漆黃素抑制小膠質細胞NLRP3炎癥小體活化緩解膿毒癥后認知功能損害的研究

摘要：目的 探討漆黃素抑制小膠質細胞NOD樣受體家族蛋白3（NLRP3）炎癥小體活化緩解膿毒癥后認知功能損害的機制。方法 選用C57BL/6小鼠，用盲腸結扎穿孔法構建膿毒癥模型。分組包括：假手術組、膿毒癥組、膿毒癥+胱天蛋白酶（caspase）-1敲除組（膿毒癥+Cas-1-/-組）、膿毒癥+漆黃素組。Morris水迷宮評估小鼠的認知功能。Western blot和免疫熒光雙染檢測腦組織和小膠質細胞NLRP3炎癥小體相關蛋白caspase-1、GSDMD蛋白N端片段（GSDMD-N）、白細胞介素（IL）-1β和IL-18，線粒體自噬相關蛋白Pink1、Parkin和微管相關蛋白輕鏈3（LC3）-Ⅱ的表達。用伊文思藍檢測血腦屏障的通透性。結果 與假手術組相比，膿毒癥組caspase-1、GSDMD-N、IL-1β和IL-18的表達水平顯著升高（P＜0.05）；膿毒癥+Cas-1-/-組caspase-1、GSDMD-N、IL-1β和IL-18的表達水平明顯低于膿毒癥組（P＜0.05）。膿毒癥+漆黃素組Pink1、Parkin和LC3-Ⅱ的表達水平明顯高于膿毒癥組（P＜0.05），caspase-1、GSDMD-N、IL-1β和IL-18的表達水平明顯低于膿毒癥組（P＜0.05）。與膿毒癥組相比，膿毒癥+漆黃素組伊文思藍滲漏減少、逃逸潛伏期縮短和穿越平臺次數增加（均P＜0.05）。結論 漆黃素可能通過Pink1/Parkin通路激活線粒體自噬，抑制小膠質細胞NLRP3炎癥小體活化，進而緩解膿毒癥后中樞炎癥反應和認知功能損害。

關鍵詞：膿毒癥；認知功能障礙；線粒體自噬；NLR家族，熱蛋白結構域包含蛋白3；漆黃素

中圖分類號：R515.3 文獻標志碼：A DOI：10.11958/20240619

Study on the effect of fisetin on alleviating cognitive impairment after sepsis by inhibiting the activation of microglial NLPR3 inflammasome

LIAO Zhong1， LIAO Weijian1， LAI Guoli1， WEN Yin2， SU Zhiwei2， ZENG Juhao2， DING Hongguang3

1 Department of Emergency， Longnan First People’s Hospital， Longnan 341700， China; 2 Department of Critical Care

Medicine， 3 Department of Emergency， Guangdong Provincial People’s Hospital （Guangdong Academy of

Medical Sciences）， Southern Medical University

Abstract： Objective To investigate the mechanism of fisetin inhibiting the activation of microglia NOD-like receptor family protein 3 （NLRP3） inflammasome in microglia and alleviating cognitive impairment after sepsis. Methods C57BL/6 mice were used to establish the sepsis model by cecal ligation and puncture. Mice were divided into four groups： the sham group， the sepsis group， the sepsis+caspase-1 knockout group （sepsis+Cas-1-/- group） and the sepsis+fisetin group. Evans blue was used to detect the permeability of blood-brain barrier （BBB）. Morris water maze was used to evaluate the cognitive function of mice. Western blot assay and immunofluorescence double staining were used to detect the expression of NLRP3 inflammasome-related proteins including caspase-1， N-terminal fragment of the GSDMD （GSDMD-N）， interleukin （IL）-1β， IL-18 and mitophagy-related proteins （Pink1， Parkin and LC3-Ⅱ） in brain tissue and microglia. Results Compared with the sham group， expression levels of caspase-1， GSDMD-N， IL-1β and IL-18 were significantly increased in the sepsis group （P＜0.05）. Compared with the sepsis group， expression levels of caspase-1， GSDMD-N， IL-1β and IL-18 were significantly decreased in the sepsis+Cas-1-/- group （P＜0.05）. The expression levels of Pink1， Parkin and LC3-Ⅱ were significantly higher in the sepsis+fisetin group than those of the sepsis group （P＜0.05）， and expression levels of caspase-1， GSDMD-N， IL-1β and IL-18 were significantly lower （P＜0.05）. After fisetin intervention， the permeability of BBB was decreased and the cognitive impairment （decreased escape latency and increased frequencies of crossing the platform） was alleviated in the sepsis+fisetin group compared with those of the sepsis group （P＜0.05）. Conclusion Fisetin may alleviate central inflammation and cognitive impairment after sepsis by inhibiting the activation of microglial NLRP3 inflammasome through activating mitophagy.

