LncRNA MALAT1對PCOS顆粒細胞凋亡、自噬和PI3K/Akt/mTOR通路的影響

摘要：目的 探討長鏈非編碼RNA-肺腺癌轉移相關轉錄子1（LncRNA MALAT1）對多囊卵巢綜合征（PCOS）顆粒細胞的凋亡、自噬和磷脂酰肌醇-3-激酶（PI3K）/蛋白激酶B（Akt）/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）通路的影響。方法 qRT-PCR檢測PCOS卵巢組織、正常卵巢組織、人卵巢顆粒細胞KGN及正常卵巢上皮細胞IOSE80中LncRNA MALAT1的表達水平。體外培養KGN細胞，將KGN細胞分為control組、si-NC組、si-MALAT1組、pc-NC組、pc-MALAT1組、pc-MALAT1+740Y-P（PI3K激活劑）組。qRT-PCR檢測各轉染組細胞MALAT1 mRNA的表達水平；CCK-8檢測細胞活力；流式細胞術檢測細胞凋亡率；透射電鏡觀察KGN細胞中自噬小體；Western blot檢測細胞B細胞淋巴瘤2（Bcl-2）、Bcl-2關聯X蛋白（Bax）、微管相關蛋白Ⅱ輕鏈3（LC3Ⅱ）、微管相關蛋白Ⅰ輕鏈3（LC3Ⅰ）、Beclin1、p-PI3K、PI3K、p-Akt、Akt、p-mTOR、mTOR蛋白表達水平。結果 PCOS卵巢組織MALAT1 mRNA表達水平低于正常卵巢組織，KGN細胞中MALAT1 mRNA表達水平低于正常卵巢上皮IOSE80細胞；control組KGN細胞中可見少量的自噬小體；干擾MALAT1表達后KGN細胞OD450值（24、48、72 h）、Bcl-2蛋白表達降低，細胞凋亡率、Bax、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin1、p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt、p-mTOR/mTOR增高（P＜0.05），自噬小體數量增多；過表達MALAT1后上述指標變化均逆轉（P＜0.05）；與pc-MALAT1組相比，pc-MALAT1+740Y-P組OD450（24、48、72 h）值、Bcl-2蛋白表達降低，凋亡率、Bax、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin1、p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt、p-mTOR/mTOR升高（P＜0.05），自噬小體數量增多。結論 過表達MALAT1可能通過抑制PI3K/Akt/mTOR信號通路，進而抑制PCOS顆粒細胞凋亡和自噬。

關鍵詞：多囊卵巢綜合征；RNA，長鏈非編碼；粒層細胞；細胞凋亡；自噬；LncRNA MALAT1；PI3K/Akt/mTOR通路

中圖分類號：R711.75 文獻標志碼：A DOI：10.11958/20240332

Impacts of lncRNA MALAT1 on apoptosis， autophagy of granulosa cells and

PI3K/Akt/mTOR pathway in polycystic ovary syndrome

QIAO Na， TIAN Ying， CHEN Yang， HAO Jing

Reproductive Medicine Center， Yellow River Sanmenxia Hospital， Sanmenxia 472000， China

