洛陽地區煙株內生放線菌的分離鑒定及其生物學功能測定

摘要：為明確洛陽地區煙株內生放線菌的種類及其生物學功能，采用稀釋涂布平板法分離健康煙株內生放線菌，通過形態學觀察、生理生化測定并結合16S rDNA序列分析鑒定其種類；采用平板對峙法、菌絲生長速率法測定內生放線菌株對煙草疫霉的拮抗作用；采用紫外分光光度計法測定菌株產IAA含量。結果表明，從健康煙株體內共分離獲得10株內生放線菌，菌株LBY2、LBY3、LTJ4、LTG2、SG4為淀粉酶鏈霉菌（Streptomyces diastaticus），菌株SG3、RG4、LTJ5、LBY4為嗜熱一氧化碳鏈霉菌（S. thermocarboxydus），菌株RG3為婁徹氏鏈霉菌（S. rochei）。淀粉酶鏈霉菌與婁徹氏鏈霉菌對煙草疫霉菌的抑制率均達到50%以上；所有菌株均可產生吲哚乙酸，其中婁徹氏鏈霉菌發酵液中吲哚乙酸含量高達20.43 mg/L。由此說明洛陽地區煙株內生放線菌主要為淀粉酶鏈霉菌、婁徹氏鏈霉菌與嗜熱一氧化碳鏈霉菌，其中淀粉酶鏈霉菌與婁徹氏鏈霉菌對煙草疫霉菌菌絲生長具有較強的抑制作用與產吲哚乙酸功能。

關鍵詞：煙草；內生放線菌；形態學；生理生化；分子生物學；拮抗作用；促生作用；洛陽地區

中圖分類號：S572.01；S182" 文獻標志碼：A

文章編號：1002-1302（2024）13-0126-05

煙株內生放線菌廣泛分布于煙草不同生長時期的各組織器官中，具有豐富的生物多樣性［1］。近年來的研究表明，煙草內生菌能夠與宿主協同進化，產生能抑制病原菌菌絲生長［2-4］、促進植物生長等的次級代謝產物［5-7］，內生菌生物學功能研究已成為該領域的熱點之一［8-9］。Conn等首次報道了內生放線菌具有誘導植物產生抗病性的功能［10］；Liotti等從巴西香可可體內分離鑒定了能抑制尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）與灰霉病菌（Botrytis cinerea）生長的灰色鏈霉菌（Streptomyces griseus）R132，抑制率達到46.7%與73.9%［11］；陳紅兵等從辣椒體內分離鑒定了對黃瓜灰霉病菌（B. cinerea）有較強抑制作用的婁徹氏鏈霉菌（S. rochei）Lj20菌株［12］；王靖從白菜與油菜等材料中分離鑒定了能夠抑制白菜和油菜根腫病菌（Plasuwdiophora brassicae）生長的灰紅鏈霉菌（S.griseoruber）A310與灰褐類鏈霉菌（Streptomyces sp.）A10［13］；李慶蒙等從江西廬山珙桐樹中分離鑒定了對煙草疫霉（Phytophthora parasitica var.nicotianae）、稻瘟病菌（Magnaporthe oryzae）等植物病原真菌抑制率高達90%以上的奈良鏈霉菌（S. naraensis）［14］。因此，本研究對洛陽地區煙株內生放線菌分離鑒定及其生物學功能測定的結果，為內生放線菌資源在生物防治方面的開發利用提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試植物：烤煙（Nicotiana tabacum）品種LY1306。

供試病原菌：煙草疫霉（P. parasitica var.nicotianae），保存于河南科技大學植物病害分子鑒定與綠色防控實驗室。

供試培養基：參照陳奇園等分離煙株根圍拮抗放線菌所用的培養基［15］。

1.2 煙株內生放線菌的分離純化

1.2.1 樣品采集及處理

2021年在河南省洛陽市洛寧、宜陽、汝陽等縣的煙田于煙草團棵期、旺長期、成熟期（6—8月）采用五點取樣法或隨機取樣法選取健康煙株，帶回實驗室，參照陳華紅等的方法［16］對樣品進行預處理。

1.2.2 煙株內生放線菌的分離及純化

每一煙株分根、莖、葉3個部分，每一部分再分上、中、下3個部位取樣，每一部分稱取樣品5 g，經3%次氯酸鈉、70%無水乙醇消毒處理后并用無菌水沖洗［17］，留取最后一次沖洗水涂布平板作對照試驗；采用稀釋平板涂布法［18］分離內生放線菌，純化培養直至長出單一菌落，于4 ℃冰箱中保存。