Key words： sepsis; cognitive dysfunction; mitophagy; NLR family， pyrin domain-containing 3 protein; fisetin

膿毒癥是發病率較高的重癥疾病，常伴有多器官功能損傷。膿毒癥早期累及中樞神經系統，表現為膿毒癥相關性腦病（sepsis-associated encephalopathy，SAE）［1］，并發SAE可導致患者認知功能損害和病死率增加［2］。SAE嚴重影響膿毒癥患者的預后。小膠質細胞是中樞神經系統的巨噬細胞，膿毒癥時其作用表現為：一方面釋放炎性因子和氧自由基等分子，介導神經毒性；另一方面吞噬細胞碎片、分泌神經營養因子，促進神經細胞的修復［3-5］。抑制小膠質細胞誘導的中樞炎癥反應可緩解膿毒癥誘導的認知功能損害。目前尚缺乏能有效緩解膿毒癥誘導的認知功能損害的方法。漆黃素是一種膳食多酚類黃酮，在蔬菜和水果中廣泛分布，但含量較低［6］。漆黃素亦是中藥黃櫨的有效成分［7］，具有抗血管生成［8］、抗腫瘤［9］、緩解骨關節炎［10］、對抗肝細胞脂肪變性［11］等藥理作用。漆黃素能否緩解膿毒癥誘導的認知功能損害尚不明確。本文旨在探究漆黃素可否通過調控小膠質細胞NOD樣受體家族蛋白3（NLRP3）炎癥小體活化影響膿毒癥后中樞炎癥反應和認知功能損害，為治療SAE提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 SPF級C57BL/6背景的胱天蛋白酶（caspase）-1基因敲除（caspase-1-/-，Cas-1-/-）6周齡雄性小鼠8只，體質量18～22 g，用于構建膿毒癥小鼠模型，定義為膿毒癥+caspase-1敲除組（膿毒癥+Cas-1-/-組）。以6周齡野生型雄性C57BL/6小鼠（SPF級，體質量18～22 g）作為對照。按照隨機數字表法將野生型小鼠分為3組：假手術組、膿毒癥組、膿毒癥+漆黃素組，每組26只。所有小鼠購自廣東藥康生物科技有限公司，合格證編號為44824700016241，生產許可證號為SYXK（粵）2022-0136。所有動物實驗經龍南市第一人民醫院醫學倫理委員會批準（批準文號：202203）。

1.1.2 主要儀器和試劑 Morris水迷宮（Coulbourn，美國），垂直電泳儀（Bio-Rad，美國），熒光顯微鏡（Olympus，日本），總蛋白提取試劑盒（BestBio，中國），蛋白Marker、Alexa Fluor? 488標記的山羊抗鼠熒光二抗、Alexa Fluor? 555標記的驢抗兔熒光二抗（Thermo Fisher Scientific，美國），兔抗鼠GSDMD蛋白N端片段（GSDMD-N）一抗、HRP標記的山羊抗鼠二抗、HRP標記的山羊抗兔二抗（Cell Signaling Technology，美國），兔抗鼠caspase-1、白細胞介素（IL）-1β、IL-18、Pink1、Parkin、微管相關蛋白輕鏈3（LC3）-Ⅱ、Iba1一抗以及鼠抗鼠β-actin一抗（Abcam，英國），伊文思藍、漆黃素（MedChemExpress，美國），戊巴比妥鈉（Merck，德國），PVDF膜（Millipore，美國）。

1.2 方法

1.2.1 膿毒癥模型制備和漆黃素干預 本部分小鼠共分4組：假手術組（26只）、膿毒癥組（26只）、膿毒癥+Cas-1-/-組（8只）和膿毒癥+漆黃素組小鼠（26只）。采用盲腸結扎穿孔的方法構建膿毒癥小鼠模型。腹腔注射3%戊巴比妥鈉（30 mg/kg）麻醉C57BL/6小鼠，腹部剃毛，用碘伏消毒腹部2次。縱向切開腹部皮膚，切口長1.5～2.0 cm，進入腹腔后暴露盲腸并將其分離拉出。結扎回盲瓣與盲腸末端中點，用21號針頭穿透結扎部位后將盲腸重新放回腹腔，最后將腹部切口逐層縫合，碘伏消毒傷口。假手術組除不進行盲腸結扎和穿孔，其他操作同上。在構建膿毒癥模型1周前，膿毒癥+漆黃素組小鼠予漆黃素（50 mg/kg）灌胃，連續7 d。

