棉花抗黃萎病相關(guān)基因GhERF020 功能的初步分析

摘要：黃萎病（Verticillium wilt）是影響我國(guó)棉花產(chǎn)量和品質(zhì)的重要病害，其病原菌是大麗輪枝菌（Verticillium dahliae）。AP2/ERF類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子在植物生長(zhǎng)發(fā)育和脅迫適應(yīng)性響應(yīng)中的作用日益突顯。為挖掘棉花抗黃萎病相關(guān)基因并探究其生物學(xué)功能，利用擬南芥抗大麗輪枝菌相關(guān)基因AT1G22810.1，同源比對(duì)獲得棉花抗黃萎病候選基因GhERF020（XM_016842745.1）。生物信息學(xué)分析結(jié)果表明，GhERF020 開(kāi)放閱讀框的長(zhǎng)度為441 bp，編碼147個(gè)氨基酸；其蛋白含有1個(gè)保守的AP2結(jié)構(gòu)域，相對(duì)分子質(zhì)量為16.16 kD，無(wú)跨膜結(jié)構(gòu)，屬于親水蛋白；預(yù)測(cè)其啟動(dòng)子區(qū)域含有水楊酸、茉莉酸甲酯和脫落酸等響應(yīng)元件。基因表達(dá)模式分析發(fā)現(xiàn)，GhERF020 受大麗輪枝菌侵染誘導(dǎo)表達(dá)。亞細(xì)胞定位分析表明，GhERF020蛋白定位于細(xì)胞核中。利用病毒誘導(dǎo)的基因沉默（virus-induced gene silencing， VIGS）技術(shù)下調(diào)GhERF020 表達(dá)后，棉花植株對(duì)大麗輪枝菌的敏感性顯著增強(qiáng)，病情指數(shù)和病原菌生物量明顯升高。由此表明，GhERF020是棉花抗黃萎病的正向調(diào)控因子。

關(guān)鍵詞：棉花黃萎病；大麗輪枝菌；轉(zhuǎn)錄因子；GhERF020；VIGS

doi：10.13304/j.nykjdb.2023.0407

中圖分類(lèi)號(hào)：S562；Q78 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1008‐0864（2024）09‐0112‐10

棉花是重要的經(jīng)濟(jì)作物之一，也是我國(guó)農(nóng)業(yè)安全的重要組成部分[1]。棉花黃萎病（Verticilliumwilt，VW）主要是由大麗輪枝菌（Verticilliumdahliae）引發(fā)的土傳性真菌維管束病害。大麗輪枝菌通過(guò)土壤傳播，入侵植物維管組織進(jìn)而引發(fā)病害，嚴(yán)重影響棉花的品質(zhì)和產(chǎn)量[2]；其具有寄主范圍廣、傳播速度快、破壞面積大和環(huán)境適應(yīng)性強(qiáng)等特點(diǎn)，防治極為困難。目前還沒(méi)有針對(duì)大麗輪枝菌的有效殺菌劑[3]。因此，深入挖掘棉花抗黃萎病相關(guān)基因資源，探究棉花抗黃萎病分子機(jī)制，進(jìn)而利用生物育種的方式培育抗病品種是防治黃萎病的穩(wěn)定而有效的方法。

轉(zhuǎn)錄因子（transcription factors，TF）在植物響應(yīng)逆境脅迫中發(fā)揮著不可或缺的作用，可調(diào)控與抗逆性狀相關(guān)基因的表達(dá)，使植物抗逆性得到顯著改善。因此，轉(zhuǎn)錄因子的發(fā)掘鑒定已逐漸成為植物抗逆育種的關(guān)鍵。AP2/ERF是植物特有的一類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子，具有60～70個(gè)氨基酸的AP2/ERF型DNA結(jié)合域[4]。根據(jù)其序列相似性和AP2/ERF結(jié)構(gòu)域的數(shù)量，將其分成4 類(lèi)，分別為AP2（APETALA2）、ERF（ethylene-responsive elementbinding factors）、RAV（related to ABI3/VP1）和DREB （dehydration-responsive element bindingprotein）亞家族[5]。其中，ERF 亞家族只含有1 個(gè)AP2 保守結(jié)構(gòu)域，可特異性結(jié)合基因上游AGCCGCC 元件（CCC-box），參與植物水楊酸（salicylicacid，SA）、茉莉酸（jasmonicacid，JA）和乙烯（ethylene，ET）等多個(gè)信號(hào)傳導(dǎo)途徑，在植物生長(zhǎng)發(fā)育和脅迫應(yīng)答中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用[6]。

