超高壓處理對赤霞珠葡萄揮發性物質的影響

摘要：為改善釀酒葡萄原料的香氣品質，研究不同超高壓處理條件對赤霞珠葡萄果實揮發性物質的影響，利用頂空固相微萃取（headspace-solid phase microextraction，HS-SPME）與氣相色譜-質譜聯用技術（gaschromatography-mass spectrometry，GC-MS），對不同超高壓條件處理的葡萄果實揮發性物質進行測定，結合主成分分析與香氣輪廓描述對其特征香氣進行分析。結果表明，不同處理條件下的果實揮發性物質與對照相比均發生顯著變化（Plt;0.05）；主成分分析發現，400 MPa壓力操作及25 min的處理時間均與果實中具有草本、果香氣味的醛、酮類物質有較高的相關性；香氣輪廓分析發現，一定的壓力與時間處理可顯著提高赤霞珠葡萄的氣味強度。以上研究結果為超高壓技術在葡萄酒生產中的應用與推廣提供了一定的數據參考和技術支持。

關鍵詞：超高壓；揮發性物質；主成分分析；香氣輪廓分析

doi：10.13304/j.nykjdb.2022.1036

中圖分類號：S663.1；TS261 文獻標志碼：A 文章編號：1008‐0864（2024）09‐0146‐13

揮發性香氣物質是構成果實風味的重要因素之一，對果實品質及其制品影響較大[1]。水果中含有的香氣物質約有2 000多種[2]，這些物質的種類和含量除與果實本身的品種類型、栽培方式和儲藏條件等有關外，還會受到加工操作的影響。特別是隨著食品工業的發展，一些非熱加工技術逐漸應用到食品加工領域，其中超高壓技術（high hydrostaticpressure processing，HHP）由于低能耗、低排放、高科技、高效率的特點越來越受到青睞[3]。

HHP又稱為高靜水壓技術，是指將樣品置于包裝材料內，放入以水或其他流體的傳壓介質中，在100 MPa以上的壓強條件下處理，從而達到對樣品殺菌、滅酶甚至改性的操作[4]。盡管該技術最初作為一種非熱殺菌方式來提高產品的安全性和保質期，但研究發現，HHP能最大程度地保留食品的營養成分，保持其天然風味，因此在果蔬加工中具有較高的商業應用價值。HHP可顯著增加桑椹汁中醛類、酮類和醇類等物質的含量[5]。哈密瓜汁在經HHP處理后，不僅可以增強其新鮮氣味和香甜氣息，還使樣品中酮類和醛類等物質數量增多[6]。隨著加壓時間的延長，HHP處理能更好地保留獼猴桃[7]、芒果汁[8]中的特征香氣組分，增強其草本、新鮮的香氣特點。也有研究指出，HHP處理存在香氣損失的風險，相比其他操作，500 MPa會造成鮮榨橙汁更多的香氣損失[9]；600 MPa、20 min處理會使獼猴桃汁中醇類的數量和含量減少[10]。因此，HHP對果蔬香氣的影響取決于原料種類和具體處理條件。

赤霞珠葡萄作為常見的歐亞種釀酒葡萄，具有良好的品質特性和田間表現，已成為全球種植面積最大的紅色釀酒品種[11]，對于其風味質量的研究，特別是香氣品質已有大量的報道[12-15]，但有關HHP對其香氣影響的研究目前還很少見。隨著HHP在葡萄酒生產中的逐步應用，開展其對釀酒葡萄原料品質改良的研究，將為進一步分析該技術對葡萄原料風味品質的影響及其產品質量提升提供參考。因此，本研究以赤霞珠葡萄為試驗材料，利用頂空-固相微萃取（headspace-solidphase microextraction，HS-SPME）與氣相色譜-質譜聯用技術（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS），研究不同HHP處理條件對葡萄果實香氣的影響，并在此基礎上通過主成分（principalcomponent ，PC）分析與香氣輪廓描述研究HHP處理對赤霞珠葡萄主要香氣物質及其氣味強度的影響，以期為HHP在葡萄酒生產中的應用與推廣提供數據參考和技術支持。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 材料與試劑