1.2.2 Morris水迷宮評估認知功能 本部分小鼠共分3組：假手術組、膿毒癥組和膿毒癥+漆黃素組小鼠，每組14只。該裝置由一個圓形水池、水下圓柱平臺和固定在水池上方的攝像機組成，攝像機用于跟蹤小鼠的運動軌跡。池中充滿水，水溫（25±1）℃，并分成4個相等的象限。第1天為適應性訓練，讓小鼠熟悉實驗環境。在第2—5天的實驗中，記錄每只小鼠尋找平臺的時間，為逃逸潛伏期。第6天，撤掉平臺后記錄小鼠120 s內穿越平臺的次數。

1.2.3 Western blot檢測腦組織相關蛋白表達 本部分小鼠共分4組：假手術組、膿毒癥組、膿毒癥+Cas-1-/-組和膿毒癥+漆黃素組小鼠，每組4只。盲腸結扎和穿孔術24 h后取海馬區腦組織，加入RIPA蛋白裂解緩沖液冰上裂解腦組織。用BCA蛋白濃度檢測試劑盒測定蛋白濃度，然后把蛋白裂解液與loading緩沖液混合后，用SDS-PAGE凝膠分離蛋白并轉到PVDF膜上。5%牛血清白蛋白封閉后，按照不同蛋白的分子質量對條帶進行分割后，分別置于按照1∶1 000稀釋的兔抗鼠Pink1、Parkin、LC3-Ⅱ、caspase-1、GSDMD-N、IL-1β、IL-18一抗，鼠抗鼠β-actin一抗溶液中4 ℃孵育過夜。TBST漂洗后加入HRP標記的二抗（1∶1 000）室溫孵育1 h。發光液敷PVDF膜后，用Fluor Chem 8900軟件分析條帶的信號強度，自動曝光。使用Image J軟件對目的蛋白條帶進行量化。

1.2.4 免疫熒光染色檢測小膠質細胞相關蛋白表達 本部分小鼠共分4組：假手術組、膿毒癥組、膿毒癥+Cas-1-/-組和膿毒癥+漆黃素組小鼠，每組4只。盲腸結扎和穿孔術24 h后，戊巴比妥鈉麻醉后快速處死小鼠，心臟灌注磷酸鹽緩沖液，然后注入4%多聚甲醛以固定組織，立即取出大腦。用4%多聚甲醛外固定，梯度蔗糖脫水，切成4 μm厚的薄片。用1%牛血清白蛋白封閉30 min，4 ℃下孵育Iba1、Pink1、LC3-Ⅱ、caspase-1和IL-1β一抗（稀釋比例1∶100）過夜，然后室溫下孵育Alexa Fluor? 488標記的山羊抗鼠IgG和Alexa Fluor? 555標記的驢抗兔IgG二抗（稀釋比例1∶100）1 h。最后熒光封片劑封片，熒光顯微鏡觀察并拍照。

1.2.5 伊文思藍檢測血腦屏障（BBB）的通透性 本部分小鼠共分3組：假手術組、膿毒癥組和膿毒癥+漆黃素組小鼠，每組4只。盲腸結扎和穿孔術24 h后經小鼠尾靜脈注射2%伊文思藍（4 mL/kg），然后戊巴比妥鈉麻醉后快速處死小鼠，先后心臟灌注磷酸鹽緩沖液和4%多聚甲醛，最后取出大腦進行拍照。伊文思藍定量分析：腦組織于60 ℃下加入甲酰胺（1 mL/100 mg）孵育24 h，采用分光光度法在620 nm處測定伊文思藍濃度。

1.3 統計學方法 采用SPSS 22.0軟件進行數據分析。采用Shapiro-Wilk檢驗數據分布，所有數據均符合正態分布，以均數±標準差（[x] ±s）表示。重復測量數據采用重復測量資料的方差分析，其余數據采用單因素方差分析，組間多重比較采用Tukey’s檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 漆黃素緩解膿毒癥誘導的認知功能損害 與假手術組相比，膿毒癥組逃逸潛伏期明顯延長，膿毒癥+漆黃素組較膿毒癥組明顯縮短（均P＜0.05），見表1。第6天，假手術組、膿毒癥組、膿毒癥+漆黃素組穿越平臺次數分別為5.4±3.3、1.7±1.5、4.1±1.9，差異有統計學意義（F=8.510，P＜0.01），與假手術組相比，膿毒癥組明顯減少（P＜0.05），膿毒癥+漆黃素組較膿毒癥組明顯增加（P＜0.05）。