近年來(lái)，ERF類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子得到廣泛關(guān)注，已在擬南芥[5]、水稻[5]、大豆[7]、番茄[8]、楊樹(shù)[9]等植物中鑒定出來(lái)并對(duì)其功能進(jìn)行闡述。ERF類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控方式復(fù)雜，不僅可正向調(diào)控植物抗性，也可負(fù)調(diào)控植物抗性。在擬南芥中過(guò)表達(dá)AtERF1可提高植株對(duì)灰霉菌和黃瓜織球殼菌等壞死性真菌的抗性[10]。過(guò)表達(dá)馬鈴薯StERF94 基因可增強(qiáng)與編碼病程相關(guān)防御基因的表達(dá)，抑制病菌繁殖，從而增強(qiáng)馬鈴薯對(duì)枯萎病的抵抗力[11]。水稻OsERF922的RNAi沉默轉(zhuǎn)化子增強(qiáng)了水稻對(duì)稻瘟病菌抗性，過(guò)表達(dá)該基因使植株對(duì)稻瘟病菌的入侵更加敏感[12]，并且利用CRISPR/Cas9（clusted regularlyinterspaced short palindromic repeats and CRISPassociatedprotein 9）技術(shù)編輯水稻OsERF922 可提高水稻抗稻瘟病菌的能力[13]。研究表明，擬南芥ERF019通過(guò)抑制病原體相關(guān)分子模式（pathogenassociatedmolecular patterns，PAMP）激發(fā)的免疫反應(yīng)負(fù)向調(diào)控對(duì)寄生疫霉菌的抗性[14]。植物感受并識(shí)別來(lái)自病菌的信號(hào)后，通過(guò)激活SA、ET和JA等植物激素的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，從而準(zhǔn)確調(diào)控植物的防衛(wèi)反應(yīng)，有些ERF轉(zhuǎn)錄因子在抗病信號(hào)交叉途徑中發(fā)揮重要作用，是關(guān)鍵的連接因子[15-17]。

在野生型擬南芥中，ERF1 受ET 和茉莉酸甲酯（methyl jasmonate，MEJA）誘導(dǎo)表達(dá)，作用于ET和JA交叉途徑的下游，是探究2種信號(hào)聯(lián)合調(diào)控抗病機(jī)制的關(guān)鍵元素，可調(diào)節(jié)下游防御反應(yīng)基因[18]。ERF96可結(jié)合ET和JA響應(yīng)的防衛(wèi)基因PDF1.2a、PR-3 和PR-4 的GCC 基序，進(jìn)而正向調(diào)控植物對(duì)死體營(yíng)養(yǎng)型病原菌的抗性[19]。在陸地棉（Gossypium hirsutum L.）中共鑒定了220個(gè)包含AP2單結(jié)構(gòu)域的基因[20]，然而和抗性相關(guān)的相對(duì)較少，尤其是與黃萎病抗性相關(guān)的ERF亞族轉(zhuǎn)錄因子亟待深入研究。本實(shí)驗(yàn)室前期通過(guò)對(duì)接種大麗輪枝菌的擬南芥進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組和代謝組學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)了大量差異表達(dá)基因（differentialexpression genes， DEGs）。通過(guò)生物信息學(xué)分析錨定擬南芥抗大麗輪枝菌基因AT1G22810.1，并從NCBI網(wǎng)站獲得棉花基因組中與其高度同源的基因GhERF020（XM_016842745.1），利用亞細(xì)胞定位和病毒誘導(dǎo)的基因沉默（virus-induced genesilencing，VIGS）技術(shù)對(duì)該基因在棉花抗黃萎病中的功能進(jìn)行初步探究，為進(jìn)一步闡述該基因的抗病分子機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