Abstract： Objective To investigate the impacts of long non-coding RNA-lung adenocarcinoma metastasis-associated transcripton-1 （lncRNA MALAT1） on apoptosis， autophagy and phosphatidylinositol 3 kinase （PI3K）/protein kinase B （Akt）/mammalian rapasin target protein （mTOR） pathway in granulosa cells of polycystic ovary syndrome （PCOS）. Methods The expression levels of lncRNA MALAT1 in PCOS ovarian tissue， normal ovarian tissue， human ovarian granulosa cells （KGN） and normal ovarian epithelial cells IOSE80 were detected by qRT-PCR. KGN cells were cultured in vitro and grouped into the control group， the si-NC group， the si-MALAT1 group， the pc-NC group， the pc-MALAT1 group and the pc-MALAT1+740Y-P （PI3K activator） group. qRT-PCR was applied to detect the expression level of MALAT1 mRNA in cells of each transfection group. CCK-8 was applied to detect cell viability. Flow cytometry was applied to detect cell apoptosis rate. Transmission electron microscopy was applied to observe autophagosomes in KGN cells. Western blot assay was applied to detect expression levels of B-cell lymphoma 2 （Bcl-2）， Bcl-2 associated X protein （Bax）， microtubule-associated protein Ⅱ light chain 3 （LC3 Ⅱ）， microtubule-associated protein Ⅰ light chain 3 （LC3Ⅰ）， Beclin1， p-PI3K， PI3K， p-Akt， Akt， p-mTOR and mTOR proteins in cells. Results The expression level of MALAT1 mRNA in PCOS ovarian tissue was lower than that in normal ovarian tissue， and that in KGN cells was lower than that in normal ovarian epithelial IOSE80 cells. A small number of autophagosomes were observed in KGN cells in the control group. After interfering MALAT1 expression， OD450 values （24， 48 and 72 hours） and the Bcl-2 protein expression of KGN cells were reduced， and the apoptosis rate， the expression of Bax， LC3 Ⅱ/LC3 Ⅰ， Beclin1， p-PI3K/PI3K， p-Akt/Akt and p-mTOR/mTOR proteins were increased （P＜0.05）. The number of autophagosomes increased. Changes of the above indexes were reversed after overexpression of MALAT1 （P＜0.05）. Compared with the pc-MALAT1 group， the OD450 values （24， 48， 72 h）， and the expression of Bcl-2 protein were obviously reduced in the pc-MALAT1+740Y-P group， while the apoptosis rate， number of autophagosomes， the expression of Bax， LC3 Ⅱ/LC3 Ⅰ， Beclin1， p-PI3K/PI3K， p-Akt/Akt， and p-mTOR/mTOR proteins were obviously increased （P＜0.05）. The number of autophagosomes increased. Conclusion Overexpression of MALAT1 may inhibit apoptosis and autophagy in PCOS granulosa cells by inhibiting the PI3K/Akt/mTOR signaling pathway.

Key words： polycystic ovary syndrome; RNA， long noncoding; granulosa cells; apoptosis; autophagy; LncRNA MALAT1; PI3K/Akt/mTOR pathway

多囊卵巢綜合征（PCOS）是一種育齡婦女常見的內分泌疾病，以胰島素抵抗、無排卵、高雄激素血癥為主要特征［1］。胰島素抵抗、高雄激素血癥會導致患者月經紊亂、卵巢囊腫，抑制顆粒細胞增殖并促進其凋亡，從而加速PCOS進展［2］。長鏈非編碼RNA（LncRNA）是長度不大于200 bp且不編碼蛋白質的RNA，參與增殖、凋亡、分化、自噬等多種過程［3］。肺癌轉移相關轉錄本1（MALAT1）在體外過表達可促進卵巢顆粒細胞增殖并抑制細胞凋亡，在體內過表達可減輕PCOS大鼠卵巢組織損傷和內分泌紊亂［3］。Elmonier等［4］研究表明LncRNA MALAT1在PCOS患者體內低表達，促進PCOS的進展。郭向東等［5］研究表明補腎活血湯通過抑制磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）/蛋白激酶B（Akt）/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）信號通路可以抑制HEI-OC1細胞凋亡。Chen等［6］研究表明阻斷PI3K/Akt/mTOR信號通路可抑制人成纖維細胞線粒體自噬和損傷，提高成纖維細胞活力。筆者推測PI3K/Akt/mTOR信號通路可能也參與PCOS顆粒細胞的凋亡和自噬。本研究就LncRNA MALAT1對PCOS顆粒細胞的凋亡、自噬和PI3K/Akt/mTOR通路的影響進行探究，以期為PCOS的治療提供新靶標。

1 材料與方法

1.1 材料 收集2020年4月—2022年9月在黃河三門峽醫院確診并接受手術治療的30例PCOS患者的卵巢組織以及因卵巢其他良性疾病進行手術的30例患者的正常卵巢組織。所有參與者均提供了書面的知情同意書。本研究獲得黃河三門峽醫院倫理委員會批準（2020-012）。