赤霞珠葡萄果實（可溶性固形物23.3 oBrix，pH 3.49）采自甘肅張掖國風葡萄酒業有限公司種植基地。NaCl（分析純）和2-辛醇、4- 羥基-4- 甲基-2- 戊酮、3- 羥基己酸乙酯、C9-C20烷烴標樣均購自Sigma-Aldrich公司。

1.1.2 儀器與設備

超高壓處理設備，天津華泰森淼生物工程技術有限公司；Hero電動研磨機；DZ500/2D 抽真空包裝機，瑞安瑞寶包裝機械制造有限公司；電子天平，上海佑科儀器儀表有限公司；TRACE 1310氣相色譜-質譜聯用儀、ISQ型單四級桿質譜儀，美國Thermo Scientific 公司；色譜柱DB-WAX（60 m×0.25 mm×0.25 μm），美國Agilent Technologies 公司；固相微萃取（SPME）裝置、50/30 μm DVB/CAR/PDMS 萃取頭，美國Surpelco公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 樣品制備

選擇無病蟲害的樣品，去除果梗后，隨機挑選100 g于真空袋密封后進行超高壓處理。

1.2.2 HHP處理

設定100、200、300、400、500 MPa（25 min）共5 個不同壓力梯度和5、15、25、35、45 min（ 300 MPa）共5個不同時間梯度，將裝好的葡萄果實置于超高壓內進行試驗，重復3次；以未處理的葡萄果實作為對照（CK），將處理后的果實液氮速凍，-80 ℃保存待測。

1.2.3 揮發性物質的測定

①揮發性物質的提取。參照張克坤等[16]方法并進行改進。果實樣品去籽，用研磨機粉碎勻漿后取5.0 g于20 mL頂空瓶中，加入內標（4-羥基-4-甲基-2-戊酮、3-羥基己酸乙酯、2-辛醇）各10 μL及1.0 g NaCl，加轉子密封，于磁力攪拌器上40 ℃水浴平衡30 min后頂空萃取30 min，進行GC-MS分析，重復3次。

② 揮發性物質測定。氣相色譜條件為DB-WAX色譜柱，進樣口溫度250 ℃；升溫程序：初溫50 ℃保持5 min，以6 ℃·min-1升至230 ℃，保持10 min；載氣：高純氦（He）氣；流速1.0 mL·min-1；不分流進樣。質譜分析：電子電離源；電子能量70 eV；傳輸線溫度230 ℃；離子源溫度250 ℃；掃描質荷比（m/z）范圍50～450。

香氣化合物的定性分析采用質譜全離子掃描圖譜，根據化合物的保留指數、NIST-11 及Wiley譜庫檢索對比進行定性分析；定量分析采用內標法進行半定量分析，計算公式如下。

各揮發性物質含量=各揮發性物質的峰面積× 內標物的含量／內標物的峰面積（1）

1.2.4 關鍵香氣分析

通過氣味活性值（odorantactivity value，OAV）來判斷不同香氣揮發性物質對赤霞珠葡萄的貢獻，果實中某種香氣的氣味活性值計算如下式所示。

OAV=香氣化合物含量／香氣閾值（2）

1.2.5 香氣輪廓分析

香氣根據葡萄酒香氣輪盤進行分類[17]，并結合本試驗中香氣物質的氣味描述，將香氣分為6類，分別為草本香、果香、花香、脂肪味、化學香、堅果香。每種香氣類別中特征香氣化合物的OAV相加，來構建赤霞珠葡萄果實的香氣輪廓。

1.3 數據處理

采用Excel 2010 進行數據統計，運用Origin2018繪圖，采用SPSS 20.0進行顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 不同HHP 處理對赤霞珠葡萄揮發性物質的影響