以陸地棉品種R15為試驗(yàn)材料。棉花VIGS載體為pTRV1、pTRV2、pTRV2-CLA1，大麗輪枝菌為強(qiáng)致病力菌系V991，大腸桿菌Trans1-T1 感受態(tài)細(xì)胞、大腸桿菌DH5α 菌株、根瘤農(nóng)桿菌GV3101感受態(tài)細(xì)胞均由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所提供。

1.2 試驗(yàn)試劑

植物總RNA小量提取試劑盒購(gòu)自廣州美基（Magen）生物有限公司；質(zhì)粒小提試劑盒購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司；DNA Marker、反轉(zhuǎn)錄試劑盒MonScriptTM RT Ⅲ all-in-one Mix（withdsDNase）購(gòu)自莫納（Monad）生物科技有限公司；2×Taq PCR Mix購(gòu)自北京艾德萊生物科技有限公司；限制性?xún)?nèi)切酶EcoR Ⅰ、BamH Ⅰ購(gòu)自NEB（北京）有限公司；2×Assembly Mix、熒光定量試劑盒2×ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix 購(gòu)自南京諾唯贊生物科技股份有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 GhERF020 生物信息學(xué)分析

在NCBI 網(wǎng)站中比對(duì)擬南芥抗黃萎病基因AT1G22810.1，發(fā)現(xiàn)棉花高度同源基因GhERF020 （XM_016842745.1）。利用MEGA 11對(duì)來(lái)自不同物種的同源基因的氨基酸序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)；利用Cotton FGD 網(wǎng)站（https：//cottonfgd.org/）獲得GhERF020 的編碼區(qū)（coding sequence， CDS）及基因組DNA 序列；使用NCBI 在線(xiàn)工具Batch CDsearch（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）預(yù)測(cè)基因的保守結(jié)構(gòu)域；使用ProtParam在線(xiàn)網(wǎng)站（http：//web.expasy.org/protparam）預(yù)測(cè)GhERF020蛋白的分子量、氨基酸組成、不穩(wěn)定指數(shù)、理論等電點(diǎn)、總平均親水性等理化性質(zhì)；使用TMHMM（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）預(yù)測(cè)跨膜結(jié)構(gòu)域；使用SignalP5.0（http：//www.cbs.dtu. dk/services/SignalP/index. php）預(yù)測(cè)信號(hào)肽；使用SOPMA （http：//npsa-pbil. ibcp. fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？page=npsa_sopma.html）預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)；使用SWISS-MODEL（https：//www.swissmodel.expasy.org/）預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)；使用Plant-mPLoc 網(wǎng)站（http：//www. csbio. sjtu. edu. cn/bioinf/plant-multi/）預(yù)測(cè)GhERF020 蛋白的功能結(jié)構(gòu)域。

