BOC2抑制N-甲酰肽/甲酰肽受體信號通路減輕SAP炎癥損傷的機制研究

摘要：目的 觀察BOC-Phe-Leu-Phe-Leu-Phe（BOC2）對重癥急性胰腺炎（SAP）大鼠血中6種線粒體N-甲酰肽（NFPs）及胰腺組織中2種甲酰肽受體（FPRs）表達的影響，探討其減輕SAP炎癥損傷的機制。方法 將40只雄性SD大鼠隨機分為4組：假手術組，模型組，BOC2低、高劑量組（分別為0.1、0.2 mg/kg），每組10只。后3組以膽胰管逆行注射5%牛磺膽酸鈉（50 mg/kg）制備SAP模型。造模結束后0.5 h腹腔注射相應劑量藥物，4 h取材。蘇木精-伊紅染色觀察胰腺病理改變；蛋白免疫印跡法檢測血漿中NFPs的表達；免疫組化法檢測胰腺FPRs表達；酶聯免疫吸附試驗檢測血漿中白細胞介素（IL）-1β、IL-6和腫瘤壞死因子（TNF）-α水平；實時熒光定量聚合酶鏈反應檢測胰腺局部組織炎性因子的表達。結果 與模型組比較，BOC2低、高劑量組胰腺出血、腺泡細胞壞死、炎性細胞浸潤、水腫等病理現象均改善；胰腺病理評分，血漿線粒體NADH-泛素氧化還原酶鏈（MT-ND）1、MT-ND2、MT-ND3、MT-ND5、MT-ND6表達，胰腺FPRs表達，血漿及胰腺組織中3種炎性因子表達均下降（P＜0.05）。結論 BOC2可通過拮抗線粒體NFPs/FPRs信號通路減少炎性因子產生，減輕SAP炎癥損傷。

關鍵詞：胰腺炎；N-甲酰甲硫氨酰亮氨酰-苯丙氨酸；受體，甲酰肽；線粒體；BOC2；重癥急性胰腺炎

中圖分類號：R576.1 文獻標志碼：A DOI：10.11958/20240774

Mechanism study of BOC2 alleviating SAP inflammatory damage by inhibiting N-formyl

peptide/formyl peptide receptor pathway

ZHANG Guixian1， LIU Dawei1， LI Wenchang1， CAI Jun1， ZONG Wenhui1， LIU Hongbin2， ZHAO Xiumei1△

1 Tianjin Institute of Medical amp; Pharmaceutical Sciences， Tianjin 300020， China;

2 Health Commission of Heping District， Tianjin

△Corresponding Author E-mail： zxmmlg@163.com

Abstract： Objective To observe the effect of BOC-Phe-Leu-Phe-Leu-Phe （BOC2） on the expression of six types of mitochondrial N-formyl peptides （NFPs） in blood and two formyl peptide receptors （FPRs） in pancreatic tissue of rats with severe acute pancreatitis （SAP）， and to explore its mechanism of alleviating inflammatory damage of SAP. Methods Forty male SD rats were randomly divided into four groups： the sham group， the SAP model group， the BOC2 low-dose and the BOC2 high-dose group （0.1 and 0.2 mg/kg）， with 10 animals in each group. The SAP model was prepared by retrograde injection of 5% sodium taurocholate （50 mg/kg） into biliary and pancreatic ducts in the last 3 groups. BOC2 was intraperitoneally injected at 0.5 hours after SAP modeling， and samples were taken 4 hours after modeling. HE staining was used to observe pathological changes in pancreas. Western blot assay was used to detect the expression of NFPs in plasma. IHC staining was used to detect the expression of FPRs in pancreatic tissue. ELISA was used to detect interleukin （IL）-1β， IL-6 and tumor necrosis factor （TNF）-α levels in plasma. qPCR was used to detect expression levels of inflammatory factors in local pancreatic tissue. Results Compared with the model group， the BOC2 high-dose group and the BOC2 low- dose group showed improvement in pathological phenomena， such as pancreatic bleeding， acinar cell necrosis， inflammatory cell infiltration and edema. The pancreatic injury score， pancreatic FPRs expression， plasma MT-ND1， MT-ND2， MT-ND3， MT-ND5， MT-ND6 expression， as well as expression levels of three inflammatory factors in plasma and local pancreatic tissue， were significantly reduced （P＜0.05）. Conclusion BOC2 can reduce the production of inflammatory factors and alleviate SAP inflammatory damage by antagonizing mitochondrial NFPs/FPRs signaling pathway.

