長勢最好，后續移栽成活率高（圖1H、圖1I）.因此，生根的適宜培養基為1/2MS+IBA1.5mg/L+NAA1.5mg/L.

3 討論與結論

3.1 褐化現象在假地藍愈傷分化中的作用

本試驗發現，愈傷組織褐化是假地藍叢生芽誘導成功的前提條件.分化初期叢生芽底部愈傷迅速生長膨大，45d愈傷組織外層褐化較重時，培養材料并未死亡，開始長出芽點，形成叢生芽并在60d內持續生長、保持活力，此現象與丁旭峰等[10]對園藝植物組織培養中的褐化現象研究相違背.在假地藍的愈傷組織外部有較重程度的褐化后才開始進行叢生芽分化，與其他植物材料的組培不同.一般認為愈傷組織褐化會影響植物組培，甚至導致植物材料死亡，如蘭花根狀莖的分化會受到褐化物質的不利作用[11]，冬凌草愈傷組織的分化需要抑制愈傷組織的褐化[12].試驗中，切開正在分化的褐化愈傷發現其外部是褐化狀態，內部呈青綠色，說明愈傷組織在分化過程中的褐化可能并不會從外部蔓延至內部或蔓延速度極慢，故愈傷的生理狀態較好，叢生芽由內部未褐化的愈傷中分化出來，較長一段時間內保持較好的長勢，直至愈傷組織完全褐化失去活力；也可能是假地藍的愈傷組織在由外層向內部褐化的過程中產生了某些代謝產物，促進了假地藍愈傷組織的分化.大多研究認為，褐化主要是由多酚氧化酶作用于酚類化合物而引起的[13-14].推測可能與此類化合物或反應有關.目前試驗局限于對褐化現象促進叢生芽誘導這一結果的發現，還未進行代謝研究，現階段仍無法確定褐化時促進假地藍愈傷分化的具體物質，未來將進一步進行試驗，以期為豬屎豆屬及易褐化植物組培提供一定參考.

3.2 分化自主生根和誘導生根的比較

不定芽生根是組培苗成苗的關鍵步驟，在誘導假地藍莖段生根的過程中發現，假地藍組培苗易誘導出根系，在營養成分減半的1/2MS中添加IBA和NAA能成功誘導生根，這與覃春梅等[15]對百花懸鉤子的葉片組培快繁與植株再生研究一致，且較高的生長素濃度更利于假地藍生根，與郭麗等[16]對野生薄皮木的組培快繁體系優化的研究結果相違背.留有2～3片嫩葉的莖段材料比不帶葉的生根效果更好，生根時間更短，不帶葉的莖段在培養基中需先長葉后生根.誘導生根過程中，新生根系呈現白色，根系長度一般，數量較多，但莖段底部愈傷組織褐化速度快，導致靠近愈傷的根系褐化，生理狀態變差，給后續移栽帶來一定困難，存活率低.部分誘導的叢生芽在約60d后會自主生根，形成完整植株，此時多數根系呈現暗紅或褐色，數量較少但根較長，此類叢生芽移栽后大部分無法成活，說明其根基本不具備活力和吸取養分的能力；極少數根系呈現白紫色，數量多且根系長，能夠成功移栽存活.

3.3 瓶內開花

外源激素是在誘導組培苗開花中起重要作用的因素，細胞分裂素類激素更是花芽形成的必需因子[17-18].通過施用一定濃度的6-BA、GA3、NAA能夠成功誘導露薇花組培苗瓶內開花[19]，施用一定濃度的IBA、CCC能夠誘導石竹試管苗開花[20].本試驗用于叢生芽誘導的兩種濃度的TDZ處理都能成功誘導組培苗瓶內開花，其TDZ濃度分別為0.03mg/L、0.05mg/L，在愈傷組織分化的后期叢生芽生長旺盛，長勢好，三種處理的組培苗都能在同一時間前后逐漸長出花芽，形成花苞，花期可長達15d.說明對于假地藍來說，細胞分裂素可能對其花芽分化產生了一定的作用，但TDZ濃度為0mg/L時仍出現瓶內開花現象，與施用了TDZ的兩組無較明顯區別，故細胞分裂素的處理并不是其花芽分化的必需因子.之后長達一年的組培實驗也未發現叢生芽誘導過程中出現瓶內開花現象，但后續愈傷組織誘導分化出的叢生芽有一個共同特征，即植株矮小，后期生長狀態一般直至徹底死亡失去活力.植物完整的生命周期包括營養生長和生殖生長，開花的啟動代表植物生活周期由前者步入后者[21-22].故假地藍瓶內開花的主要影響因素是植株生長的生理發展階段，后續實驗中的假地藍叢生芽在營養生長過程中的狀態較差，還未進入生殖生長發育時期就已經死亡，而發現瓶內開花的幾組材料，其叢生芽在營養生長階段生長旺盛，成功發育至生殖生長階段，分化出花芽并開花.光照是許多植物瓶內開花的一個重要因素，適宜的光照可以誘導蘭花瓶內開花[23].假地藍叢生芽生長的過程需一直保持較強光照，這可能也是促進假地藍瓶內開花的原因之一.