栽培大豆中黃13響應強光的轉錄組分析

摘要：大豆是我國重要的糧油兼用型農作物，正常生長周期為150 d左右，長達5個月的生命周期使得品種選育工作時間跨度較長，優良品種更新迭代緩慢。對在正常光照［200 μmol/（m2·s）］和強光［1 000 μmol/（m2·s）］下生長的中黃13進行表型觀測及轉錄組測序分析，結果發現，強光處理的大豆植株相比對照組表現為株高變矮、植株提前23 d開花，76 d成熟，且2組產量無顯著差異。通過轉錄組分析共得到8 520個差異表達基因，GO注釋分析結果顯示，差異表達基因主要富集在葉綠體、類囊體中的光合作用系統、脫氫酶及氧化還原酶活性等植物光保護系統中；KEGG分析結果顯示，差異表達基因主要富集在碳水化合物代謝、能量代謝、激素信號傳導、環境適應相關通路中。挑選可能參與縮短生命周期的關鍵差異表達基因進行qRT-PCR驗證，匹配率為90%，證明轉錄組分析結果具有可靠性，揭示植物在強光條件下可能通過光信號、激素信號等通路引起代謝速率的加快，促使大豆提前完成其生命周期而不影響種子收獲。結果可為進一步闡明大豆強光適應性及強光調控大豆生長發育的分子機制提供新見解。

關鍵詞：栽培大豆；強光響應；加速育種；轉錄組分析；基因挖掘

中圖分類號：S565.101" 文獻標志碼：A

文章編號：1002-1302（2024）13-0039-08

植物生命周期指植物從種子萌發、開花、結實、成熟、植株衰老至死亡的過程，不同植物因為各自遺傳特性及生長環境的不同，生命周期存在差異，在自然條件下，大多數植物一年只能收獲1～2代［1］。現今氣候、環境常處于變化之中，極端天氣易發，加之人口數量的增加，研究者們正積極選育具有良好抗性及品質優異的作物品種［2］。在育種過程中植物生命周期是一個限制性問題，植株生長至收獲，并經過加代獲得純合品種往往需要多年時間，這大大延長了育種的時間線［3］。

植物對于環境變化具有較強的適應性，這為實現室內就地加代，加快優良品系的培育提供了可能。Watson等于2018年提出快速育種技術（speed breeding），即通過人工控制光照（光周期、光照度、光質構成）和溫度等植物生長環境因子，促使植物提前開花、快速成熟，并應用于中國春小麥、甘藍型油菜等長日照作物，實現一年三代的生長［4］。

短日照作物大豆［Glycine max （L.） Merrill］是世界第四大糧食作物，在我國已有近5 000年的栽培歷史，現被廣泛栽培于世界各地［5］，在自然條件下其生長周期為4～5個月，研究人員曾利用高光照度，結合12 h短日照以及紅藍光配比實現歐洲商業大豆品種在室內1年培育5代［6］。同時作為光照敏感作物，已有研究表明，大豆對強光具有較強的適應性。紅光下隨著光照度的增加，大豆晝夜節律相關基因振蕩曲線會在短時間內迅速重置，實現與環境的同步［7］。但目前對于大豆如何響應強光以及強光調控其生長發育的分子機制和完整通路知之甚少。

栽培大豆中黃13是經20多年選育出來的高產高蛋白大豆品種，具有抗澇、抗病、耐高溫等優良抗性，是國內種植范圍最廣的栽培品種之一［8］。目前廣泛采用的大豆參考基因組Glycine_max_v4.0來源于美國品種Williams 82［9］，2018年中黃13基因組的發布為更多遺傳變異的發現提供了參考［10-11］，有利于重要農藝性狀基因的挖掘及國產優質大豆品種的培育。