2.1.1 不同壓力處理對揮發性物質的影響

如表1所示，各處理下葡萄果實的香氣主要由醇、醛、酮、酯、芳香族、萜烯和其他類化合物構成，含量從高到低依次為醛類（73.20%～85.34%）、酮類與醇類（8.22%～13.89%）、其他（4.02%～11.41%）、萜烯類與芳香族（0.59%～1.48%）和酯類（0.00%～0.06%），這些物質為葡萄果實帶來草本香、花香和果香等，構成了赤霞珠葡萄特有的風格表現。在對照葡萄樣品中共檢測到27種揮發性物質，其中醇類5種、醛類10種、酮類5種、酯類1種、芳香族3種、萜烯類1種、其他2種。經HHP處理后，香氣物質的種類發生不同程度的變化，其中在較低壓力下（≤300 MPa），香氣化合物種類均減少至26種，但在400、500 MPa較高壓力時，香氣物質種類卻分別減少至24和23種，這可能與較高壓力條件使樣品體系的溫度升高，從而促進部分化合物氧化分解有關[18]。

醇類是赤霞珠葡萄中一類重要的香氣物質，由表1可知，其總量在HHP處理后均低于對照，其中具有草本氣味的己醇與反-2-己烯醇的含量在所檢測到的醇類化合物中相對較高，約占醇類物質總量的84.34%～87.27%。處理后果實中己醇含量隨壓力的增加呈逐漸降低的變化趨勢，當壓力在100 MPa時其含量約為對照的1.14倍；當壓力上升至300 MPa時，己醇的含量有所下降，但仍高于對照5.72%；而當壓力達到400～500 MPa時，其含量卻較對照分別降低33.20%和7.43%。另外，反-2-己烯醇含量則在HPP處理下均出現低于對照的現象，可能是在加壓過程中，高壓可以增強醇-水之間的氫鍵締合能力，影響醇類物質的揮發[19]。

具有綠葉青香與花香的醛類物質是葡萄果實整個發育過程中含量占比較高的揮發性化合物[20]。本研究發現，醛類物質含量隨壓力的不同而發生不同程度的變化，并在400～500 MPa時，其種類明顯減少。其中，有綠葉與水果氣味的C6醛（反-2-己烯醛、己醛）是檢測到醛類化合物中含量相對較高的物質，約占醛類化合物總量的98.83%以上，其含量在HHP處理后隨壓力的增加呈現先增加后降低的變化趨勢，并在400 MPa下2種物質的含量均達到峰值，相比對照分別增加15.80%和42.49%，推測這將有助于提高處理果實的整體風味感受。另外還檢測到具有青香與花香的C9醛類（反-2-壬烯醛、反-2， 順-6-壬二烯醛），這些物質也表現出先增加后減小的變化趨勢，并在壓力超過400 MPa后含量變為痕量。

表1顯示，酮類物質的種類未發生變化，其含量在處理后隨壓力的升高呈現先增加后降低的趨勢，在400 MPa處理下其總含量達到最大。4-甲基-3-戊烯-2-酮（具有甜香）是酮類化合物中含量最高的物質，占酮類總量的69.35%～74.67%，其含量變化趨勢與1-戊烯-3-酮（化學氣味）和異佛爾酮（呈現薄荷和甜香）一致，均在加壓400 MPa時達到最大，并較對照分別增加32.59%、32.69%和53.03%。1-戊烯-3-酮具有刺激性氣味[21]，可能會帶來一定的負面影響。

