一種引起板栗內腐病的果生炭疽菌鑒定及其生物學特性

摘要：板栗內腐病是板栗采后貯藏期主要病害，引起栗仁腐爛霉變，給生產帶來巨大經濟損失。為明確板栗內腐病的致病菌及其生物學特性，采用組織分離法獲得菌株ZHZF21，通過形態學特征及ITS、TUB2、CAL 多基因序列分析對該菌株進行鑒定，以菌絲塊有傷接種法測定菌株ZHZF21的致病性，并對其生物學特性進行研究。結果表明，菌株ZHZF21的菌落呈墨綠色環狀同心圓圈，具備有性和無性繁殖階段。該菌株的序列與GenBank中編號為NDSTY31的果生炭疽菌（Colletotrichum fructicola）聚為一支。結合菌落形態特征及分子樹將ZHZF21初步鑒定為果生炭疽菌。將菌株ZHZF21接種栗果后產生褐色病斑，與自然發病癥狀一致。該菌株在5～35 ℃均可生長，最適生長溫度為25 ℃，致死溫度為45～50 ℃，最適pH為6；在全黑暗條件下生長最快，阿拉伯樹脂糖和酵母的利用率最高，乳糖的利用率最低，幾乎不能利用尿素。

關鍵詞：板栗；內腐病；病原菌鑒定；果生炭疽菌；生物學特性

doi：10.13304/j.nykjdb.2023.0871

中圖分類號：S664.2 文獻標志碼：A 文章編號：1008‐0864（2024）09‐0122‐07

板栗（Castanea mollissima Blume）起源于中國，屬于殼斗科、栗屬堅果類植物。板栗果實富含淀粉、膳食纖維、維生素C，且不含麩質，還具有一定的藥用價值[1]。據統計，2018年中國板栗的種植面積已擴大至34.1萬hm2，產量達196.5萬t，我國作為板栗出口第一大國，其產品遠銷日本、韓國、越南等國家[2]。近年來，板栗內腐病發生較為嚴重，造成板栗品質下降，嚴重影響板栗的出口貿易及經濟價值。華娟等[3]認為，湖北省羅田縣地區板栗的致病菌為栗疫菌（Cryphonectria parasitica）和擴展青霉（Penicillium expansum）；朱祎一等[4]明確了層出鐮刀菌（Fusarium proliferatum）、皮落青霉（Penicillium crustosum）和鏈格孢菌（Alternariaalternata）為貴州省望謨縣冷藏期腐爛板栗的主要致腐菌；張娜娜等[5]通過鑒定發現，河北省遷西縣板栗內腐病的致病菌為3種鐮刀菌，分別為禾谷鐮刀菌（Fusarium graminearum）、層出鐮孢菌（Fusarium proliferatum）、木賊鐮刀菌（Fusariumequiseti）。由于板栗內腐病的致病菌復雜多樣，防治難度較大，因此鑒定病原菌及其生物學特性至關重要。本研究采用組織分離法從感病板栗仁上分離致病菌，通過形態學特征及ITS、TUB2、CAL 多基因序列分析對菌株進行鑒定，以菌絲塊有傷接種法測定分離菌株的致病性，并研究其生物學特性，旨在為明確板栗內腐病病原種類及病害的防控提供可靠的理論基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

2022年9月21日從河北省遵化市燕山板栗經銷處購入的燕山早豐健康栗果于冷庫（?2.5～2.5 ℃）貯存。

PDA培養基：馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂粉12 g、蒸餾水1 000 mL。Czapek 培養基：蔗糖30 g、NaNO3 2 g、K2HPO4 1 g、MgSO4·7H2O 0.5 g、KCl 0.5 g、FeSO4·7H2O 0.01 g、瓊脂15 g、蒸餾水1 000 mL。