1.3.2 基因表達(dá)分析

取V991菌液（107 CFU·mL-1）1 mL加入含有卡那青霉素和羧芐青霉素抗生素的CM（complete medium）培養(yǎng)基（6 g·L-1酵母提取物、6 g·L-1 酸水解酪蛋白和10 g·L-1 蔗糖）中，28 ℃、220 r·min-1 震蕩培養(yǎng)4～5 d，鏡檢觀(guān)察孢子并利用血球計(jì)數(shù)板統(tǒng)計(jì)孢子含量。當(dāng)孢子量達(dá)到107 CFU·mL-1時(shí)用4層紗布過(guò)濾掉菌絲體，收集孢子液。當(dāng)棉花長(zhǎng)至2葉1心時(shí)，將其根部浸泡在V991 孢子懸浮液中0.0、0.5、1.0、2.0、4.0、8.0 和12.0 h后，分別提取根、莖、葉組織的RNA，并反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。以棉花管家基因GhUBQ7（LOC107925174）作為內(nèi)參基因，使用GhUBQ7-RT-F/R 與GhERF020-qRT-F/R（ 表1）進(jìn)行RTqPCR擴(kuò)增，每個(gè)樣本3次重復(fù)。反應(yīng)結(jié)束后，根據(jù)目的基因和內(nèi)參基因的Ct值，使用2-ΔΔCt法[21]計(jì)算目的基因的表達(dá)量。

1.3.3 GhERF020 亞細(xì)胞定位

結(jié)合在線(xiàn)平臺(tái)WoLFPROST（https：//wolfpsort.hgc.jp/）預(yù)測(cè)的亞細(xì)胞定位結(jié)果，用p1132-GhERF020-F/R（表1，下劃線(xiàn)處為EcoR Ⅰ和BamH Ⅰ酶切位點(diǎn)）克隆GhERF020基因的開(kāi)放閱讀框（open reading frame， ORF）序列，并插入含有綠色熒光蛋白（green fluorescentprotein，GFP）基因表達(dá)載體pYBA1132（BamH Ⅰ和EcoR Ⅰ酶切位點(diǎn)）中。將構(gòu)建成功的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌EHA105中并在煙草中瞬時(shí)表達(dá)。注射煙草下表皮48 h后在LSM980共聚焦激光掃描顯微鏡（Zeiss，Jena，Germany）下觀(guān)察熒光亞細(xì)胞定位情況。細(xì)胞核標(biāo)記載體pH2B-mCherry[22]由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所王磊研究員提供。

1.3.4 棉花VIGS

設(shè)計(jì)特異性引物GhERF020-VIGS-F/R（表1），PCR 擴(kuò)增GhERF020 基因VIGS片段，插入pTRV2 多克隆位點(diǎn)EcoR Ⅰ和BamH Ⅰ間。利用電擊轉(zhuǎn)化法將pTRV2-GhERF020 質(zhì)粒轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌GV3101。農(nóng)桿菌介導(dǎo)的棉花VIGS操作按照Gao等[23]的方法進(jìn)行。注射VIGS菌液之后，觀(guān)察注射pTRV2-CLA1 菌液植株葉片的白化情況，當(dāng)?shù)?片真葉出現(xiàn)葉脈網(wǎng)格狀白化即可進(jìn)行沉默效率檢測(cè)，取沉默植株與對(duì)照植株葉片大小一致的第1 片真葉，提取RNA 并反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，使用引物GhERF020-qRT-F/R（表1），采用RT-qPCR檢測(cè)沉默效率。

1.3.5 GhERF020 棉花沉默植株黃萎病抗病性鑒定

使用1.3.2的棉花接菌方法，將棉花的根浸泡在孢子液（107 CFU·mL-1）5 min，然后重新移栽至營(yíng)養(yǎng)土中。10 d后觀(guān)察棉花表型并統(tǒng)計(jì)病情指數(shù)。病情分為5級(jí)：0級(jí)，無(wú)病葉，正常生長(zhǎng)；1級(jí)，子葉變黃，真葉無(wú)病；2級(jí)，所有子葉均發(fā)病，1～3片真葉發(fā)病；3級(jí)，包括子葉在內(nèi)的5片以上棉花葉片發(fā)病；4級(jí)，所有葉片發(fā)病，并有葉片脫落，或植物死亡[24]。病情指數(shù)的計(jì)算公式如下[25]。