人卵巢顆粒KGN細胞以及人正常卵巢上皮細胞IOSE80均購自深圳市豪地華拓生物科技有限公司。PI3K激活劑740Y-P購自上海高創化學科技有限公司；RPMI1640培養基、實時熒光定量PCR（qRT-PCR）試劑盒、胎牛血清、Trizol試劑、CCK-8試劑盒購自上海瓦蘭生物科技有限公司；Lipofectamine2000購自上海北諾生物科技有限公司；si-MALAT1、si-NC、pc-MALAT1、pc-NC質粒購自上海吉凱基因醫學科技有限公司。兔抗人B細胞淋巴瘤2（Bcl-2）、Bcl-2關聯X蛋白（Bax）、微管相關蛋白Ⅱ輕鏈3（LC3Ⅱ）、微管相關蛋白Ⅰ輕鏈3（LC3Ⅰ）、Beclin1、p-PI3K、PI3K、p-Akt、Akt、p-mTOR、mTOR、GAPDH一抗和羊抗兔IgG二抗均購自英國Abcam公司；qRT-PCR儀購自德國qTOWER3G公司；Aurora流式細胞儀購自青島佳鼎分析儀器有限公司；HT7800透射電鏡購自深圳市科時達電子科技有限公司。

1.2 qRT-PCR測定MALAT1 mRNA表達 提取卵巢組織和細胞中總RNA，定量并反轉錄為cDNA。按照熒光定量PCR試劑盒的方案制備反應體系，并設定反應條件：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性10 s，60 ℃退火20 s，72 ℃延伸20 s，40個循環。MALAT1引物：上游5′-GGTAACGATGGTGTCGAGGTC-3′，下游5′-CCAGCATTACAGTTCTTGAACATG-3′，產物大小356 bp；GAPDH引物：上游5'-GGTCGGAGTCAACGGATTTG-3'，下游5'-ATGAGCCCCAGCCTTCTCCAT-3'，擴增長度311 bp。以GAPDH為內參，采用2-ΔΔCt法計算mRNA相對表達量。

1.3 細胞分組及轉染 將KGN細胞分為si-MALAT1組（轉染si-MALAT1）、si-NC組（轉染si-NC）、pc-MALAT1組（轉染pc-MALAT1）、pc-NC組（轉染pc-NC）、pc-MALAT1+740Y-P（20 mmol/L［7］）組（轉染pc-MALAT1并用20 mmol/L 740Y-P處理）和control組（未處理），培養48 h后，采用1.2方法測定各組KGN細胞MALAT1 mRNA表達。

1.4 CCK-8測定KGN細胞活力 將KGN細胞接種在96孔板（5×104個/孔）。24、48、72 h時，加入10 μL CCK-8試劑。孵育2 h后用酶標儀檢測450 nm波長處光密度（OD）值。

1.5 流式細胞術分析細胞凋亡 將KGN細胞接種于6孔板中孵育，離心收集細胞并重懸于1×binding buffer緩沖液中，用Annexin V-FITC和PI試劑在室溫下避光染色15 min，在1 h內用流式細胞儀分析細胞凋亡情況。

1.6 透射電鏡觀察KGN細胞中自噬小體 將KGN細胞接種到24孔板中，培養24 h后收集細胞，用4%戊二醛固定12 h，再用1%四氧化鋨固定2 h，梯度乙醇脫水，環氧樹脂包埋，然后制作超薄切片，最后用3%醋酸鈾和枸櫞酸鉛染色。在透射電鏡下觀察細胞的自噬小體。

1.7 Western blot檢測KGN細胞中相關蛋白表達 提取KGN細胞的總蛋白，并定量分析，熱水浴將蛋白變性后電泳，用4 ℃預冷的跨膜液將蛋白轉移到PVDF膜上1.5 h，5%脫脂奶粉封閉2 h，添加Bcl-2、Bax、PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt、p-mTOR、mTOR、LC3Ⅱ、LC3Ⅰ、Beclin1、GAPDH一抗，在4 ℃下孵育過夜，洗滌后添加二抗室溫孵育2 h。用ECL試劑顯影，采用Image-Pro Plus軟件分析灰度值，以GAPDH為內參計算目的蛋白與內參蛋白灰度值比值。