本研究只檢測到順-3-己烯乙酸酯1種酯類化合物，但在加壓處理后該物質卻在樣品中有所缺失。HHP會使酯類物質種類減少，可能與HHP會影響酯類形成酶的活性有關[7]。此外，樣品中還檢測到苯甲醇、苯乙醇、苯甲醛3種芳香族物質，其種類隨著壓力的增加未發生改變，而含量則呈現先增加后降低的趨勢，總含量在200 MPa處理下達到峰值。其中，苯甲醇（甜香與堅果香）和苯乙醇（甜香、玫瑰和蜂蜜氣味）在加壓200 MPa時含量最高，分別較對照增加45.24%和59.09%，而具有果香與堅果香的苯甲醛則在加壓400 MPa下含量達到最大，較對照增加1.05倍。苯甲醇、苯乙醇和苯甲醛都屬糖苷結合類物質，可在糖苷酶的作用下產生[22]，一定的壓力處理可激活糖苷酶的活性，從而使葡萄果實中與糖苷結合類的香氣物質得到釋放[23]。

2.1.2 不同時間處理對揮發性物質的影響

由表2可知，不同時間處理下檢測到30種香氣物質，包含醇類5種，醛類12種，酮類5種，酯類2種，芳香族3種，萜烯類1種，其他2種。盡管各時間處理下的揮發性物質數量有所不同，但統計結果并無差異（Pgt;0.05）。計算各處理揮發性物質總量發現，醛類物質的含量最高，達到香氣物質總量的74.14%～85.81%，其次是酮類與醇類物質總和，占香氣總量的9.17%～15.87%，而酯類的含量僅有0.00%～0.13%。

在不同時間處理下，赤霞珠果實中的香氣物質種類與含量發生了不同程度的改變。醇類物質中，己醇在加壓35 min 時含量低于對照樣品18.84%，其他時間處理則均高于對照，并在加壓45 min后其含量增加1.26倍。反-2-己烯醇在加壓5～35 min內含量均低于對照，但在加壓45 min后含量卻明顯升高，較對照增加92.45%。1-辛烯-3-醇在加壓處理后其含量均高于對照，并在35min 處理時達到極值，較對照顯著增加87.78%。

醇類含量的改變可能與一定時間的加壓處理激活了果實中醇類結合態香氣的糖苷酶活性，促進了香氣物質的釋放有關[8]。醛類化合物在35 min內的處理未造成明顯的種類變化，而在45 min處理后，樣品中新增2-甲基丁醛（可可、杏仁味）和3-甲基丁醛（青香、麥芽香和花香）2種化合物。己醛、順-3-己烯醛、庚醛、反-2-己烯醛、己醛二乙縮醛、反， 反-2， 4-庚二烯醛、反-2， 順-6- 壬二烯醛等化合物含量均在加壓25 min 處理下達到峰值，與對照相比增加1.05～2.24倍，而反-2-庚烯醛、反-2-辛烯醛、反-2-壬烯醛含量則在加壓45 min后達到最大，與對照相比提高1.24～2.11 倍。醛類多與植物的草本風味相關[24]，不僅會為樣品帶來令人愉快的清新感，而且還是部分果香酯類的前體物質[25]，因此在不同時間處理下，醛類物質的升高將有助于提高赤霞珠葡萄及其加工產品的風味特征。

酮類物質的含量在5～35 min 處理下呈先增加后降低的趨勢，并在25 min時達到最高，可能是HHP影響酶的活性或是化學反應過程，從而間接影響酮類含量[26]。HHP處理前后在樣品中檢測到2種酯類物質，順-3-己烯乙酸酯僅在未處理葡萄中有發現，而辛酸乙酯在加壓15 min以上時被檢測到。處理后隨著時間的增長，酯類化合物總量呈現先增加后降低的變化，并在15 min時達到最高。檸檬烯在不同時間處理下含量顯著下降，較對照降低38.64%～55.48%，可能與檸檬烯易在高壓處理時發生氧化反應有關[27]。

2.2 不同HHP 處理對赤霞珠葡萄特征香氣物質的影響

OAV 的大小取決于香氣化合物的含量和閾值[28]，對試驗中所檢測到的13種OAVgt;0.1的揮發性香氣物質進行主成分分析，進一步了解HHP對赤霞珠葡萄香氣的影響。