本研究對中黃13進行不同光照度處理，記錄其表型性狀，并對其進行轉錄組測序分析，挖掘關鍵差異表達基因，探究強光調控大豆生長發育及適應性的分子機制，旨在為縮短植物生長周期及快速培育優良作物品種提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 試驗材料及大豆植株處理

供試大豆品種中黃13購自壽光市海洪種子經營中心。將中黃13種子點播于32孔穴盤中，每孔 2～3粒，分別放置在正常光照度［200 μmol/（m2·s）］及強光下［1 000 μmol/（m2·s）］進行育苗，其他培養條件均保持一致（光—暗周期為12 h—12 h，28 ℃）。待出苗后，選取長勢較為一致的單株（處理、對照各40株）移栽至9 cm×9 cm的方盒中繼續培養，其中30株用于表型觀測，10株用于取樣測序。

1.2 試驗時間和地點

試驗于2023年2月16日在中國農業科學院深圳農業基因組研究所進行。

1.3 轉錄組測序

于移栽后18 d分別對2組大豆葉片進行取樣，送至北京貝瑞和康生物技術有限公司進行葉片總RNA提取、質量檢查及cDNA文庫構建，并采用Illumina NovaSeq測序平臺進行轉錄組測序。

1.4 轉錄組數據分析

轉錄組分析流程如下：采用fastp（htftps：//github.com/OpenGene/fastp）對原始數據進行質控，HISAT2軟件（https：//daehwankimlab.github.io/hisat2）將clean reads比對至參考基因組Gmax_ZH13_v2.0（https：//ngdc.cncb.ac.cn/search/？dbId=gwhamp;q=GWHAAEV00000000.1amp;page=1），featureCount（https：//subread.sourceforge.net）統計比對到每個基因的reads數，根據FPKM（fragments Per Kilobase of exon model per Million mapped fragments）的計算公式標準化每個基因在每個樣本中的表達量。

1.5 差異表達基因的篩選

差異表達基因（DEG）篩選使用DEseq2（https：//bioconductor.org/packages/release/bioc/html/DESeq2.html）進行（|log2FC|＞１，FDRlt;0.05其中FC即fold change，表示差異表達倍數），使用R語言、TBtools、PhotoShop軟件對上述數據分析結果進行可視化分析［12］。

使用NCBI-Blast（https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）比對中黃13與Williams 82蛋白質序列，序列相似度大于80%時鑒定為同源基因，得到中黃13差異表達基因。

1.6 差異表達基因qRT-RCR驗證

選取10個關鍵差異表達基因進行實時熒光定量PCR（qRT-PCR）驗證，利用Primer 5軟件設計定量引物，引物序列見表1。使用南京諾唯贊生物科技股份有限公司反轉試劑盒對測序公司返樣RNA進行反轉錄；熒光定量試劑為TOYOBO SYBR GreenⅠ，qRT-PCR程序：95" ℃預變性1 min；95 ℃變性15 s，55 ℃退火15 s，72 ℃延伸45 s，39個循環；內參基因選用Actin11［13］；設置3次生物學重復，3次技術重復，使用2-ΔΔCT法計算相對表達量。

2 結果與分析

2.1 強光處理下中黃13表型

如圖1所示，強光處理下，中黃13生長發育至成熟進程明顯加快，生命周期縮短，其中到達3葉期（V1）階段的平均時間為9 d，第21天開始開第1朵花（R1），第29天莢果開始發育（R3），達到成熟（R7）的最快時間為76 d，相較對照組各階段分別提前6、23、21、28 d（圖2-a），其中開花時間、成熟時間與對照組相比有顯著差異（圖2-b），生命周期明顯縮短。其他表型性狀相關測定結果如表2所示。強光下生長的大豆雖然植株變矮（圖1-e），但產量與對照并無明顯差異。

2.2 中黃13響應強光轉錄組分析

2.2.1 測序數據處理

取對照組和強光處理組三葉期葉片各3個樣品進行轉錄組測序，將原始測序數據進行過濾得到干凈序列（clean reads）。對每個樣本的reads數、堿基數目、Q20、Q30及HISAT2比對率進行統計，結果（表3）顯示，整體測序數據質量良好，可用于后續分析。