1.8 統計學方法 利用Graphpad Prism 8.0.1軟件分析數據。計量數據以均數±標準差（[x] ±s）表示，2組間比較采用獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較用SNK-q檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 卵巢組織和細胞中MALAT1 mRNA的表達水平 PCOS卵巢組織MALAT1 mRNA表達水平低于正常卵巢組織（0.46±0.05 vs. 1.13±0.08，n=30，t=38.899，P＜0.01）；KGN細胞中MALAT1 mRNA表達水平低于正常卵巢上皮IOSE80細胞（0.51±0.06 vs. 1.04±0.11，n=6，t=10.361，P＜0.01）。

2.2 各組KGN細胞增殖和MALAT1 mRNA表達水平比較 si-MALAT1組24、48、72 h的OD450值和MALAT1 mRNA表達水平低于control組和si-NC組（P＜0.05）；pc-MALAT1組24、48、72 h的OD450值和MALAT1 mRNA表達水平高于pc-NC組（P＜0.05）；pc-MALAT1+740Y-P組24、48、72 h的OD450值低于pc-MALAT1組（P＜0.05），而MALAT1 mRNA表達水平差異無統計學意義（P＞0.05），見表1。

2.3 各組KGN細胞凋亡率比較 si-MALAT1組KGN細胞凋亡率高于control組和si-NC組（P＜0.05）；pc-MALAT1組KGN細胞凋亡率低于pc-NC組（P＜0.05）；pc-MALAT1+740Y-P組KGN細胞凋亡率高于pc-MALAT1組（P＜0.05），見圖1、表1。

2.4 各組KGN細胞自噬小體比較 control組KGN細胞中可見少量的自噬小體；與control組和si-NC組相比，si-MALAT1組細胞中自噬小體數量增加；與pc-NC組相比，pc-MALAT1組細胞中自噬小體數量

2.5 各組KGN細胞中凋亡、自噬相關蛋白表達水平比較 與control組和si-NC組比較，si-MALAT1組Bax、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin1蛋白表達水平增加，Bcl-2表達下降（P＜0.05）；與pc-NC組比較，pc-MALAT1組Bax、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin1蛋白表達水平下降，Bcl-2蛋白表達水平增加（P＜0.05）；與pc-MALAT1組比較，pc-MALAT1+740Y-P組Bax、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin1蛋白表達水平增加，Bcl-2蛋白表達水平下降（P＜0.05），見圖3、表2。

2.6 各組KGN細胞PI3K/Akt/mTOR通路相關蛋白表達水平比較 與control組和si-NC組比較，si-MALAT1組KGN細胞p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt、p-mTOR/mTOR增高（P＜0.05）；與pc-NC組比較，pc-MALAT1組KGN細胞p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt、p-mTOR/mTOR降低（P＜0.05）；與pc-MALAT1組比較，pc-MALAT1+740Y-P組KGN細胞p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt、p-mTOR/mTOR增高（P＜0.05），見圖4、表3。

3 討論

PCOS是一種代謝紊亂和內分泌失調引起的疾病。有研究報道，我國70%的不孕癥由PCOS引起［8］。目前PCOS的發病機制尚不清楚，但卵巢顆粒細胞異常自噬和凋亡會促進PCOS發生發展［9］。研究顯示LncRNA異常表達可導致細胞基本活動異常，引發疾病［3］。LncRNA MALAT1位于染色體11q13.1，在細胞增殖、凋亡、自噬等過程中均發揮重要的調控作用，可在膠質瘤細胞高表達，可促進細胞增殖、抑制細胞凋亡［10］。MALAT1還可抑制肝細胞癌HCC凋亡和自噬［11］。然而，目前MALAT1在PCOS細胞中的作用鮮有報道。本研究結果顯示MALAT1基因在PCOS卵巢組織和細胞低表達，提示MALAT1的異常表達可能促進PCOS的發生；沉默MALAT1表達后可抑制KGN細胞增殖，促進細胞凋亡和自噬，而上調MALAT1表達后，可促進KGN細胞增殖，抑制細胞凋亡和自噬，提示MALAT1參與KGN細胞的增殖和凋亡過程。