Key words： pancreatitis; N-formylmethionine leucyl-phenylalanine; receptors， formyl peptide; mitochondria; BOC2; severe acute pancreatitis

重癥急性胰腺炎（severe acute pancreatitis，SAP）是腹外科常見危重癥，發病急驟、病情兇險、并發癥多、病死率高［1-3］。SAP早期即可釋放大量炎性介質入血，從局部進入血液循環的炎性介質可誘導機體產生“瀑布樣”級聯放大反應，誘發全身炎癥反應綜合征（systemic inflammatory response syndrome，SIRS）［4-5］，嚴重時可引起多器官功能障礙綜合征（multiple organ dysfunction syndrome，MODS）和多器官功能衰竭（multiple organ failure，MOF），而MOF是導致SAP患者死亡的主要原因之一［6］。早期診斷特別是在“黃金時間”及早干預對緩解SAP病情、減少并發癥、降低病死率等均有重要作用［7］。SAP急性期細胞、細菌死亡裂解物向血中釋放大量損傷相關分子模式（damage associated molecular patterns，DAMPs），主要包括線粒體DNA、N-甲酰肽（N-formyl peptides，NFPs）、腺苷三磷酸（adenosine triphosphate，ATP）等，這些有“毒”物質進入血液循環后與相應受體結合，迅速釋放炎性因子并引起細胞之間的趨化、殺傷以及吞噬等生物效應［8］。甲酰肽受體（formyl peptide receptors，FPRs）為趨化物質受體，是一類主要存在于巨噬細胞、單核細胞和中性粒細胞上的跨膜受體，屬于G蛋白偶聯受體家族［9-10］，在炎癥反應的調節中起著至關重要的作用。FPR1和FPR2均可通過與NFPs結合而被激活，通過趨化作用誘導細胞黏附、招募免疫細胞定向遷移以及顆粒釋放和超氧化物形成等作用參與免疫細胞的胞內信號轉導［11］。FPRs的主要功能是監測有害分子和潛在的危險狀態，將中性粒細胞等驅向有害分子釋放的部位。本課題組在前期研究中發現，NFPs/FPRs的作用起始于SAP較早的環節［12］，一旦被激活，將會誘發全身炎性因子風暴，導致疾病迅速進展。BOC-Phe-Leu-Phe-Leu-Phe（BOC2）以FPRs為特異性靶點，可有效拮抗并降低甲酰肽水平，抑制FPRs誘導的細胞趨化運動，減少炎性介質形成，減輕炎癥反應。本研究聚焦SAP病程初期NFPs/FPRs信號途徑在SAP炎癥進展中的關鍵作用，期望能夠以新視角發現抑制SAP病程進展的關鍵靶點，為臨床早期干預、改善SAP預后提供啟示及實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 40只SPF級雄性SD大鼠，體質量180～200 g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，動物生產許可證號SCXK（京）2020-0004。大鼠飼養于SPF級動物實驗室，環境溫度20～25 ℃，相對濕度40%～60%。整個實驗過程中動物自由進食、飲水，晝夜周期12 h。本研究經天津市醫藥科學研究所實驗動物倫理委員會批準（批準文號IMPS-EAEP-ZKJ20026-01）。