病情指數(shù)=Σ（每一級(jí)病株數(shù)× 相應(yīng)病害等級(jí)／（10 × 4） ）×100（1）

提取棉花基因組DNA，在大麗輪枝菌基因組DNA中核糖體RNA基因ITS1和ITS2區(qū)域（Z29511）檢測(cè)真菌生物量，使用的引物為Vd-ITS-F/R，內(nèi)參基因?yàn)镚hUBQ7（表1）。RT-qPCR反應(yīng)在ABI7500 Fast儀器上進(jìn)行，數(shù)據(jù)通過(guò)2-ΔΔCt法[21]分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 GhERF020 基因生物信息學(xué)分析

2.1.1 棉花GhERF020 基因的同源性及結(jié)構(gòu)分析

通過(guò)在NCBI 網(wǎng)站中比對(duì)擬南芥基因AT1G22810.1，獲得棉花基因組中與其高度同源的基因XM_016842745.1，將其命名為GhERF020。利用MEGA 11對(duì)來(lái)自不同物種同源基因的氨基酸序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，結(jié)果（圖1A）發(fā)現(xiàn)，GhERF020 基因與毛楊、蘋(píng)果的親緣關(guān)系較近，與草莓、土豆等的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。該基因全長(zhǎng)444bp，無(wú)內(nèi)含子，編碼147個(gè)氨基酸；僅含有1個(gè)AP2保守結(jié)構(gòu)域，位于12～76位氨基酸之間，推測(cè)屬于AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子超家族ERF亞家族類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子（圖1B）。

2.1.2 GhERF020 蛋白理化性質(zhì)分析

對(duì)GhERF020蛋白的組成成分及其理化性質(zhì)進(jìn)行分析，結(jié)果（表2）表明，GhERF020 蛋白分子式為C691H1095N207O221S10，分子量為16.16 kD，含有丙氨酸（Ala）、精氨酸（Arg）、天冬酰胺（Asn）等20種氨基酸，其中絲氨酸（Ser）、丙氨酸（Ala）、甘氨酸（Gly）含量較高，分別為12.2%、9.5%、8.2%；親疏水性分析顯示，該蛋白為親水性蛋白（圖2A）；二級(jí)結(jié)構(gòu)主要由α-螺旋、延伸鏈、β-折疊和無(wú)規(guī)則卷曲構(gòu)成（圖2B），4種結(jié)構(gòu)包含的氨基酸數(shù)量分別為40、18、8、81，占比分別為27.21%、12.24%、5.44%和55.10%。跨膜結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)GhERF020蛋白為非膜蛋白，位于膜外側(cè)，因此推測(cè)該蛋白游離在細(xì)胞質(zhì)中發(fā)揮作用（圖2C）；三級(jí)結(jié)構(gòu)具α-螺旋、β-折疊和無(wú)規(guī)則卷曲等空間結(jié)構(gòu)（圖2D）。

2.1.3 GhERF020 基因上游啟動(dòng)子順式元件分析

利用Plant CARE在線(xiàn)分析軟件對(duì)GhERF020基因起始密碼子上游約2 000 bp啟動(dòng)子序列反義鏈進(jìn)行分析，該啟動(dòng)子上有15個(gè)真核生物所必需的核心元件CAAT-box和24個(gè)TATA-box；除此之外，在啟動(dòng)子區(qū)域還有許多功能性元件，如ABRE脫落酸響應(yīng)元件、ARE 厭氧誘導(dǎo)作用元件、CGTCA-motif MEJA反應(yīng)元件、水楊酸響應(yīng)有關(guān)的順式結(jié)構(gòu)元件TCA-element及光響應(yīng)元件GT1-box、LAMP-element、G-box等（圖3）。因此，GhERF020 可能受到激素誘導(dǎo)進(jìn)而調(diào)控抗病相關(guān)基因參與抗黃萎病脅迫反應(yīng)。