Bcl-2和Bax蛋白在細胞凋亡過程中發揮重要作用，Bcl-2蛋白具有抑制細胞凋亡的作用，而Bax蛋白具有促進細胞凋亡的作用。自噬是機體的一種自我調節過程，可將功能失調的細胞和細胞器吞噬分解，為新形成的細胞提供原料，但過度自噬可造成組織損傷，引起組織和器官功能障礙。LC3Ⅱ/LC3Ⅰ和Beclin1為自噬標志蛋白。為進一步明確MALAT1能否調控細胞自噬和凋亡來改善PCOS，本研究檢測了自噬和凋亡相關蛋白，結果顯示，上調MALAT1可抑制Bax、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin1蛋白表達，增加Bcl-2蛋白表達，提示上調MALAT1可抑制細胞自噬和凋亡。

研究表明，PI3K/Akt/mTOR信號通路在蛋白質和糖原合成以及調節細胞生長、自噬、凋亡、衰老過程中發揮重要的生物學作用［12］。該通路同時還參與多種疾病的發生發展過程，如多種惡性腫瘤、白血病、關節炎癥等疾病［13］。Chen等［14］研究表明，抑制PI3K/Akt/mTOR信號通路可促進卵巢顆粒細胞增殖，減少卵巢顆粒細胞自噬。Xu等［15］研究發現，抑制PI3K/Akt/mTOR信號通路可減少卵巢顆粒細胞過度自噬，減輕PCOS癥狀。為探討MALAT1改善PCOS的機制，本研究檢測了p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt、p-mTOR/mTOR蛋白表達，結果顯示，沉默MALAT1表達可促進KGN細胞中上述蛋白表達，上調MALAT1可抑制KGN細胞中上述蛋白表達，提示MALAT1可能調控PI3K/Akt/mTOR信號通路。為進一步驗證該結論，本研究用激活劑740Y-P處理KGN細胞，結果表明740Y-P可減弱MALAT1對KGN細胞的保護作用，提示MALAT1可通過抑制PI3K/Akt/mTOR信號通路來保護KGN細胞。

綜上所述，干擾MALAT1表達可激活PI3K/Akt/mTOR信號通路，進而促進PCOS顆粒細胞凋亡和自噬。過表達MALAT1可能通過抑制PI3K/Akt/mTOR信號通路來抑制PCOS顆粒細胞凋亡和自噬，緩解PCOS癥狀。然而，LncRNA MALAT1具體如何對PI3K/Akt/mTOR信號通路上關鍵靶點進行調控還需要深入探究。

參考文獻

［1］"""" 韋奕，張淑芬，黃夢穎，等. 青蒿琥酯對多囊卵巢綜合征模型大鼠卵巢組織形態的影響［J］. 天津醫藥，2022，50（6）：588-594. WEI Y，ZHANG S F，HUANG M Y，et al. Effect of artesunate on ovarian tissue morphology in polycystic ovary syndrome model rats［J］. Tianjin Med J，2022，50（6）：588-594. doi：10.11958/20212673.

［2］"""" AL WATTAR B H，FISHER M，BEVINGTON L，et al. Clinical practice guidelines on the diagnosis and management of polycystic ovary syndrome：a systematic review and quality assessment study［J］. J Clin Endocrinol Metab，2021，106（8）：2436-2446. doi：10.1210/clinem/dgab232.

［3］"""" CHEN Y，CHEN Y，CUI X，et al. Down-regulation of MALAT1 aggravates polycystic ovary syndrome by regulating MiR-302d-3p-mediated leukemia inhibitory factor activity［J］. Life Sci，2021，277：119076. doi：10.1016/j.lfs.2021.119076.

［4］"""" ELMONIER A A，EL-BOGHDADY N A，FAHIM S A，et al. LncRNA NEAT1 and MALAT1 are involved in polycystic ovary syndrome pathogenesis by functioning as competing endogenous RNAs to control the expression of PCOS-related target genes［J］. Noncoding RNA Res，2023，8（2）：263-271. doi：10.1016/j.ncrna.2023.02.008.