1.1.2 藥物與主要試劑 BOC2（美國MedChemExpress公司）；牛磺膽酸鈉（Na-Tc，美國Sigma公司）；全血總蛋白提取試劑盒（北京百奧萊博科技有限公司）；兔抗大鼠線粒體NADH-泛素氧化還原酶鏈（MT-ND）1抗體、MT-ND3抗體、MT-ND5抗體、CD11b抗體購自美國Abcam公司；兔抗大鼠MT-ND2抗體、MT-ND4抗體購自美國Invitrogen公司；兔抗大鼠MT-ND6抗體、FPR1抗體購自英國Biorbyt公司；兔抗大鼠FPR2抗體（美國Novus公司）；大鼠白細胞介素（IL）-1β、IL-6、腫瘤壞死因子（TNF）-α酶聯免疫吸附試驗（ELISA）試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司；RNA提取試劑盒、反轉錄試劑盒、qPCR試劑盒購自寶日醫生物技術有限公司；小鼠抗大鼠Transferrin抗體（北京博奧森生物技術有限公司）；辣根過氧化物酶（HRP）標記的山羊抗兔、山羊抗小鼠免疫球蛋白（Ig）G購自北京中杉金橋公司。

1.1.3 主要儀器 多功能微孔板檢測儀（瑞士Tecan公司）；MiNiPRO型電泳儀及轉膜儀（美國Bio-Rad公司）；Tissue-Tek?TEC?5型組織包埋機（日本櫻花公司）；DM4000B型研究級顯微鏡（德國Leica公司）；ImageQuant LAS 500型一體化成像儀（美國GE公司）；QuantStudioTM 5實時熒光定量PCR儀（美國Thermo Fisher公司）；生物安全柜（美國Thermo Fisher公司）；超微量核酸蛋白測定儀（美國DeNOVIX公司）；微量加樣器（德國Eppendorf公司）。

1.2 方法

1.2.1 模型制作與分組 將大鼠按照隨機數字表法分為4組，分別為假手術組、模型組、BOC2低劑量（0.1 mg/kg）組、BOC2高劑量（0.2 mg/kg）組，每組10只，BOC2劑量依據文獻［13］和預實驗結果設定。所有動物均采用腹腔注射戊巴比妥鈉（45 mg/kg）麻醉，碘伏、乙醇消毒手術區。假手術組僅在開腹后輕輕翻動胰腺后立即關閉腹腔。其他組實驗動物在模型制備前禁食24 h，不禁水。麻醉后在無菌條件下于劍突下做腹壁正中切口，然后找到十二指腸膽胰管乳頭并用PE50導管逆行插入膽胰管1 cm，以無損傷小動脈夾妥善固定后勻速（0.02 mL/min）注入5%Na-Tc（50 mg/kg）。注射完畢后，以6/0黑色不可吸收線縫合十二指腸穿刺孔，以3/0黑色不可吸收線依次縫合腹部肌層、皮層。BOC2各劑量組于造模結束后0.5 h分別向腹腔注射相應劑量的藥物，假手術組和模型組則腹腔注射等體積生理鹽水。

1.2.2 標本采集 模型制備成功4 h后，將全部動物麻醉后開腹，使用一次性無菌注射器測定腹水體積，4%枸櫞酸鈉預潤洗處理一次性無菌注射器抽取腹主動脈全血，室溫850×g離心10 min留取血漿用以檢測MT-ND1、MT-ND2、MT-ND3、MT-ND4、MT-ND5、MT-ND6、IL-1β、IL-6和TNF-α表達水平。取出胰腺組織，一部分新鮮組織立即稱取胰腺濕質量后，放入56 ℃恒溫箱烘干，24 h后取出并稱量胰腺干質量，計算胰腺干濕質量比。另一部分胰腺組織則置于4%多聚甲醛中固定后，用于蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）和免疫組化（immunohistochemistry，IHC）染色。