1.3 煙株內生放線菌的鑒定

1.3.1 內生放線菌的培養特征及形態學觀察

參照《鏈霉菌鑒定手冊》［19］，采用插片法［20］、革蘭氏染色法在100倍油鏡下觀察內生菌株菌絲體有無隔膜、孢子鏈、孢子的形態特征。

1.3.2 生理生化特征鑒定

參照《放線菌分類鑒定》［21］與《植病研究法》［22］進行放線菌生理生化指標測定試驗，觀察生理生化特征。

1.3.3 煙株內生放線菌的16S rDNA序列分析

使用南京諾唯贊生物科技股份有限公司細菌基因組DNA抽提試劑盒進行菌株總DNA的抽提，通用引物27F和1492R對提取的DNA模板進行PCR擴增；由生工生物工程（上海）股份有限公司對PCR產物進行測序。序列提交GenBank數據庫后，選取GenBank比對同源性高的序列，利用MEGA 6軟件鄰接法構建進化樹，將測序菌株的16S rDNA序列提交至NCBI獲得登錄號。

1.4 煙株內生放線菌的生物學功能測定

1.4.1 煙株內生放線菌的抑菌功能

通過改良的平板對峙培養法［23］篩選對煙草疫霉菌絲生長具有拮抗作用的內生放線菌菌株；用菌絲生長速率法［24］測定菌株發酵液對煙草疫霉的抑制作用；參照丁玥琪的拮抗微生物相互作用的評價標準［25］，篩選出抑菌率gt;50%的菌株。

1.4.2 煙株內生放線菌產IAA功能

1.4.2.1 菌株發酵液的制備 參照湯玲玲的方法［26］制備放線菌菌株發酵液。

1.4.2.2 菌株發酵液中IAA的測量

（1）IAA標準曲線的制作。參照Defe等的IAA濃度檢測方法［27］，制備不同濃度梯度IAA溶液，吸取2.0 mL IAA標準溶液與2.0 mL的Salksowski比色液（1 mL 0.5 mol/L FeCl3與50 mL 35% HClO4混合［28］）混合，使用紫外分光光度計法測定吸光度值，橫坐標設置為IAA濃度、縱坐標設置為吸光度值繪制標準曲線。（2）IAA定性檢測與定量檢測。

參照張燁等的方法［29］，進行IAA定性檢測與定量檢測。

2 結果與分析

2.1 煙株內生放線菌的分離及純化

從洛寧（L）、嵩縣（S）、汝陽（R）3個煙區所采集的煙株樣品根（G）、莖（J）、葉（Y）中共分離純化內生放線菌菌株10株，其中洛寧縣煙區采集樣品根部分離1株，莖部分離2株，葉部分離3株，小計6株；嵩縣煙區采集樣品根部分離2株；汝陽縣煙區采集樣品根部分離2株。

2.2 煙株內生放線菌的鑒定

2.2.1 形態及培養特征觀察

在普通光學顯微鏡100倍油鏡觀察下，菌株LBY2、LBY3、LTJ4、LTG2、SG4孢子絲彎曲，孢子為圓柱形；菌株SG3、RG4、RG3、LBY4孢子絲呈螺旋形，孢子為桿狀；菌株LTJ5孢子絲呈直形，孢子為桿狀（圖1）。

2.2.2 生理生化特征

對10株內生放線菌菌株進行生理生化特征測定，結果（表1）顯示，10株內生放線菌菌株均可利用葡萄糖、麥芽糖、棉籽糖等碳源；纖維素水解均為陽性即可利用葡萄糖、麥芽糖、棉籽糖等碳源；而硫化氫與黑色素的產生均為陰性，說明無硫化氫與黑色素產生。

2.2.3 16SrDNA序列分析

將10株內生放線菌LBY2、LBY3、LTJ4、LTG2、RG4、LBY4、LTJ5、SG3、SG4、RG3的16S rDNA序列提交至NCBI，分別獲得OR186289、OR186291、OR186292、OR186290、OR186285、OR186283、OR186284、OR186288、OR186293、OR195348的登錄號，通過BLAST比對菌株的16S rDNA序列得到的對比結果顯示，結果表明，菌株LBY2、LBY3、LTJ4、LTG2、SG4與淀粉酶鏈霉菌（MZ389928）等序列同源性大于97%，菌株RG4、LTJ5、LBY4、SG3與嗜熱一氧化碳鏈霉菌（AB894408）等序列同源性大于97%，菌株RG3與婁徹氏鏈霉菌（MN795132）等序列同源性達99%。在MEGA 6.0軟件上采用鄰接法進行系統發育樹的構建（圖2）。

2.3 煙株內生放線菌的生物學功能

2.3.1 對煙草疫霉的拮抗作用

采用平板對峙法測定LBY2、LBY3、LTJ4與RG3菌株對煙草疫霉菌菌絲生長的抑制率，均在50%以上（表2）。采用菌絲生長速率法測定LBY3、LBY2、LTJ4、RG3菌株的發酵液對煙草疫霉菌菌絲生長的抑菌率，仍在50%以上，抑制等級為Ⅳ級。RG4、SG3、LTJ5、LBY4、LTG2、SG4菌株的發酵液對煙草疫霉菌絲的抑菌率較低，抑制等級為Ⅲ級（表3）。