儀器包括臺式鼓風干燥箱（TLD-240，上海實貝儀器設備廠）、超凈工作臺（SW-CJ-2F，上海博訊醫療生物儀器）、智能生化培養箱（ZGZ-450C，上海丙林電子科技有限公司）、Nikon生物顯微鏡（ECLIPSE SI，尼康精機有限公司）、高通量樣品研磨機（CK1000，北京托摩根生物科技有限公司）、高速冷凍微型離心機（D3024R，SCILOGEX）、PCR儀、電泳儀 （DYY-6C，北京市六一儀器廠）、UVP凝膠成像系統（BioSpectrum 600，Analytik Jena USLLC）；試劑包括DNA Marker DL 2000（北京六合通經貿有限公司）、Master Mix、NuClean PlantGenomic DNA Kit（江蘇康為世紀生物科技股份有限公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 病原菌的分離及形態學鑒定

采用組織分離法[6]分離病原菌。用無菌刀片在發病栗仁的病健交接處切取大小為3 mm×3 mm的組織塊；75%乙醇消毒30 s，無菌水清洗30 s后，將其置于無菌吸水紙上吸干水分；隨后將組織塊轉移到PDA固體培養基上25 ℃恒溫培養2～3 d，待長出菌落后進行純化培養獲得菌株，將其命名為ZHZF21，4 ℃保存。將該菌株接種PDA 平板于25 ℃恒溫暗培養3 d后，在顯微鏡下觀察菌落生長情況和形態特征。

1.2.2 病原菌分子生物學鑒定

病原菌在PDA培養基上培養5～7 d，采用滅菌載玻片刮取菌絲，轉移到無菌的2 mL離心管中，放進2顆無菌鋼球，在研磨機里充分研磨。采用NuClean Plant GenomicDNA Kit提取病原菌DNA，按試劑盒說明書操作步驟進行。所用引物見表1[7]。PCR體系：模板DNA2 μL，Master Mix 25 μL，正反向引物（10 μmol·L?1）各2 μL，ddH2O 19 μL。PCR 程序：94 ℃預變性5 min；94 ℃ 變性30 s；55 ℃ 退火45 s；72 ℃延伸1 min，30個循環；最后72 ℃延伸10 min；4 ℃保存。PCR產物通過1%瓊脂糖凝膠電泳完成相應的擴增產物質量檢測。依據電泳結果委托上海生工完成測序。將獲得的序列在NCBI （http：//www.ncbi.nlm.gov） 數據庫中進行BLAST比對分析，并提交至GenBank。根據GenBank中已報道的其他相關病原菌序列信息，通過Mega７軟件采用鄰接法構建系統發育樹，Bootstrap檢驗重復次數為1 500次。

1.2.3 致病性鑒定

采用菌絲塊有傷接種法[8]，用75% 乙醇對健康栗仁進行表面消毒，再用無菌水沖洗干凈，將處理好的栗仁置于鋪有保濕濾紙的平皿中，用注射器針尖刺傷栗仁，將培養4 d的菌絲塊接種到栗仁傷口處，用保鮮膜包裹好，置于培養皿中25 ℃培養24 h后去除菌絲塊。以接種不含病原菌的PDA 培養基塊作為對照，每處理5個栗仁，3次重復。8 d后觀察栗仁是否感病及發病癥狀，并做好記錄，對接種后發病的栗果，再次分離病原菌，與接種病原菌進行比較。

1.3 板栗內腐病病原菌生物學特性的測定

1.3.1 溫度對病原菌菌絲生長的影響

用直徑7 mm打孔器在活化培養3 d的病原菌菌落邊緣打取菌餅，接種于PDA 平板中央，分別置于5、15、20、25、30和35 ℃恒溫暗培養，6 d后用十字交叉法測量菌落直徑，每處理接種3 個培養皿，重復3次。

1.3.2 pH對病原菌菌絲生長的影響

用1 mol·L?1HCl和1 mol·L?1 NaOH將PDA培養基的pH分別調節至4、5、6、7、8和9，用直徑7 mm打孔器在活化培養3 d的病原菌菌落邊緣打取菌餅，分別接種在不同pH的PDA平板上，25 ℃恒溫培養6 d后，用十字交叉法測量菌落直徑，每處理接種3個培養皿，重復3次。