2.2.2 差異表達基因鑒定及富集分析

本研究共鑒定出8 520個差異表達基因，其中有2 915個基因上調表達，5 605個基因下調表達（圖3）。

GO注釋分析結果顯示，差異表達基因主要富集在葉綠體、類囊體中的光合作用系統上以及植物適應光脅迫的光保護機制上，如光捕獲，脫氫酶、氧化還原酶、蛋白質激酶活性的調節，對紫外線（UV）的反應等（圖4）。KEGG富集分析結果顯示，差異表達基因主要富集在碳水化合物代謝、能量代謝、激素信號傳導、環境適應相關通路上（圖5）。

2.2.3 強光下光系統相關通路富集

強光會導致植物光系統Ⅰ（PSⅠ）和光系統Ⅱ（PSⅡ）能量分配比例失衡，觸發植物多種光保護機制［14］，其中保護酶會清除葉綠體產生的過量活性氧（ROS），減輕植物體內氧化損傷。轉錄組分析（圖6）發現，中黃13在強光處理下，1個脫氫酶基因ndhB表達量上調和1個還原性輔酶Ⅱ（NADPH）硫氧還蛋白還原酶NTRC基因表達量下調［15-16］。此外，葉綠體活動相關基因，如捕光復合物葉綠素a/b結合蛋白基因LHCB1-6、葡萄糖激酶基因GLK1在強光下表達量均下調，而參與葉綠素的合成、葉綠體發育等活動的細胞分裂素反應因子CGA1的表達量顯著上調，說明大豆可通過在轉錄水平調控相應基因的表達而適應光強變化。

2.2.4 植物激素信號轉導通路與提前成熟

光照可以控制激素合成途徑或激活激素誘導下游的調控通路［17］。在光照誘導下，赤霉素（GA）途徑上的赤霉素合成抑制因子GA2ox基因表達量下調［18］，其上游基因STF1表達量呈現上調趨勢［19］，下游基因DELLA表達量下調，而參與調控葉片衰老［20］的DELLA基因負調控轉錄因子WRKY6表達量顯著上調，且經過qPCR驗證發現，其表達量呈現多倍差異（圖7-f）；生長素途徑中由一些SAGs（senescence-associated genes）編碼的SAUR36也呈現表達量上調趨勢［21］；此外蕓苔素內脂基因BZR1表達量下調［22］。這些激素信號通路中基因的表達變化可能與強光下大豆提前進入衰老及種子成熟階段有關。

2.2.5 光周期途徑基因差異表達與開花表型

光周期途徑是調控植物開花和成熟的主要途徑之一，包括光信號的接收、傳遞及反應3個部分，筆者所在課題組研究發現，在強光條件下光周期途徑上關鍵基因呈現出差異表達現象。HY5基因在強光下表達量上調，植物成花和生物鐘節律關鍵因子GmGI、GmLUX1、GmCOL1a及新型多效性基因TOE4b在強光下表達量明顯下調［23-26］。以上基因表達的差異可能與強光下中黃13提前開花有關。

2.3 表型關聯的差異表達基因qRT-PCR驗證

對“2.2”節中的差異表達基因進行可視化聚類分析（圖6），并從相關通路中選取10個差異表達基因進行qRT-PCR驗證，其中9個基因與轉錄組分析結果一致，1個基因相反，準確率為90%，證明轉錄組分析結果具有可靠性。圖4和圖7-a、圖7-b、圖7-c揭示，大豆在強光環境下會引起葉片內光系統基因的差異表達；與此同時，KEGG富集分析結果表明，植物激素信號傳導途徑上的相關基因表達量存在顯著差異（圖5，圖7-d、圖7-e、圖7-f）。前人研究表明，這些激素信號通路參與調控植物開花及葉片衰老，可能與大豆在強光下提前開花、成熟，生命周期縮短有關；此外，一些光周期途徑上的基因雖不在GO、 KEGG分析顯著富集范圍內，但是它們也存在表達差異（圖7-g、圖7-h、圖7-i、圖7-j）。