1.2.3 HE染色觀察胰腺組織形態學和炎癥病理程度改變 胰腺組織4%多聚甲醛固定48 h后，進行組織脫水，二甲苯透明，常規石蠟包埋，切片，HE染色，顯微鏡下觀察組織學改變。隨機讀取200倍顯微鏡下10個視野觀察，并進行病理評分。病理評分為水腫評分、炎癥評分、壞死評分以及出血和脂肪壞死各評分累加［14］。另外，HE染色胰腺組織發現炎性細胞浸潤現象，采用IHC染色檢測炎性細胞特異性標志物CD11b，觀察炎性細胞浸潤程度。

1.2.4 蛋白免疫印跡法檢測血漿中NFPs的表達 提取全血血漿的總蛋白，采用BCA法進行蛋白定量。依據所測蛋白濃度，MT-ND1、MT-ND2、MT-ND3和MT-ND6均上樣60 μg，MT-ND4上樣30 μg，MT-ND5上樣10 μg。電泳分離蛋白，轉膜后5%脫脂奶粉封閉。分別孵育一抗MT-ND1、MT-ND2及MT-ND5，抗體稀釋度為1∶500；MT-ND3、MT-ND4及MT-ND6，抗體稀釋度為1∶1 000。4 ℃過夜，次日洗膜后加入山羊抗兔二抗（1∶2 000），搖床孵育1 h。再次洗膜，加發光底物顯色，凝膠成像系統采集圖像。用Image J 軟件進行分析，以各組甲酰肽蛋白條帶與Transferrin蛋白條帶灰度值之比表示目的蛋白的相對表達水平。

1.2.5 IHC法檢測胰腺組織FPRs的表達 將胰腺組織石蠟切片置于烘箱60 ℃烤片2 h，經二甲苯脫蠟、乙醇水化、熱修復抗原后，PBS洗滌3次。按照SP試劑盒說明書阻斷內源性過氧化物酶后，切片上滴加羊血清封閉液，室溫封閉20 min，滴加FPR1抗體（1∶400）及FPR2抗體（1∶200）4 ℃孵育過夜。次日洗片后常規孵育山羊抗兔二抗，DBA顯色液顯色，蘇木素復染，中性樹膠封片。顯微鏡觀察，黃褐色沉積者為陽性。采用Image Pro-Plus 6.0軟件分析陽性染色的平均光密度（OD）值表示其表達水平。

1.2.6 ELISA檢測血漿中炎性因子的表達 將腹主動脈采集的全血樣本離心后取上清液，按ELISA試劑盒說明書測定血漿中IL-1β、IL-6和TNF-α的表達水平。

1.2.7 實時熒光定量聚合酶鏈反應（qPCR）檢測胰腺組織中炎性因子的相對表達水平 取約20 mg胰腺組織，在液氮中充分研磨，以Trizol試劑提取總RNA。通過Nanodrop檢測RNA純度及濃度。使用寶日醫公司的反轉錄試劑盒進行反轉錄合成cDNA，再使用寶日醫公司的TB Green? Premix Ex TaqTM Ⅱ試劑盒進行PCR擴增。擴增條件為：95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，40個循環。使用NCBI網站Primer-BLAST在線設計引物，引物序列見表1。將各樣品cDNA 10倍稀釋后取2 μL作模板，用引物進行擴增。記錄Ct值，采用2-ΔΔCt法計算目的基因的相對表達水平。

1.3 統計學方法 采用SPSS 29.0軟件進行數據分析，計量資料以[[x] ±s

]表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用LSD-t法，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 BOC2對大鼠腹水量及胰腺組織干濕質量比的影響 與假手術組相比，模型組大鼠腹水量升高，胰腺干濕質量比降低（P＜0.05），胰腺組織水腫程度較高。經治療后，BOC2低、高劑量組大鼠腹水量和胰腺干濕質量比均逆轉（P＜0.05），見表2。