2.2 GhERF020 基因表達(dá)模式分析

RT-qPCR結(jié)果（圖4）顯示，GhERF020 在大麗輪枝菌侵染0.5 h時(shí)輕度誘導(dǎo)表達(dá)，1.0 h時(shí)達(dá)到峰值；組織特異性分析結(jié)果表明，GhERF020 在棉花根、莖和葉中均有表達(dá)。綜上所述，GhERF020 在棉花感染大麗輪枝菌后被誘導(dǎo)表達(dá)，并參與棉花對(duì)大麗輪枝菌的抗性反應(yīng)。

2.3 GhERF020 亞細(xì)胞定位分析

為了確定GhERF020的亞細(xì)胞定位，構(gòu)建了pYBA1132-GhERF020-GFP 融合質(zhì)粒，并將對(duì)照pYBA1132-GFP 載體和核定位基因H2B-mCherry轉(zhuǎn)化到煙草葉片中瞬時(shí)表達(dá)，結(jié)果（圖5）顯示，作為對(duì)照的pYBA1132-GFP蛋白定位在細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核，表明煙草瞬時(shí)表達(dá)體系建立；GhERF020-GFP融合蛋白與H2B-mCherry的共定位信號(hào)僅在細(xì)胞核中可見(jiàn)。因此，GhERF020可能是核定位蛋白，在激活下游抗病基因表達(dá)方面發(fā)揮作用。

2.4 GhERF020 基因沉默導(dǎo)致棉花對(duì)黃萎病的敏感性增加

為探究GhERF020 在棉花抗黃萎病中的作用，對(duì)棉花幼苗進(jìn)行VIGS處理10 d后，沉默CLA1基因的棉苗（TRV2：：CLA1）新生真葉出現(xiàn)白化表型（圖6A）。利用RT-qPCR檢測(cè)基因表達(dá)，結(jié)果（圖6B）顯示，沉默組（TRV2：：GhERF020）的GhERF020基因表達(dá)量較對(duì)照組（TRV2：：00）降低76.7%，沉默效果顯著。由此表明，VIGS體系建立成功，并且成功獲得GhERF020 沉默植株，可繼續(xù)用于抗黃萎病功能分析。

將對(duì)照組和沉默組植株接種V991 10 d后，對(duì)照組表現(xiàn)為個(gè)別葉片葉緣黃化、向下卷曲；GhERF020 沉默組表現(xiàn)出嚴(yán)重的植株萎蔫、葉片脫落等黃萎病癥狀。取GhERF020沉默組和對(duì)照組植株的子葉連接處分別進(jìn)行剖桿觀(guān)察，結(jié)果（圖7A）顯示，沉默組植株的維管束褐化，出現(xiàn)更加明顯的褐色條紋。同時(shí)，GhERF020 沉默組植株的病情指數(shù)、相對(duì)真菌生物量較對(duì)照組顯著升高（圖7B和C）。因此，推測(cè)GhERF020 基因在棉花抵御黃萎病過(guò)程中起重要調(diào)控作用。

3 討論

黃萎病是嚴(yán)重威脅棉花生產(chǎn)的重要病害，該病的防治非常困難。通過(guò)傳統(tǒng)的雜交育種方法選育抗病品種難度大、周期長(zhǎng)，不能有效滿(mǎn)足現(xiàn)實(shí)生產(chǎn)發(fā)展的需求。因此，挖掘棉花抗病相關(guān)基因，探究棉花抗黃萎病基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)及其抗病分子機(jī)制，將為棉花抗病分子育種提供理論依據(jù)及基因資源。

轉(zhuǎn)錄因子可以調(diào)控多個(gè)與抗病相關(guān)基因的表達(dá)，使植物抗病性得到明顯改善。近年來(lái)，ERF轉(zhuǎn)錄因子在植物生長(zhǎng)發(fā)育和脅迫適應(yīng)性中的作用日益突顯，在脅迫下通常正調(diào)控植物的抗性，但也會(huì)因低溫、缺鐵、干旱等一些原因負(fù)調(diào)控植物的抗性[26]。本研究室前期通過(guò)對(duì)接種大麗輪枝菌擬南芥進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組和代謝組學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)了大量差異表達(dá)基因，通過(guò)生物信息學(xué)分析錨定擬南芥抗黃萎病基因AtERF019（AT1G22810.1），通過(guò)同源比對(duì)獲得棉花同源基因GhERF020，該基因含有1個(gè)AP2 結(jié)構(gòu)域；AP2 結(jié)構(gòu)域是ERF 的DNA 結(jié)合域，是其行使轉(zhuǎn)錄調(diào)控的關(guān)鍵。