1.3.3 光照對病原菌菌絲生長的影響

用直徑7 mm打孔器在活化培養3 d的病原菌菌落邊緣打取菌餅，接種于PDA平板上，分別置于智能生化培養箱中24 h黑暗、24 h光照和12 h黑暗/12 h光照條件下，25 ℃恒溫培養，6 d后用十字交叉法測量菌落直徑；每處理接種3個培養皿，重復3次。

1.3.4 碳、氮源對病原菌菌絲生長的影響

選擇Czapek培養基為基礎培養基，以等質量的乳糖、木糖、葡萄糖、果糖、阿拉伯樹脂糖分別置換Czapek培養基中的蔗糖制備不同碳源的培養基；以相同含氮量的酵母、牛肉膏、硝酸鉀、硫酸銨和尿素置換Czapek培養基中的硝酸鈉制備不同氮源的培養基。用直徑7 mm打孔器在活化培養3 d的病原菌菌落邊緣打取菌餅，接種于含有不同碳、氮源的Czapek培養基上，25 ℃恒溫暗培養6 d后以十字法測量菌落直徑，每處理接種3個培養皿，重復3次。

1.3.5 病原菌的致死溫度的測定

將直徑為7 mm的果腐病菌菌餅轉入裝有等量無菌水的試管中，將各試管分別放入40、45、50、55和60 ℃恒溫水浴鍋中，水浴10 min，隨后用無菌吸水紙吸干水分轉移至PDA平板上，每處理接種3個培養皿，重復3次，培養48 h后觀察菌絲生長情況。

1.4 數據分析

采用DNAMAN 和MEGAX 軟件構建系統發育樹，采用SPSS 26軟件進行試驗數據的統計分析，應用Duncan 氏新復極差法進行差異顯著性檢驗。

2 結果與分析

2.1 板栗內腐病病原菌鑒定

菌株ZHZF21在PDA培養基上25 ℃恒溫培養6d，菌落直徑可達7.8 cm。菌株菌落呈墨綠色環狀同心圓圈（圖1A）。初期菌落呈白色，氣生菌絲濃密，呈現放射狀不斷擴展（圖1B）；3 d時菌絲中央呈現淺粉色，外圈菌落邊緣乳白色；5 d時菌落中心菌絲上出現灰色的小顆點；10 d后菌落變為黑灰色。分生孢子盤上長有簇生的分生孢子梗，分生孢子梗上著生分生孢子，并伴有剛毛（圖1C）；分生孢子呈無色透明、圓柱狀、兩端鈍圓、內含油滴，單細胞，孢子大小為（4.26～6.59） μm×（9.08～15.23） μm（圖1D）。培養15 d后，PDA培養基上產生橘黃色分生孢子堆（圖1E）；培養20 d后可見有性態，PDA上有黑色凸起狀物，子囊殼為圓球形（圖1F），子囊呈柱狀簇生，有隔膜（圖1G）。單條子囊內有8個呈梭狀的子囊孢子，子囊孢子為單細胞，無色透明，長橢圓形（圖1H）。結合菌落形態，初步將菌株ZHZF21鑒定為果生炭疽菌（Colletotricham fructicola）。

對菌株ZHZF21進行分子鑒定，分別獲得579、493 和785 bp 的片段，將3 組序列在NCBI 進行blast，基因登錄號分別為ON509652、OQ436783 和ON513388。下載GenBank中同源性在95%以上的該模式菌株參考序列，用MEGAX軟件構建系統發育樹，結果（圖2）表明，菌株ZHZF21 與編號為NDSTY31的Colletotrichum fructicola 菌株聚為一支，且節點支持率為100%，由此表明，菌株ZHZF21為果生炭疽菌。

2.2 菌株ZHZF21 的致病性

板栗內腐病為果實病害，發病時病斑為褐色，向栗果內部侵染，果皮褪色，著生黑色小點，為病菌的分生孢子器（圖3A）；將菌株ZHZF21的菌餅接種于板栗果仁8 d后，栗仁表面紅褐色，切開病斑剖面，病斑向栗仁中心侵染，栗仁內部病斑直徑6.7～8.5 mm；濕度大時，病斑擴展速度較快，腐爛變色，有霉爛味（圖3B），發病率100%。對照組栗果未發病（圖3C）。對發病部位再次進行病原菌的分離，根據形態學特征和分子鑒定與原接種菌株一致。