2.2 BOC2對大鼠胰腺組織病理形態學的影""""""" 響 HE染色結果顯示，假手術組胰腺小葉組織及腺泡排列規則，腺管形態正常，無充血、壞死及炎性細胞浸潤，胰島結構正常。與假手術組比較，模型組胰腺組織明顯出血、水腫，腺泡細胞大面積壞死，小葉結構紊亂或消失，小葉間隙增寬，間質內炎性細胞浸潤明顯，病理評分升高（P＜0.05）；與模型組比較，BOC2低、高劑量組炎性細胞浸潤、腺泡壞死及胰腺水腫和出血均改善，病理評分降低（P＜0.05）。IHC（CD11b）染色結果顯示，與假手術組比較，模型組褐色顆粒狀物質激增，炎性細胞浸潤明顯（P＜0.05），而BOC2干預后，褐色顆粒物質顯著減少，炎性細胞浸潤明顯減輕（P＜0.05）。見表3、圖1。

2.3 BOC2對大鼠血漿中6種線粒體NFPs蛋白表達的影響 與假手術組比較，模型組MT-ND1、MT-ND2、MT-ND3、MT-ND5和MT-ND6表達水平均增高（P＜0.05）；與模型組比較，BOC2低、高劑量組6種蛋白均明顯降低；各組MT-ND4在血漿中表達差異無統計學意義（P＞0.05）。見圖2、表4。

2.4 BOC2對大鼠胰腺組織FPR1、FPR2蛋白表達的影響 與假手術組相比，模型組胰腺組織FPR1、FPR2蛋白相對表達水平升高（P＜0.05），且主要定位于壞死腺泡細胞區域、炎性細胞浸潤區域和胰島；與模型組相比，BOC2低、高劑量組大鼠胰腺組織FPR1、FPR2蛋白相對表達水平降低（P＜0.05），見圖3、表5。

2.5 BOC2對大鼠血漿中IL-1β、IL-6和TNF-α表達水平的影響 與假手術組相比，模型組大鼠血漿中IL-1β、IL-6和TNF-α水平明顯升高（P＜0.05）；與模型組比較，BOC2低、高劑量組大鼠血漿中IL-1β、IL-6和TNF-α水平降低（P＜0.05），見表6。

2.6 BOC2對大鼠胰腺組織中IL-1β、IL-6和TNF-α mRNA相對表達水平的影響 與假手術組相比，模型組大鼠胰腺組織中IL-1β、IL-6和TNF-α mRNA相對表達水平明顯升高（P＜0.05）；與模型組比較，BOC2低、高劑量組大鼠胰腺組織中IL-1β、IL-6和TNF-α mRNA相對表達水平降低（P＜0.05），見表7。

3 討論

甲酰肽是一類重要的肽類物質，可由細菌產生，或感染、組織損傷時從受損線粒體中釋放出來，也是線粒體NADH脫氫酶亞基的N端序列。線粒體呼吸鏈復合物Ⅰ（CⅠ），即NADH泛醌氧化還原酶，也稱為NADH還原酶，是線粒體呼吸鏈中最大的一個多蛋白酶復合物，也是細胞內最大的膜結合酶之一。線粒體NFPs是與細菌NFPs相似的DAMPs，是強力的免疫系統激活劑［15］。MT-ND1、MT-ND2、MT-ND3、MT-ND4、MT-ND5和MT-ND6均屬于線粒體基因組所編碼的CⅠ的亞基。本研究發現SAP模型大鼠血漿中MT-ND1、MT-ND2、MT-ND3、MT-ND5和MT-ND6水平明顯升高，且在循環血中的水平與炎性因子IL-1β、IL-6和TNF-α表達趨勢一致。實驗中采用蛋白免疫印跡法成功檢測出血漿中多種甲酰肽分子水平，檢測方法簡便，反應靈敏，檢出限低，或可作為早期診斷SAP的輔助指標。