研究表明，SA、JA 和ET 是主要的抗病信號(hào)[27‐28]。黃榆普[29]研究發(fā)現(xiàn)，ERF012 能夠與JA合成基因的啟動(dòng)子結(jié)合，并上調(diào)JA 合成基因的表達(dá)，促進(jìn)JA合成。作為ET應(yīng)答因子，ERF轉(zhuǎn)錄因子可以特異性結(jié)合基因組上游的GCC-box，從而參與調(diào)控ET 應(yīng)答、抗病及非生物脅迫[30]。對(duì)GhERF020 啟動(dòng)子順式元件進(jìn)行預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，GhERF020 基因啟動(dòng)子區(qū)域具有參與SA、MEJA、ABA響應(yīng)等功能性元件，推測(cè)GhERF020 基因可能受激素誘導(dǎo)，進(jìn)而調(diào)控抗病相關(guān)基因參與抗黃萎病脅迫反應(yīng)。煙草的瞬時(shí)過(guò)表達(dá)結(jié)果表明，ERF019的核定位對(duì)其抗病功能至關(guān)重要[14]。本研究通過(guò)亞細(xì)胞定位同樣發(fā)現(xiàn)，GhERF020蛋白定位于細(xì)胞核中，可能是激活下游抗病基因表達(dá)的潛在因子。

Zafar等[20]對(duì)4類(lèi)棉花和野生型擬南芥中ERF基因家族成員進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)分析發(fā)現(xiàn)，GhERF020 與GhERF012 在同一分支上，并且與AtERF014 親緣關(guān)系較近。在AtERF014-RNAi 沉默植株中，病原菌和flg22誘導(dǎo)的活性氧（reactiveoxygen species，ROS）爆發(fā)、PTI 基因表達(dá)和SA 誘導(dǎo)的防御被部分抑制，而在超表達(dá)AtER014 植株中，病原菌誘導(dǎo)的ROS 和flg22 誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)被激活增強(qiáng)[31‐32]。本研究通過(guò)RT-qPCR 分析表明，GhERF020 能夠響應(yīng)黃萎病菌誘導(dǎo)處理，推測(cè)其在棉花抗黃萎病反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。利用VIGS 技術(shù)沉默該基因，沉默植株對(duì)黃萎病菌的抗性顯著降低，病情指數(shù)和真菌生物量均高于對(duì)照植株；剖桿檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，GhERF020 沉默植株維管束的褐變程度更加嚴(yán)重，真菌的生物量顯著高于對(duì)照植株。由此表明，GhERF020 正向調(diào)控棉花抗黃萎病反應(yīng)，但該基因的抗病分子機(jī)制及可能參與的抗病信號(hào)通路仍需進(jìn)一步解析。

綜上，本研究鑒定了1個(gè)ERF亞家族的轉(zhuǎn)錄因子編碼基因GhERF020，其ORF為441 bp，編碼147個(gè)氨基酸；GhERF020蛋白的相對(duì)分子質(zhì)量為16.16 kD，無(wú)跨膜結(jié)構(gòu)域，為親水性蛋白。該基因受大麗輪枝菌侵染誘導(dǎo)，并定位于細(xì)胞核，GhERF020 下調(diào)表達(dá)可顯著降低棉花對(duì)大麗輪枝菌的抗性。以上研究結(jié)果為棉花抗黃萎病基因資源的挖掘利用奠定了基礎(chǔ)，并為生物育種提供重要的基因資源。

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