3 討論與結論

本研究中強光下大豆生長至收獲的時間基本與前人的研究結果［6］一致。本研究進一步表明， 適度強光會引起大豆光系統發生一系列反應，可能導致生物量積累速度產生差異，生物量積累到達閾值后，在植物激素的參與下， 大豆提前衰老，從而大大縮短生命周期。本研究挖掘到的差異表達基因信息可為后續基因功能驗證提供參考，且可結合幼胚離體培養、分子標記輔助選擇等生物技術手段進一步縮短育種年限，解決育種周期長、優良品種更新慢等種業面臨的問題［27-28］。

為應對強光，植物進化出有效的光保護系統。在中黃13轉錄組分析富集結果中，光系統途徑上關鍵基因的表達表現出對強光的響應。已有研究證明，在強光下，煙草ndhB突變體更易積累過多活性氧［29］，而光合系統中的捕光復合體LHCB1可以捕獲光能，并將多余的光能轉化為熱量，以此保護植物免受光損傷［30］，對于平衡PSⅠ和PSⅡ及碳固定具有重要作用；轉錄因子GLKs可調控葉綠體的發育及分化，有助于整合光合效率并提升作物產量［31］。研究表明，強光下大豆可通過清除過多ROS、減少光的吸收、耗散多余光能及改變系統轉錄組和代謝組等途徑來適應強光，保護自身生長、存活及繁殖。

光照、葉綠體和植物激素之間存在密切聯系。光照可觸發植物激素信號傳導，植物激素可以調節葉綠體的發育及豐度［32］。受強光誘導的植物激素信號傳導途徑主要包括油菜素內酯（BRs）、細胞分裂素（CKs）、生長素和赤霉素（GA）途徑等。在關鍵基因的篩選中，與對照相比，BZR1、STF1、GA2ox7a、DELLA等在強光下都存在表達差異。

此外，在強光下中黃13表現出提前開花、成熟現象。植物開花途徑包括光周期途徑、春化途徑、自主調節途徑及赤霉素途徑。在光周期途徑中，GI基因調控植物的生物鐘節律及開花；敲除GmLUX1、GmLUX2基因會導致大豆的極度晚花；TOE4b基因直接抑制大豆成花素基因FT2a和FT5a的轉錄，使大豆延遲開花［23-26］。植物激素同時也是植物成花轉變的重要因素。赤霉素途徑中的DELLA蛋白被認為是開花位點FT的負調控因子［33］。以上關鍵基因在強光下的表達變化均符合大豆提前開花的趨勢，表明中黃13在強光下可通過光信號與激素的協同作用調控開花。特別地，HY5基因在光保護及開花中都具有重要作用。HY5在強光下可以通過結合花色素MYB75，刺激花青素的合成，促進ROS的清除［34］，并且HY5也可以與藍光/UV-B受體CRY1協同參與植物光形態建成［35］。

最后，植物激素與環境共同調控植物成熟及葉片衰老，其中涉及WRKYs類轉錄因子的表達調控，如WRKY6在赤霉素途徑中受到DELLA蛋白的負調控［20］，并在生長素調控途徑中，可以直接結合一部分SAGs正向調控葉片衰老，在經歷強光時，葉片衰老速度加快，以減少地上葉片生物量，使得植物順利繁殖［21］。

綜上，通過對強光下栽培大豆品種中黃13表型及轉錄組進行測序分析，挖掘到植物響應強光并調控其開花及成熟的關鍵差異表達基因，為進一步研究大豆強光適應性分子機制、縮短育種周期、加快培育優質大豆品種提供理論支持。

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