［5］"""" 郭向東，王青玲，張夢嫻，等. 補腎活血湯通過調控PI3K/Akt/mTOR通路對HEI-OC1細胞的抗衰老作用［J］. 中成藥，2023，45（3）：930-935. GUO X D，WANG Q L，ZHANG M X，et al. Anti-aging effect of Bushen Huoxue Decoction on HEI-OC1 cells by regulating PI3K/Akt/mTOR pathway［J］. Chinese Patent Medicine，2023，45（3）：930-935. doi：10.3969/j.issn.1001-1528.2023.03.041.

［6］"""" CHEN Q，ZHANG H，YANG Y，et al. Metformin attenuates UVA-induced skin photoaging by suppressing mitophagy and the PI3K/AKT/mTOR pathway［J］. Int J Mol Sci，2022，23（13）：6960. doi：10.3390/ijms23136960.

［7］"""" ZHENG J，LIU C，SHI J，et al. AIM2 inhibits the proliferation，invasion and migration， and promotes the apoptosis of osteosarcoma cells by inactivating the PI3K/AKT/mTOR signaling pathway［J］. Mol Med Rep，2022，25（2）：53. doi：10.3892/mmr.2021.12569.

［8］"""" GUAN C，ZAHID S，MINHAS A S，et al. Polycystic ovary syndrome：a \"risk-enhancing\" factor for cardiovascular disease［J］. Fertil Steril，2022，117（5）：924-935. doi：10.1016/j.fertnstert.2022.03.009.

［9］"""" REDDY Y. Pulmonary hypertension in polycystic ovarian syndrome［J］. Arq Bras Cardiol，2021，116（4）：812-813. doi：10.36660/abc.20210106.

［10］""" SU Y，LIANG C，YANG Q. LncRNA MALAT1 promotes glioma cell growth through sponge miR-613［J］. J BUON，2021，26（3）：984-991.

［11］""" PENG N，HE J，LI J，et al. Long noncoding RNA MALAT1 inhibits the apoptosis and autophagy of hepatocellular carcinoma cell by targeting the microRNA-146a/PI3K/Akt/mTOR axis［J］. Cancer Cell Int，2020，20：165. doi：10.1186/s12935-020-01231-w.

［12］""" SHIAU J P，CHUANG Y T，CHENG Y B，et al. Impacts of oxidative stress and PI3K/AKT/mTOR on metabolism and the future direction of investigating fucoidan-modulated metabolism［J］. Antioxidants （Basel），2022，11（5）：911. doi：10.3390/antiox11050911.

［13］""" SKOLARIKI A，D'COSTA J，LITTLE M，et al. Role of PI3K/Akt/mTOR pathway in mediating endocrine resistance：concept to clinic［J］. Explor Target Antitumor Ther，2022，3（2）：172-199. doi：10.37349/etat.2022.00078.

［14］""" CHEN X，TANG H，LIANG Y，et al. Acupuncture regulates the autophagy of ovarian granulosa cells in polycystic ovarian syndrome ovulation disorder by inhibiting the PI3K/AKT/mTOR pathway through LncMEG3［J］. Biomed Pharmacother，2021，144：112288. doi：10.1016/j.biopha.2021.112288.

［15］""" XU B，DAI W，LIU L，et al. Metformin ameliorates polycystic ovary syndrome in a rat model by decreasing excessive autophagy in ovarian granulosa cells via the PI3K/AKT/mTOR pathway［J］. Endocr J，2022，69（7）：863-875. doi：10.1507/endocrj.EJ21-0480.

（2024-03-18收稿 2024-04-26修回）

（本文編輯 李國琪）

基金項目：河南省醫學科技攻關計劃項目（LHGJ20200205）

作者單位：黃河三門峽醫院生殖醫學中心（郵編472000）

作者簡介：喬娜（1983），女，主治醫師，主要從事婦產科、生殖醫學方面研究。E-mail：qcx0ci@163.com