2.2 caspase-1誘導的NLRP3炎癥小體活化促進小膠質細胞GSDMD-N、IL-1β和IL-18的表達 與假手術組相比，膿毒癥組GSDMD-N、IL-1β和IL-18的表達水平明顯升高（P＜0.01）；膿毒癥+Cas-1-/-組GSDMD-N、IL-1β和IL-18的表達水平明顯低于膿毒癥組（P＜0.01），見圖1、表2。與假手術組比較，膿毒癥組小膠質細胞中caspase-1和IL-1β（紅色熒光）的表達增加；而caspase-1敲除后，膿毒癥+Cas-1-/-組caspase-1和IL-1β的表達明顯降低。見圖2。

2.3 漆黃素降低BBB通透性 與假手術組相比，膿毒癥組腦組織伊文思藍滲漏增加，而膿毒癥+漆黃素組伊文思藍滲漏低于膿毒癥組（均P＜0.05），見圖3、表3。與假手術組相比，膿毒癥組Pink1、Parkin和LC3-Ⅱ的表達水平明顯升高，膿毒癥+漆黃素組表達水平高于膿毒癥組（均P＜0.05）。見圖4、表3。與假手術組比較，膿毒癥組小膠質細胞中Pink1和LC3-Ⅱ（紅色熒光）的表達增加，而漆黃素干預后，膿毒癥+漆黃素組Pink1和LC3-Ⅱ表達進一步增加，見圖5。

前體進行切割，形成有活性的IL-1β和IL-18，并釋放到胞外［13］。膿毒癥時，NLRP3炎癥小體的過度激活可引起細胞焦亡。此時大量促炎細胞因子和細胞質成分被釋放到細胞外，對鄰近細胞產生促炎信號，使炎癥細胞聚集，擴大的炎癥反應會導致多器官的功能損害［14-15］。本研究發現膿毒癥后小膠質細胞NLRP3炎癥小體被活化，表現為caspase-l和GSDMD-N表達上調，同時伴隨炎性因子的釋放，且敲除caspase-l可逆轉此過程。可見，小膠質細胞NLRP3炎癥小體的活化對膿毒癥誘導的中樞炎癥反應的發生至關重要。

膿毒癥后線粒體功能的損害可導致活性氧（ROS）的蓄積，進而活化NLRP3炎癥小體，誘發強烈的炎癥反應，導致靶器官的損傷。線粒體自噬是選擇性降解受損線粒體的過程，且Pink1/Parkin信號通路是介導線粒體自噬的經典通路［16-18］。本研究發現漆黃素可抑制小膠質細胞NLRP3炎癥小體的活化和中樞炎癥反應，表現為caspase-l、GSDMD-N、IL-1β和IL-18的下調。為明確漆黃素抑制小膠質細胞NLRP3炎癥小體活化的機制，本研究進一步探究發現膿毒癥后小膠質細胞通過Pink1/Parkin通路啟動了線粒體自噬，從而進行損傷線粒體的修復，而漆黃素進一步促進了線粒體自噬的進程。由此可見，通過促進線粒體自噬抑制NLRP3炎癥小體的活化是漆黃素緩解膿毒癥對BBB和認知功能損害的重要干預靶點。Jia等［18］研究顯示，漆黃素可通過線粒體應激依賴性途徑誘導胰腺癌細胞的自噬，與本研究結果基本一致，且本研究明確了漆黃素通過激活線粒體自噬抑制小膠質細胞NLRP3炎癥小體活化的分子機制。

漆黃素經胃腸道吸收后，尚不明確其是否可穿過BBB進入中樞神經系統直接作用于小膠質細胞。因此，不能排除漆黃素首先作用于腦血管內皮細胞以降低BBB的通透性，進而抑制小膠質細胞NLRP3炎癥小體活化的可能性。本研究未檢測腦組織中漆黃素的含量，有待今后完善。關于漆黃素與腦血管內皮細胞的作用關系是今后研究的方向。

綜上所述，小膠質細胞NLRP3炎癥小體的活化是膿毒癥后中樞炎癥反應和認知功能損害發生的重要原因。漆黃素可能通過Pink1/Parkin通路促進線粒體自噬、抑制小膠質細胞NLRP3炎癥小體的活化，進而緩解中樞炎癥反應和認知功能損害。本研究為膿毒癥的治療提供了潛在的藥物選擇。

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（2024-05-17收稿 2024-06-11修回）

（本文編輯 李國琪）

基金項目：國家自然科學基金青年科學基金項目（82002074）；江西省衛生健康委科技計劃項目（202312169）；廣東省醫學科學技術研究基金項目（A2022506）

作者單位：1龍南市第一人民醫院急診科（郵編341700）；2南方醫科大學附屬廣東省人民醫院（廣東省醫學科學院）重癥醫學科，3急診科

作者簡介：廖忠（1986），男，副主任醫師，主要從事膿毒癥相關臟器損傷的機制研究。E-mail：liaozhong_ln@163.com