2.3 菌株ZHZF21 的生物學特性

2.3.1 溫度、pH 和光照條件對菌絲生長的影響

由圖4可知，菌株ZHZF21在5～35 ℃下都能生長菌絲，在25 ℃條件下菌落直徑最大，為78.06 mm；而在5和35 ℃條件下，菌落幾乎不生長。不同pH下培養6 d，菌株在pH 為6 時菌落生長最快，菌落直徑達78.22 mm；當pH 為4時菌落生長最慢，為25.04 mm，推斷該菌株在弱酸性至弱堿性的條件下生長較快。在不同光照條件培養6 d，菌株在24 h黑暗條件下生長最快，菌落直徑達78.84 mm；在24 h光照條件下生長相對較差；在12 h光照的條件下生長最慢，菌落直徑為70.52 mm。

2.3.2 碳源和氮源對菌絲生長的影響

由圖5可知，不同碳源培養基表現為阿拉伯樹脂糖gt;乳糖gt;葡萄糖gt;果糖gt;木糖gt;蔗糖，即對阿拉伯樹脂糖的利用率最好，菌落培養6 d可達70.34 mm；不同氮源培養基表現為酵母gt;牛肉膏gt;硝酸鈉gt;硝酸鉀硫酸銨gt;尿素，即在酵母培養基上生長最好，菌落直徑可達73.13 mm，在尿素培養基上幾乎不生長，菌落直徑僅不到5 mm。

2.3.3 病原菌的致死溫度

由圖6 可知，菌株ZHZF21在40～45 ℃下培養6 d仍可繼續生長，而在50 ℃條件下未見菌絲生長。由此推斷，菌株ZHZF21菌絲生長的致死溫度為45～50 ℃。

3 討論

本研究在形態學特征觀察的基礎上，結合ITS、TUB2 和CAL 基因的系統發育分析，將引起板栗內腐病的病原菌鑒定為果生炭疽菌（C.fructicola）。果生炭疽菌隸屬于膠孢炭疽菌復合種（Colletotrichum gloeosporiodes species complex），最初報道的是泰國的咖啡果生炭疽病，其模式種被指定為MFLU090228，該菌株現保存為ICMP18581[9]。果生炭疽菌不僅可侵染板栗，還可侵染多種經濟作物，如核桃、桑樹、芒果、油茶、柑橘、蘋果、臭椿炭，涉及廣西、廣東、貴州、湖南、四川、陜西、河南等多個省（自治區、直轄市）[10-16]。由此可見，果生炭疽菌在我國分布十分廣泛。

本研究從患病的板栗果仁上分離獲得致病菌，將其命名為ZHZF21，其最適生長溫度為25 ℃，與周嬡婷等[17]結果一致；致死溫度為45～50 ℃，與任立超等[18]的結果一致，但與其最適生長溫度和pH結果存在差異，這可能與不同地區的生存環境和不同植物寄主有關[19]；菌株ZHZF21在全黑暗的條件下生長最快；在不同碳源的培養基上，其菌絲生長表現為阿拉伯樹脂糖gt;乳糖gt;葡萄糖gt;果糖gt;木糖gt;蔗糖；在不同氮源的培養基上，菌絲生長表現為酵母gt;牛肉膏gt;硝酸鈉gt;硝酸鉀硫酸銨gt;尿素，其中在尿素培養基上幾乎不生長，這與宋麗麗等[20]的研究結果一致，由此推斷，可用尿素來抑制果生炭疽菌的發生。

近年來板栗內腐病的發生逐年加重，嚴重影響了板栗的產量和品質。本研究明確了板栗內腐病的致病菌為果生炭疽菌，并對其生物特性進行了系統分析，對于病害防控具有重要指導意義。

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基金項目：河北省板栗產業協同創新中心項目（2022—2023）。