2.2.1 不同壓力處理對特征香氣物質的影響

如圖1所示，其中第1到第3主成分的累積貢獻率為88.91%，滿足主成分分析的降維要求。由圖1A、B可知，1-戊烯-3-酮（C1）、庚醛（B3）、反-2-庚烯醛（B5）、反-2-己烯醛（B4）、己醛（B1）在PC1上具有較高的載荷，主要表現具有脂肪、水果氣味的化合物信息；順-3-己烯醛（B2）、反-2， 順-6-壬二烯醛（B8）、反-2-壬烯醛（B7）在PC2 上具有較高的載荷，說明其呈現了具有草本香與水果香的醛類物質特征；PC3則與反-2-己烯醇（A2）、檸檬烯（D1）、順-3-己烯醇（A1）、1-辛烯-3-醇（A3）等的相關性較高，反映其具有青香和蘑菇香的氣味特點。由圖1C可知，加壓400 MPa與對照處理位于PC1的正半軸，且400 MPa 有較高的PC1 正值，表明其與反-2-庚烯醛、反-2-辛烯醛、1-戊烯-3-酮等化合物的相關性較高，這將增強供試樣品的果香氣味。加壓200 與100 MPa 處理位于PC3 的正半軸，且200 MPa具有較高的PC3正值，表明200 MPa下赤霞珠葡萄可能具有較濃郁的草本香。而500 MPa處理位于PC1、PC2與PC3的負半軸，表明此時葡萄果實的香氣表現可能不突出。

2.2.2 不同時間處理對特征香氣物質的影響

如圖2所示，PC1的貢獻率為60.75%，反映了反-2-壬烯醛（B7）、反-2， 順-6-壬二烯醛（B8）、庚醛（B3）、己醛（B1）、反-2-庚烯醛（B5）、順-3-己烯醇（A1）、反-2-己烯醇（A2）、反-2-辛烯醛（B6）等具有草本香、果香與花香的大部分香氣化合物；PC2 的貢獻率為20.23%，反映了順-3-己烯醛（B2）與檸檬烯（D1）等具有花香與水果香化合物的信息；PC3的貢獻率為11.00%，反映了1-辛烯-3-醇（A3）、反-2-己烯醛（B4）和1-戊烯-3-酮（C1）等化合物的信息，3個主成分的累積貢獻率為91.98%，適用于降維分析標準。由圖2C可知，25 min處理位于PC1、PC2、PC3的正半軸，主要呈現己醛、順-3-己烯醛、庚醛、反-2-己烯醛、反-2， 順-6-壬二烯醛、1-戊烯-3-酮等醛酮類化合物的信息，賦予了葡萄果實濃郁的草本氣味。加壓45 min處理分布于PC1的正半軸，主要與順-3-己烯醇、反-2-己烯醇、反-2-庚烯醛、反-2-辛烯醛和反-2-壬烯醛具有較高的相關性，為葡萄帶來了脂肪與草本氣味。而5和15 min處理均位于PC1與PC3的負半軸，35 min處理位于PC1與PC2的負半軸， 表明這3種處理對供試樣品氣味的影響較小。

2.3 不同HHP 處理對赤霞珠葡萄香氣輪廓的影響

2.3.1 不同壓力處理對香氣輪廓的影響

由圖3A和表3可知，不同壓力下供試樣品的香氣輪廓相似，主要由草本香、果香與花香構成，其中草本香的氣味強度最高，其次是花果香、脂肪味、化學香，堅果香則較低。比較不同壓力處理樣品的香氣輪廓發現，當加壓200 MPa時，赤霞珠葡萄中的草本香與花香強度顯著高于其他處理，而果香與對照無明顯差異，可能與其有較高含量的順-3-己烯醇、反-2-己烯醇、反-2， 順-6-壬二烯醛等物質有關。在400 MPa處理下，果香顯著高于其他處理，而草本香與花香顯著低于對照，這主要與其具有較高含量的庚醛、反-2-辛烯醛等物質相關。而100與300 MPa處理下果實的草本氣味強度相似，其中100 MPa 處理樣品的果香氣味強度低于300 MPa處理，而花香則前者高于后者。當壓力達到500 MPa時，赤霞珠葡萄中的草本和果香均顯著低于其他處理，說明此處理對葡萄果實的整體香氣沒有突出表現。