2.3.2 產IAA的能力

2.3.2.1 IAA標準曲線 以吸光度值D535 nm為縱坐標（y）、IAA的濃度為橫坐標（x）繪制標準曲線，得到線性回歸方程y=0.013 7x-0.121 8，r2=0.997 1。

2.3.2.2 菌株發酵液IAA定性與定量測定 采用Salkowski比色試驗，10株內生放線菌發酵液顯色反應均為粉紅色，說明菌株在代謝過程中均能夠產生吲哚乙酸（IAA）。根據標準曲線計算菌株發酵液中IAA含量，測量2次求均值。菌株LBY2發酵液中IAA的含量為19.87 mg/L，菌株LBY3發酵液中IAA的含量為12.47 mg/L，菌株LTJ4發酵液中IAA的含量為19.04 mg/L，菌株RG3發酵液中IAA的含量為20.43 mg/L，菌株LTJ5發酵液中IAA含量為12.73 mg/L，菌株RG4發酵液中IAA含量為12.91 mg/L，菌株LTG2發酵液中IAA含量為 12.21 mg/L，菌株LBY4中發酵液中IAA含量為 13.02 mg/L，菌株SG3發酵液中IAA含量為 13.68 mg/L，菌株SG4發酵液中IAA含量為 11.37 mg/L（表4）。

3 討論

內生放線菌通過產生拮抗植物病原菌活性的抑菌物質［30］或通過與病原菌進行營養物質的爭奪、破壞其生長環境等進而使病原菌死亡。Li等報道淀粉酶鏈霉菌對大麗輪枝菌（Verticilliumd ahliae Kleb.）與硫色鐮刀菌（F. sulphureum）有較強的抑制效果［31］。熊瑤瑤等報道婁徹氏鏈霉菌FR02菌株對禾谷鐮孢菌（F.graminearum）、水稻紋枯病菌（Thanatephorus cucumeris）、車前草核盤菌（Sclerotinia sclerotiorum）與膠胞炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides）的抑制率分別為70%、45%、58%和65%［32］；Zhang等報道婁徹氏鏈霉菌A-1菌株能抑制由蘋果輪紋病菌（Botryosphaeria dothidea）引起的蘋果果實腐爛問題［33］；馬林等報道婁徹氏鏈霉菌Lj20菌株對油菜菌核病（S.sclerotiorum）、番茄灰霉病菌（B. cinerea）與番茄早疫病菌（Alternaria solani）的抑制率分別達88.2%、60.0%與53.2%［34］。本研究從洛陽地區煙株中分離鑒定的淀粉酶鏈霉菌和婁徹氏鏈霉菌對煙草疫霉的抑制率均達50%以上，與前人的研究結果相一致。

內生放線菌通過產生或者能夠促進寄主植物產生植物激素來促進植物生長［30］。魏曉麗報道淀粉酶鏈霉菌無菌發酵液的多個稀釋梯度對棉花胚根和胚軸生長均具有促進作用［35］；李威等報道婁徹氏鏈霉菌XL-6菌株的無菌發酵液能顯著提高茄子種子發芽率、葉片葉綠素含量及根系活力，增加植株鮮重［36］；路來風等報道嗜熱一氧化碳鏈霉菌Fs-1菌株對玉米、小麥和番茄生長均具有促進作用［37］。本研究測定解淀粉霉鏈霉菌菌株LBY2、LBY3、LTJ4發酵液中IAA含量分別為19.87、12.47、19.04 mg/L，婁徹氏鏈霉菌菌株RG3發酵液中IAA的含量達20.43 mg/L，為解釋內生放線菌對煙株的促生作用提供了理論基礎。

4 結論

從洛陽地區煙株體內分離獲得的10株內生放線菌，結合形態學特征、16S rDNA序列分析結果及生理生化特征指標，菌株LBY2、LBY3、LTJ4、LTG2、SG4被鑒定為淀粉酶鏈霉菌（S.diastaticus），菌株RG3鑒定為婁徹氏鏈霉菌（S. rochei），菌株SG3、RG4、LTJ5、LBY4鑒定為嗜熱一氧化碳鏈霉菌（S. thermocarboxydus）。其中，解淀粉霉鏈霉菌LBY2、LBY3、LTJ4菌株發酵液對煙草疫霉菌絲生長的抑菌率為52.36%、53.47%、51.18%，發酵液中IAA含量分別為19.87、12.47、19.04 mg/L；婁徹氏鏈霉菌RG3的菌株發酵液對煙草疫霉菌絲生長的抑菌率為50.16%，發酵液中IAA含量為20.43 mg/L，且在煙草黑脛病生物防治方面的研究中，首次報道淀粉酶鏈霉菌對煙草疫霉具有較好拮抗作用。

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