人體內有3種FPRs，分別為FPR1、FPR2和FPR3［16］。FPRs通過識別進化保守的病原體相關分子模式（pathogen related molecular patterns，PAMPs）和感知DAMPs識別外源性和內源性“危險”信號，特別是NFPs來參與宿主對病原體的防御［17-18］。同時，FPRs也可被NFPs特異性識別來觸發炎癥和免疫反應，在多種炎癥相關性疾病中發揮不同的作用，包括控制和招募免疫細胞到損傷部位、介導細菌NFPs的激活和白細胞活化等。FPRs可以引發G蛋白偶聯的信號傳導，使表達該受體的各種細胞，尤其是淋巴細胞、單核細胞產生方向性遷移，它們可跨越血管，向血管外特定部位遷移。SAP時，細菌及組織細胞壞死所產生的甲酰肽均可激活細胞表面的FPRs受體，且僅需皮克水平（pg/L）即可與FPRs結合，作用于細胞的信號傳導、離子的傳遞等［19］。本研究中，IHC結果顯示模型組胰腺組織中FPRs的表達較假手術組明顯升高，與NFPs的表達具有一致性的趨勢，表明NFPs與其受體FPRs結合后可有效觸發并加劇炎癥反應，是炎癥反應信號放大的關鍵。

對于SAP，截至目前尚未發現有效的藥物治療方法，且單純的非手術治療或手術治療均不能明確降低SAP的并發癥發生率和病死率。炎性介質的失控性釋放是病程進展的關鍵［20］。如能夠在疾病初起時即加以有效干預，能明顯改善臨床癥狀，縮短病程，減少并發癥，并降低病死率。作為重要的DAMPs，線粒體NFPs從死亡或受傷的細胞釋放后，通過與FPRs的相互作用激活中性粒細胞等吞噬細胞。因此，抑制線粒體NFPs介導的中性粒細胞活化可抑制下游信號轉導，減輕膿毒癥，同時也可以有效減輕胰腺損傷及全身炎癥反應，從而達到治療SAP的目的。

BOC-Met-Leu-Phe（BOC1）和BOC2是廣泛使用的FPRs拮抗劑［21］。BOC2可作為FPR1/FPR2拮抗劑，而BOC1僅可抑制FPR1而發揮作用。BOC2是一種五肽物質，已被廣泛用于評估FPRs在生理和病理條件下的作用［22］。BOC2以FPRs為特異性拮抗靶點，可有效拮抗FPRs及其誘導的細胞趨化運動，減輕炎癥反應及損害，改善微循環。本研究中，與模型組比較，BOC2各劑量組胰腺出血、腺泡細胞壞死、炎性細胞浸潤、水腫等病理現象均明顯改善，病理評分、胰腺FPRs表達、5種線粒體NFPs表達、血漿及胰腺局部組織中3種炎性因子表達均下降，表明BOC2可有效拮抗胰腺組織FPRs的表達，從而減輕由FPRs介導的胰腺及全身炎癥損傷。

綜上，五肽BOC2作為甲酰肽受體家族特異性抑制劑，能夠通過早期拮抗線粒體NFPs/FPRs信號途徑的激活，阻斷胰腺及機體炎癥反應的“瀑布樣”擴大效應，從而減輕胰腺及其他重要器官的損傷。本研究觀察了線粒體NFPs/FPRs在SAP早期可能發揮的作用，下一步將針對臨床血液樣本進行檢測，為早期干預、改善預后提供更多的理論支持。

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（2024-06-14收稿 2024-08-27修回）

（本文編輯 李國琪）

基金項目：國家自然科學基金資助項目（82304797）；天津市科學技術局重點項目（21JCZDJC01220）；天津市科學技術局面上項目（21JCYBJC01680）；天津市科學技術局青年項目（23JCQNJC00600）；天津市衛生健康科技項目（TJWJ2022MS049，TJWJ2024MS047）

作者單位：1天津市醫藥科學研究所（郵編300020）；2天津市和平區衛生健康委員會

作者簡介：張桂賢（1981），女，副研究員，主要從事急、慢性胰腺炎藥理學方面研究。E-mail：zhangguixian2007@aliyun.com

△通信作者 E-mail：zxmmlg@163.com