2.3.2 不同時間處理對香氣輪廓的影響

由圖3B和表3可知，不同時間處理的葡萄果實香氣輪廓與壓力處理相似，其中草本、果香為主要的特征香氣。對不同處理下的香氣輪廓研究發現，加壓25 min時樣品的草本、花果香的特征比較突出，顯著高于其他處理，這主要與該處理條件下己醛、反-2-己烯醛、反-2， 順-6-壬二烯醛含量升高有關。此外，加壓45 min處理也可提高供試樣品的草本、花果香，但其影響明顯低于25 min。與對照相比，其他時間處理（5、15、35 min）對葡萄果實特征香氣的影響無明顯變化，表明其對整體的香氣貢獻較小。

3 討 論

超高壓作為一種非熱加工技術，可以相對完整地保留果蔬及其制品的品質。本試驗研究了超高壓在不同壓力與時間處理下對赤霞珠葡萄果實揮發性物質的影響，結果表明，隨著處理壓力與處理時間的增加，各揮發性物質均發生顯著變化（Plt;0.05），但適度的HHP條件對保留和提升處理樣品的香氣具有重要作用。在不同壓力處理下，醇類化合物總量隨壓力的增加而顯著降低，這與Zhang等[8]的研究結果一致，這可能與HHP增加了醇脫氫酶的活性，從而促進醇類物質轉化與代謝，導致其含量減少有關。此外，本研究中當壓力達到400 MPa時，己醛、順-3-己烯醛、反-2-己烯醛、反-2-庚烯醛的含量顯著升高，可能與脂氧合酶的活性變化相關，有助于增強樣品中的草本香與果香，類似的結果在馬永昆等[6]和邊磊[29]的研究中也有報道。也有研究發現，HHP處理會存在果蔬風味劣變的風險，如壓力較高（800 MPa、20 min-1）造成草莓青香風味的改變[30]，這與本試驗在500 MPa處理時所得的結果一致。此外，香氣物質的變化還與超高壓作用的時間密切相關。本研究發現，在不同時間處理下，隨著處理時間的延長（15～25min），樣品中酯類化合物種類與含量減少，而芳香族化合物含量增加，可能與HHP對形成上述物質的酶活性影響有關[23，31]。有研究表明，HHP 會改變酶與香氣物質的關系，一定的壓力處理會造成酶促反應活性位點的重排[32]，甚至還會造成底物[33]與代謝物[34]的變化。

主成分分析表明，400 MPa處理與反-2-庚烯醛、反-2-辛烯醛、1-戊烯-3-酮等具有較高的相關性，25 min處理與己醛、順-3-己烯醛、庚醛、反-2-己烯醛、反-2， 順-6-壬二烯醛等物質的相關性較高，推測在這2種處理下可提高樣品中草本和果香氣味含量，同樣的結果在吳夢等[35]對桑葚飲料的研究中也有體現。本研究僅分析了超高壓處理壓力與處理時間對赤霞珠葡萄揮發性物質的影響，而對處理時間及各因素間相互作用的影響還未研究，在本研究結果的基礎上，需重點測定和分析影響香氣物質的部分酶類（脂氧合酶、醇脫氫酶、酰基轉移酶、過氧化氫裂解酶等）活性及其前體物的變化情況，逐步明確HHP對揮發性物質的影響。

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基金項目：甘肅省隴原青年英才項目（GSRC-202311173）；甘肅省自然科學基金項目（20JR10RA519）；甘肅省葡萄酒產業發展專項資金項目（GSPTJZX-2020-4）；甘肅省現代水果產業體系項目（GARS-SG-7）。